王檬，張潔，趙繼義

酒精性心肌?。ˋCM）指長(zhǎng)期大量飲酒導(dǎo)致左心室擴(kuò)張，左室收縮功能進(jìn)行性受損的一種繼發(fā)性心肌病，若不徹底戒酒及早期藥物干預(yù)，最終發(fā)展為難治性心律失常和頑固性心力衰竭[1-3]。大量研究發(fā)現(xiàn)酒精攝入可引起心肌細(xì)胞凋亡[4-6]。細(xì)胞凋亡是在多種生理性或病理性刺激下，為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活啟動(dòng)細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞的程序化死亡。糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）的激活促進(jìn)線粒體途徑誘導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡[7]，進(jìn)而激活半胱天冬蛋白酶-9（caspase-9）及下游半胱天冬蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。鈣激活中性蛋白酶（Calpain）的激活可片段化GSK-3β并使其活性升高[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)酒精灌胃法建立早期大鼠酒精性心肌病模型，一方面檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平，另一方面給予鈣激活中性蛋白酶-1（Calpain-1）的特異抑制劑（ALLN），探討特異性的抑制鈣激活中性蛋白酶（Calpain）能否通過(guò)干預(yù)Calpain/GSK-3β信號(hào)通路降低酒精致大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象健康雄性Wistar大鼠100只（體重220±20 g，清潔級(jí)），由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ACM大鼠造模100只雄性wistar大鼠隨機(jī)分為四組：生理鹽水對(duì)照組（n=10）、酒精組（n=30）、酒精+Calpain-1抑制劑（ALLN）組（n=30）、酒精+二甲基亞砜溶劑（DMSO）組（n=30）。采用酒精灌胃+自由飲用方法造模。第1周10%酒精自由飲用，60%酒精5 ml/kg·d灌胃1次；第2周10%酒精自由飲用，60%酒精10 ml/kg·d灌胃2次；第3～16周20%酒精自由飲用，60%酒精15 ml/kg·d灌胃2次。酒精+ALLN 組與酒精+DMSO 組在第15周酒精灌胃前15 min分別給予腹腔注射Calpain 1抑制劑ALLN 1 ml/kg·d（溶于1% DMSO 0.3 ml）及1% DMSO 0.3 ml至第16周末進(jìn)行檢測(cè)。正常組相同時(shí)間、相同劑量生理鹽水灌胃，普通顆粒食料無(wú)差別給予。

1.2.2 心臟彩超檢查用10%水合氯醛以3 ml/kg對(duì)大鼠行腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，剃凈大鼠胸毛。使用GE心臟超聲診斷儀，采用頻率為10 MHz探頭，軀體左傾30°，探頭至于胸骨左側(cè)，與胸骨中線呈10°～30°。顯示胸骨旁左室長(zhǎng)軸、心尖四腔切面聲像圖，觀察心室腔的內(nèi)膜面是否清晰。由心內(nèi)科專(zhuān)業(yè)超生醫(yī)師檢測(cè)大鼠心臟結(jié)構(gòu)。測(cè)定指標(biāo)：左室舒張末期內(nèi)徑（LVDD）、左室后壁舒張末期厚度（LVPWD）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）。每一超聲測(cè)定值取三個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期測(cè)量的平均值。

1.2.3 組織標(biāo)本采集取大鼠心肌組織，4%中性甲醛中固定24 h，按常規(guī)石蠟包埋后，各組織塊做連續(xù)切片（厚度5 μm），行蘇木素-伊紅（HE）染色。戊二醛固定組織用于電鏡檢查。剩余組織立即置于-80 ℃冰箱凍存。

1.2.4 組織化學(xué)檢測(cè)大鼠心肌組織常規(guī)脫水石蠟包埋切片（厚度4 μm）HE染色觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。CD31免疫組化染色（SP法）進(jìn)行微血管標(biāo)記染色?！?00視野下觀察微血管密度。

1.2.5 電鏡觀察各組大鼠心肌細(xì)胞的變化心肌組織依次于2.5%戊二醛、1%鋨酸中固定后，梯度濃度酒精處理，預(yù)制包埋塊，超薄切片機(jī)將其切成70～90 nm超薄切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。

