張宇陽，周 雪，劉靈藝，許吳俊，任旭琴，王廣龍，熊愛生

（1淮陰工學院生命科學與食品工程學院，江蘇淮安 223003；2淮陰工學院應(yīng)用技術(shù)學院，江蘇淮安 223003；3南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，南京 210095）

0 引言

植物受到病原菌侵染時，會引發(fā)一系列復雜的防御反應(yīng)，提高自身的抗性。幾丁質(zhì)酶是最早被鑒定的一類病程相關(guān)蛋白，在植物、細菌、真菌等生物體中廣泛存在[1-3]。其主要通過降解菌類細胞壁或蟲類外骨骼角質(zhì)層上的幾丁質(zhì)，破壞其生長發(fā)育并影響繁殖能力，達到防治的目的[4]。

幾丁質(zhì)酶在植物抗菌和抗蟲過程中具有重要作用，且在農(nóng)業(yè)病害防治中得到了應(yīng)用。將杜仲EuCHIT1基因轉(zhuǎn)入番茄，提高了幾丁質(zhì)酶活性和對灰霉病的抗性[5]。類似地，水稻中轉(zhuǎn)入苦瓜幾丁質(zhì)酶基因McCHIT1降低了紋枯病病害指數(shù)[6]。由于昆蟲外骨骼角質(zhì)層中含有大量幾丁質(zhì)，研究人員認為可利用幾丁質(zhì)酶基因創(chuàng)制抗蟲植物材料，并驗證了這一推論。用含有煙草天蛾幾丁質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)基因煙草喂養(yǎng)煙芽夜蛾幼蟲，發(fā)現(xiàn)煙芽夜蛾幼蟲取食困難，生長狀況惡化[7]。幾丁質(zhì)酶基因的過量表達導致擬南芥中的幾丁質(zhì)酶、苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶的活性增強，胼胝質(zhì)含量增加，擬南芥植株對桃蚜的抗性提高[8]。

越來越多的研究表明，幾丁質(zhì)酶也參與了植物應(yīng)對環(huán)境脅迫的過程。在興安落葉松中克隆得到1個編碼幾丁質(zhì)酶的基因LgChi2，其受到低溫脅迫的誘導，將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥后，轉(zhuǎn)基因植株對低溫的耐受性增強[9]。在蕓薹屬鑒定的30個幾丁質(zhì)酶基因中，有16個可以響應(yīng)非生物脅迫的誘導[10]。

大蒜(Allium sativum L.)是重要的蔬菜作物，同時也是重要的調(diào)味品，具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和藥用功能[11-12]。然而，大蒜在栽培過程中容易受到鹽漬化的危害，造成產(chǎn)量和經(jīng)濟上的重大損失。因此，通過挖掘抗逆基因，培育耐鹽種質(zhì)資源，是提高大蒜耐鹽性的有效途徑。幾丁質(zhì)酶在抗病以及抗逆等方面的功能為大蒜抗逆育種提供了新的思路和方向，但關(guān)于幾丁質(zhì)酶參與植物應(yīng)對鹽脅迫的報道較少，其是否參與大蒜植株抵御鹽脅迫的過程尚不清楚。本研究以大蒜品種‘蒼山四六瓣’為試材，克隆幾丁質(zhì)酶基因AsCHI1，分析序列特征，并研究其在鹽脅迫條件下的表達特性，以期為大蒜的抗逆栽培和育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和試驗設(shè)計

試驗所用大蒜品種‘蒼山四六瓣’具白色外皮，多為4～6瓣，蒜瓣均勻，質(zhì)地脆，品質(zhì)好。大蒜種植參照之前的方法[13]，具體地，將蒜瓣播種于蛭石和有機質(zhì)混合的基質(zhì)中。20天后將大蒜轉(zhuǎn)移到Hoagland營養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，緩苗7天后分別對大蒜進行0、1、4、12 h的鹽脅迫(200 mmol/L NaCl)處理，每個處理3次重復，分別取大蒜植株葉片、蒜瓣和根用液氮凍樣，并保存在-80℃中。

1.2 大蒜RNA提取及cDNA合成

采用RNAsimple總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取大蒜RNA。利用HiScript QRT SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）將合成的RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。

1.3 AsCHI1基因的克隆

以其他植物已鑒定的幾丁質(zhì)酶基因，比對大蒜‘蒼山四六瓣’轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[14]，檢索并拼接出大蒜AsCHI1基因序列，設(shè)計1對克隆引物AsCHI1-F(5′-ATGAAAACAGTCTTCCTGGTAA-3′)和 AsCHI1-R(5′-TCAAAAATGAGCCTGATTACCACAG-3′)，以“蒼山四六瓣”cDNA為模板進行擴增。反應(yīng)體系為：Green Taq Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）10 μL，ddH2O 7.2 μL，上下游引物各0.4 μL，模板2 μL。PCR反應(yīng)程序設(shè)置：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸50 s，共35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳并回收。將目的基因與pMD19-T載體（大連TaKaRa公司）連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，提取質(zhì)粒并通過PCR鑒定，交由南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.4 序列分析