1.2.6 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡心肌組織石蠟包埋后切片，厚度為4 μm，二甲苯中脫蠟2次，每次10 min，濃度梯度酒精處理，滴加20 pg/ml不含DNA酶的蛋白酶K，常溫作用30 min，PBS洗滌后加TUNEL檢測(cè)液，37 ℃度孵育60 min，加入抗熒光淬滅劑，熒光顯微鏡下觀察并分析。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)非重疊400倍陽(yáng)性視野，計(jì)數(shù)凋亡心肌細(xì)胞數(shù)及心肌細(xì)胞總數(shù)，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡心肌細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.7 Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞樣品中的蛋白蛋白提?。河煤鞍酌敢种苿┑腞IPA蛋白裂解液抽提組織蛋白，BCA法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線定量蛋白濃度并稀釋配平。Western Blot檢測(cè)：SDS-PAGE電泳法（10%分離膠、5%濃縮膠）分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，Calpain-1抗體（1:400，美國(guó)Santa Cruz公司）、GSK-3β抗體（1:400，美國(guó)Santa Cruz公司）、Caspase-9抗體（1:400、美國(guó)Santa Cruz公司）、激活型Caspase-3抗體（1:400，美國(guó)Santa Cruz公司）、β-actin（1:2000 ，美國(guó)Santa Cruz公司），4℃冰箱過(guò)夜，二抗孵育1 h后顯影，實(shí)驗(yàn)重復(fù)四次，應(yīng)用Quanty 1軟件進(jìn)行分析，將目的蛋白與β-actin相比得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組數(shù)據(jù)間均數(shù)比較采用F檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間均數(shù)兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心臟彩超測(cè)定各組大鼠的心臟超聲指標(biāo)左室舒張末期內(nèi)徑（LVDD）、左室后壁舒張末期厚度（LVPWD）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS），比較各組大鼠心臟超聲指標(biāo)的變化。結(jié)果得知：與對(duì)照組相比，酒精組、酒精+ALLN組、酒精+DMSO組大鼠心臟LVDD增大，LVPWD增厚（P＜0.05）。酒精+ALLN組與酒精組相比，LVDD略小，LVPWD相對(duì)稍薄，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。各組大鼠LVEF、LVFS均位于正常范圍之間，無(wú)明顯差異。酒精組與酒精+DMSO組大鼠相比較，LVDD、LVPMD、LVEF、LVFS均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。心臟超聲測(cè)值提示攝入大量酒精可導(dǎo)致大鼠左心腔擴(kuò)大，左室后壁增厚，收縮功能正常，但已出現(xiàn)舒張功能障礙，符合早期酒精性心肌病改變（表1）。

表1 各組大鼠LVDD、LVPWD、LVEF和LVFS值

2.2 HE染色光鏡下觀察各組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變對(duì)照組心肌纖維排列整齊緊密，細(xì)胞膜完整、細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞間隙未見(jiàn)擴(kuò)大，無(wú)明顯的水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。酒精組及酒精+DMSO組顯示心肌纖維排列紊亂，結(jié)構(gòu)消失，心肌細(xì)胞固縮，細(xì)胞間質(zhì)增大水腫，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞滲出。酒精+ALLN組較酒精組減輕明顯，細(xì)胞排列較緊密，有少量炎性細(xì)胞滲出（圖1）。

圖1 各組HE染色（×400）

2.3 電鏡下觀察各組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變對(duì)照組心肌細(xì)胞肌絲排列整齊緊密，無(wú)斷裂， 線粒體結(jié)構(gòu)正常，酒精組及酒精+DMSO組線粒體腫脹、空變，部分線粒體嵴不完整，肌纖維排列紊亂、分離，發(fā)生斷裂，肌溶解。酒精+ALLN組線粒體腫脹、肌纖維排列紊亂程度均較酒精組有所減輕（圖2）。

圖2 透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)（×15 000）

2.4 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡（圖3）。每張切片觀察10個(gè)非重疊400倍陽(yáng)性視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)算心肌細(xì)胞的凋亡率。與對(duì)照組比較，酒精組心肌細(xì)胞凋亡率增加[（61.14±2.84）%vs. （2.24±1.92）%，P＜0.01]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；酒精+ALLN組與對(duì)照組比較有較多的心肌細(xì)胞凋亡[（34.60±3.54）%vs. （2.24±1.92）%，P＜0.01]，但與酒精組比較心肌細(xì)胞凋亡明顯減少[（34.60±3.54）%vs. （61.14±2.84）%，P＜0.01]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 各組的凋亡率

圖3 各組凋亡水平（×200）

2.5 免疫組化檢測(cè)比較各組大鼠心肌組織中Calpain-1、GSK-3β、caspase-9、caspase-3的蛋白表達(dá)量應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件（Image-Pro Plus，version 6.0），計(jì)算結(jié)果用切片中細(xì)胞質(zhì)著色的面積及累計(jì)光密度值來(lái)間接反映蛋白表達(dá)量。與對(duì)照組比較，酒精組Calpain-1、GSK-3β（H-76）、caspase-9、caspase-3的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），酒精+ALLN組與對(duì)照組比較Calpain-1、GSK-3β（H-76）、caspase-9、caspase-3的表達(dá)也有升高（P＜0.05），但與酒精組比較其表達(dá)明顯減少（P＜0.05），酒精組與酒精+DMSO組比較Calpain-1、GSK-3β（H-76）、caspase-9、caspase-3的表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05），（圖4～8）。

圖4 Calpain-1 免疫組化（×400）

2.6 Westorn blot檢測(cè)比較各組大鼠心肌組織中Calpain-1、GSK-3β、caspase-9、caspase-3的蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較，酒精組Calpain-1、GSK-3β（H-76）、caspase-9 p10、caspase-3 p17蛋白表達(dá)水平上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。酒精組+ALLN組與酒精組比較Calpain-1、GSK-3β（H-76）、caspase-9 p10、caspase-3 p17蛋白表達(dá)水平下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。酒精組與酒精+DMSO組比較各蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P＞0.05），（圖9～10）。

圖9 Calpain-1、GSK-3β（H-76）、caspase-9 p10、caspase-3 p17在各組的表達(dá)情況

圖5 GSK-3β（H-76） 免疫組化（×400）

圖6 caspase-9 p10 免疫組化（×400）

圖7 激活型caspase-3 免疫組化（×400）

3 討論

ACM是酒精誘導(dǎo)的心臟損傷最常見(jiàn)的形式。ACM導(dǎo)致心肌收縮力和心腔擴(kuò)張的逐漸降低，心肌細(xì)胞在受到缺血、缺氧、壓力超負(fù)荷、線粒體毒素等刺激下，可出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡，長(zhǎng)期而持續(xù)的凋亡導(dǎo)致心室重構(gòu)，進(jìn)而發(fā)展為心力衰竭[8]。在酒精誘導(dǎo)的心臟損傷過(guò)程中，研究人員發(fā)現(xiàn)酒精在多個(gè)位點(diǎn)（膜、受體、線粒體、核糖體、肌膜、DNA或細(xì)胞骨架）對(duì)心肌細(xì)胞施加有害影響[9-11]。新策略旨在控制細(xì)胞凋亡和病理性心臟重構(gòu)[12]。

圖8 Calpain-1、GSK-3β（H-76）、caspase-9 p10、caspase-3 p17在各組的相對(duì)表達(dá)量

圖10 Calpain-1、GSK-3β（H-76）、caspase-9 p10、caspase-3 p17在各組的相對(duì)表達(dá)量

細(xì)胞凋亡是在多種生理性或病理性刺激下，為維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，通過(guò)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活啟動(dòng)細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的程序化死亡。研究發(fā)現(xiàn)酒精攝入可引起細(xì)胞死亡[8,13,14]。研究結(jié)果顯示酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的大鼠心肌組織中caspase-9 p10、caspase-3 p17凋亡相關(guān)蛋白水平明顯升高，說(shuō)明大量酒精攝入可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

GSK-3是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛表達(dá)于多種真核細(xì)胞中。GSK-3β是眾多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的交叉匯點(diǎn)，其活性必然受到極其復(fù)雜且精細(xì)的調(diào)節(jié)[15]。GSK-3β的激活促進(jìn)線粒體途徑誘導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡[16,17]。由此推斷，GSK-3β的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制GSK-3β的活性，有可能保護(hù)組織器官。

Calpain是一類(lèi)鈣離子依賴性的半胱氨酸蛋白激酶家族,參與調(diào)解細(xì)胞的多種生理過(guò)程，如細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架和細(xì)胞膜的構(gòu)型重建等。Calpain激活可降解心房肌的收縮和結(jié)構(gòu)蛋白參與心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)[18]，Calpain抑制劑可明顯減輕細(xì)胞凋亡[19]。本研究顯示，酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的大鼠心肌組織中Calpain-1、GSK-3β表達(dá)顯著升高，提示酒精誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡可能與Calpain-1、GSK-3β的促凋亡有關(guān)。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)關(guān)于GSK-3β活性調(diào)解的一種新機(jī)制。Calpain的激活可片段化GSK-3β并使其活性升高Calpain還可使GSK-3β的C末端分解為幾個(gè)片段，導(dǎo)致活性升高[7,20]。本研究通過(guò)Calpain抑制劑作用于酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的大鼠心肌組織，觀察到心肌細(xì)胞凋亡顯著減少。我們提出假設(shè)：Calpain切割掉具有活性抑制的磷酸化位點(diǎn)，更好地改善酒精誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。但Calpain如何切割截?cái)郍SK-3β，其分子機(jī)制目前仍不清楚，進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠酒精性心肌病模型，探討Calpain抑制劑能否通過(guò)干預(yù)Calpain/GSK-3β信號(hào)通路降低酒精致大鼠心肌細(xì)胞凋亡。結(jié)果提示Calapin-1抑制劑具有降低酒精誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，其機(jī)制可能與Calpain 對(duì)GSK-3β的片段化導(dǎo)致其活性增高，上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。