采用軟件BioXM 2.6將AsCHI1核苷酸序列翻譯為相應(yīng)的氨基酸；利用ProtParam預測分子式、等電點、相對分子質(zhì)量和親/疏水性；利用DNAMAN對大蒜和其他植物的CHI序列進行比對；采用SignalP 5.0預測信號肽；通過SOPMA進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測，采用SWISS-MODEL預測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)；在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得其他各類植物的幾丁質(zhì)酶氨基酸序列進行同源性分析，利用MEGA5構(gòu)建進化樹探討幾丁質(zhì)酶的系統(tǒng)進化關(guān)系并生成圖形。

1.5 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR反應(yīng)在CFX 96 Touch系統(tǒng)（Bio-rad，美國）上進行。以大蒜SAND基因為內(nèi)參基因[15]，與目標基因一起擴增。根據(jù)從大蒜中分離的AsCHI1 cDNA序列，設(shè)計表達引物BD-CHI-F(5′-CCAACAATGCGGTAGCCAAGGA-3′)和 BDCHI-R(5′-GTTCCGAAGCCACCGAATGAGT-3′)。按照ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）的說明進行實時熒光定量PCR，采用 2-ΔΔCt法分析基因相對表達量[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜AsCHI1基因的克隆

以大蒜cDNA為模板，AsCHI1-F和AsCHI1-R為上下游引物進行擴增，得到1個約900 bp的產(chǎn)物（圖1）。測序結(jié)果表明大蒜中克隆得到的幾丁質(zhì)酶基因AsCHI1開放閱讀框全長933 bp，編碼310個氨基酸（圖2），AsCHI1可能的分子式為C1439H2121N391O450S20，分子量為32.74 kDa，理論等電點(pI)為5.64，不穩(wěn)定指數(shù)為29.19，屬于穩(wěn)定蛋白。親/疏水性分析表明，該蛋白屬于親水性蛋白。

圖1 大蒜AsCHI1基因的RT-PCR擴增圖譜

圖2 AsCHI1的核苷酸序列及其預測的氨基酸序列

2.2 大蒜AsCHI1的氨基酸序列及理化性質(zhì)分析

NCBI BLAST結(jié)果顯示，AsCHI1屬于幾丁質(zhì)酶Class Ⅰ類，同時也是糖苷水解酶19家族的成員，并且在氨基酸40～51位點間分布有6個糖類結(jié)合位點（圖3）。酸性氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）占5.81%，堿性氨基酸（賴氨酸、精氨酸和組氨酸）占6.13%。Signal IP 5.0軟件預測該蛋白屬于信號肽蛋白，剪切位點在21～22氨基酸位點之間。

圖3 大蒜AsCHI1氨基酸序列保守域分析

使用DNAMAN對大蒜與麝香百合(Lilium longiflorum,QBZ68892.1)、茶 (Camellia sinensis,XP_028075045.1)、番 茄 (Solanumlycopersicum,XP_004248635.1)、馬 鈴 薯 (Solanumtuberosum,XP_006367375.1)、黃 瓜 (Cucumissativus, XP_004134833.1)、南 瓜 (Cucurbitamoschata, XP_022949792.1)、 西 葫 蘆 (Cucurbitapepo,XP_023544979.1)、玉米(Zea mays,AYK28287.1)、高羊茅(Lolium arundinaceum,ACJ23248.1)、梅(Prunus mume,XP_008241979.1)、蘋 果 (Malusdomestica,NP_001280823.1)和桃(Prunus persica,XP_007202270.1)等12個物種CHI氨基酸序列進行比對，結(jié)果表明，來自大蒜的AsCHI1與同為百合科的麝香百合CHI一致性最高，達到67.82%，與玉米的CHI一致性為64.08%，與黃瓜的一致性最低（圖4）。

圖4 AsCHI1基因推導的氨基酸序列與其他物種CHI序列比對

2.3 大蒜AsCHI1的二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預測

利用SOPMA在線軟件預測AsCHI1的二級結(jié)構(gòu)類型，其中半數(shù)以上是無規(guī)則卷曲，占比51.29%。其次是α螺旋，占25.81%，延伸鏈和β轉(zhuǎn)角較少，分別占15.16%和7.74%（圖5）。

圖5 AsCHI1基因編碼的蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

以夸斯苦木CHI1(ID：6lnr.1.A)三級結(jié)構(gòu)為模板，利用SWISS-MODEL預測AsCHI1的三級結(jié)構(gòu)（圖6），并得到以下數(shù)據(jù)：序列一致性為55.87%，GMQE值為0.74，相似性為47%，覆蓋率為91%，覆蓋區(qū)域在22～310位。

圖6 AsCHI1基因編碼的蛋白三級結(jié)構(gòu)預測

2.4 AsCHI1的系統(tǒng)進化樹分析

利用MEGA5軟件構(gòu)建大蒜幾丁質(zhì)酶AsCHI1與麝香百合、茶和玉米等CHI序列的進化樹。如圖7所示，大蒜與麝香百合(Lilium longiflorum,QBZ68892.1)和茶(Camellia sinensis,XP_028075045.1)處于同一個分支，其次與玉米(Zea mays,AYK28287.1)和高羊茅(Lolium arundinaceum,ACJ23248.1)親緣關(guān)系較近，與茄科、葫蘆科和薔薇科的植物的CHI親緣關(guān)系相對較遠。

圖7 大蒜與其他植物CHI氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹

2.5 AsCHI1基因在鹽脅迫下的表達分析

為了鑒定AsCHI1基因?qū)}脅迫的響應(yīng)情況，采用熒光定量PCR對AsCHI1基因在不同鹽脅迫時間和不同組織間的表達進行了分析（圖8）。非脅迫條件下，AsCHI1基因在蒜瓣、葉、根中均能表達，且在根中表達最高。鹽脅迫改變了AsCHI1基因在各組織中的表達情況，隨著處理時間的延長，蒜瓣中AsCHI1轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，并在處理1和12 h后分別達到最低和最高；在葉中，AsCHI1基因在鹽脅迫處理4 h后升至最高；根中AsCHI1基因的表達趨勢和在蒜瓣中類似，鹽脅迫處理12 h后其基因表達量是對照的2.65倍（圖8）。

圖8 鹽脅迫下AsCHI1基因的表達分析

3 討論

鹽堿、干旱、極端溫度等非生物脅迫嚴重制約作物的生長發(fā)育，不僅影響作物產(chǎn)量，而且很大程度上降低了作物品質(zhì)，最終造成不可逆的經(jīng)濟損失[17-19]。越來越多的研究表明通過轉(zhuǎn)入抗逆基因可提高作物的抗性，改善作物在逆境條件下的生長狀況。本研究從大蒜中分離到一個編碼幾丁質(zhì)酶的基因AsCHI1，發(fā)現(xiàn)其可以響應(yīng)鹽脅迫的誘導，說明該基因可能參與大蒜植株抵御鹽脅迫的過程，研究結(jié)果為利用幾丁質(zhì)酶基因創(chuàng)制抗逆新品種提供了新的遺傳資源。

按照系統(tǒng)發(fā)育的分類方法，植物幾丁質(zhì)酶可分為Ⅰ～Ⅶ類。其中，Ⅲ類和Ⅴ類植物幾丁質(zhì)酶隸屬于GH18糖苷水解酶家族，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ和Ⅶ類植物幾丁質(zhì)酶屬于GH19家族[20]。不同種類的幾丁質(zhì)酶分子量差異較大，從20 k～90 kDa不等，等電點在3～10之間，但大多數(shù)幾丁質(zhì)酶蛋白具有保守的結(jié)構(gòu)域[21]。本研究鑒定的AsCHI1屬于Class Ⅰ類幾丁質(zhì)酶，且隸屬于GH19糖苷水解酶家族，其在N端具有大多數(shù)幾丁質(zhì)酶具有的信號肽區(qū)域，不同物種的幾丁質(zhì)酶氨基酸序列在C端一致性較高。

植物幾丁質(zhì)酶通過降解幾丁質(zhì)抵御病原真菌和昆蟲對植物的攻擊[22-24]。最新的研究表明，植物幾丁質(zhì)酶能夠響應(yīng)干旱和極端溫度等非生物脅迫，并在植物抗性形成過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)草莓幾丁質(zhì)酶基因FaChi可以響應(yīng)干旱脅迫和脫落酸信號，說明其可能參與草莓植株抵御非生物脅迫的過程[25]。從沙棘中分離和鑒定的基因HrCHI1可能通過ICE-CBF信號途徑參與植物冷脅迫響應(yīng)[26]。將柳樹Ⅲ類幾丁質(zhì)酶基因SlChi轉(zhuǎn)入擬南芥，能夠促進轉(zhuǎn)基因植株在高鹽條件下的種子萌發(fā)和幼苗生長[27]。本研究中，大蒜AsCHI1基因可以響應(yīng)鹽脅迫的誘導，且在根和蒜瓣中響應(yīng)較為強烈，這些結(jié)果說明該基因可能在大蒜植株抵御鹽脅迫的過程中發(fā)揮重要作用。但其如何發(fā)揮功能？其具體的作用機制是怎樣的？這些問題還有待進一步研究和解決。后續(xù)工作可重點研究AsCHI1基因發(fā)揮功能作用的機制以及其在其他非生物脅迫中的功能。

4 結(jié)論

本研究從大蒜中克隆得到幾丁質(zhì)酶基因AsCHI1，其開放閱讀框全長933 bp，編碼蛋白屬于幾丁質(zhì)酶Class I類，隸屬GH19家族，N端具備信號肽區(qū)域。在親緣關(guān)系上與同屬百合科的麝香百合以及山茶科的茶較為接近。AsCHI1基因在大蒜根、蒜瓣和葉片中均有表達，在根中表達最高，且能響應(yīng)鹽脅迫的誘導，說明該基因可能在大蒜對鹽脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。