李 銳，尚 霄，尚春樹，常利芳，閆 蕾，白建榮

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太原 030031；2山西強盛種業(yè)有限公司，太原 030031）

0 引言

雜種優(yōu)勢的利用是大幅度提高玉米產(chǎn)量和改良品質(zhì)的有效途徑。目前，玉米已成為中國第一大糧食作物，是中國北方包括山西的主要糧食作物。山西由于多樣的生態(tài)環(huán)境，形成了5個玉米生態(tài)種植區(qū)域[1]，幾乎包括了全國乃至全世界的玉米生態(tài)類型，每年審定的品種在100個以上。面對目前玉米品種種質(zhì)資源的與日俱增，對玉米遺傳種質(zhì)的親緣關(guān)系及遺傳差異的分析和掌握程度，是改良自交系和利用雜種優(yōu)勢的基礎(chǔ)，在玉米種質(zhì)創(chuàng)新和利用工作中具有重要意義。

SSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于玉米種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究[2-13]。雖然傳統(tǒng)的電泳技術(shù)已進行了多次優(yōu)化，但仍難以滿足試驗中高效、準(zhǔn)確、高通量的需求，因此，毛細管熒光標(biāo)記技術(shù)逐漸受到關(guān)注。該技術(shù)是以DNA測序技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的檢測方法，具有高效、自動化等優(yōu)點。易紅梅、郝晨陽的研究表明，用毛細管熒光引物標(biāo)記技術(shù)檢測效率顯著高于聚丙烯凝膠電泳，結(jié)果更為精確、靈敏，更適用于材料的高通量檢測分析[14-15]。到目前為止，已有許多利用熒光標(biāo)記進行玉米[16-17]和其他作物[18-21]種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究報道，但DNA自動測序儀成本較高，采用熒光引物標(biāo)記也需要較高成本。為克服其缺點，近些年來，新發(fā)展了內(nèi)插熒光染料標(biāo)記法的毛細管電泳熒光檢測技術(shù)，該種染料背景熒光非常低，與DNA的結(jié)合力強，然而當(dāng)其結(jié)合到核酸上時，產(chǎn)生很強的熒光以及高的量子產(chǎn)率。由于不需要標(biāo)記引物，使用該染料標(biāo)記法的設(shè)備成本約DNA自動測序儀的五分之一，實驗成本也大幅下降，實驗結(jié)果同樣準(zhǔn)確。另外，該方法還有DNA自動測序儀沒有的模擬電泳膠圖，形象、直觀，非常受到研究人員的歡迎[22-24]。

山西強盛種業(yè)有限公司是山西最大的種業(yè)公司，也是全國種業(yè)骨干企業(yè)。二十多年來，公司一直堅持育、繁、售一體化策略，每年審定品種5個以上，有山西省內(nèi)、海南及新疆制種基地，每年推廣、銷售大量的種子，是億元級企業(yè)。該公司玉米育種團隊多年來收集了大量的玉米種質(zhì)，在此基礎(chǔ)上改良、培育了許多優(yōu)良自交系，這些自交系在很大程度上代表了山西的玉米種質(zhì)，但還沒有對它們的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)進行分析。本研究用毛細管電泳熒光檢測技術(shù)，對該公司多年收集和選育的優(yōu)良自交系進行遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的分析，為山西省的商業(yè)育種發(fā)展提供有力支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 300份玉米自交系由山西強盛種業(yè)有限公司提供。經(jīng)SSR標(biāo)記分析后，選擇了每份材料在每個位點都是擴增單位點的材料224份，其中包括目前生產(chǎn)上主要推廣品種‘先玉335’、‘先玉508’、‘先玉696’和‘鄭單958’的親本自交系‘PH6WC’（‘先玉335’，‘先玉508’，‘先玉696’的母本）、‘PH4CV’（‘先玉335’父本）、‘PHB1M’（‘先玉696’的父本）、‘PH5AD’（‘先玉508’的父本）、‘鄭58’（‘鄭單958’母本）和‘昌7-2’（‘鄭單958’父本）。試驗在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子設(shè)計育種實驗室，于2018年6月—2020年3月完成。

1.1.2 SSR引物 采用中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定DNA指紋方法》）的20對核心引物和20對輔助核心引物[25]。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取、純化和檢測 采用CTAB法[26]混合提取群體DNA，每個群體包括2個樣本，每個樣本由30個單株(隨機取樣)的黃化芽苗混合而成。采用CTAB法提取并純化DNA，經(jīng)純度和濃度檢測后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增及產(chǎn)物檢測 擴增反應(yīng)在C1000擴增儀上進行。PCR反應(yīng)總體系為20 μL，10xPCR Buffer(25 mmol/L Mg2+)2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，10 μmol/L SSR引物各 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 U，DNA模板80 ng，ddH2O補足體積。PCR反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性5 min，1個循環(huán)；94℃變性1 min，60℃復(fù)性30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后于72℃延伸10min。

擴增產(chǎn)物采用美國AATI公司Fragment Analyzer 96毛細管核苷酸片段分析系統(tǒng)進行電泳檢測，獲取所有擴增產(chǎn)物的峰型電泳圖。Tag DNA聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司；引物和dNTP等試劑購自上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 利用PROSize 3.0軟件將熒光檢測獲取的峰型電泳圖轉(zhuǎn)換成擴增產(chǎn)物的片段長度。利用PowerMarker V3.25軟件統(tǒng)計每對引物的等位變異數(shù)和多態(tài)性信息量(PIC)；標(biāo)記索引系數(shù)(MI)按公式(1)計算。

Allele為該引物的等位變異數(shù)。利用Structure V2.3.4軟件進行類群劃分，研究材料的類群個數(shù)通過ΔK確定，畫出基于模型的群體遺傳結(jié)構(gòu)圖，計算各自交系的Q值。利用NTSYS-PC 2.1軟件按照UPGMA方法對各材料進行聚類分析。統(tǒng)計每份材料的特有等位變異數(shù)（只有1個供試材料有的等位變異）。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

224個玉米自交系在40個SSR位點的遺傳多樣性匯總表1。共檢測到171個等位變異，每個位點檢測出2～8個等位變異，平均4.28個；其中，bnlg439wl位點和bnlg249k2最高，各有8個等位變異；4個位點等位變異最低，只有2個。40個位點的多態(tài)性信息量PIC值變化 范 圍 在 0.05～0.77，平 均 每 個 位 點 0.44；其 中bnlg249k2位點的PIC值最高，達0.77。標(biāo)記索引指數(shù)MI變化范圍在0.16～6.13，平均每個位點為2.02?；蚨鄻有宰兓秶?.05～0.79之間，平均每個位點0.50。6個位點有優(yōu)勢等位變異（等位變異頻率＞80%）出現(xiàn)，其中在umc1335y5位點的3個等位變異中，2號等位變異的頻率高達90.5%；同樣在phi072k4位點的3個等位變異中，1號等位變異的出現(xiàn)頻率高達94.6%，而phi053k2位點中2個等位變異的頻率比較均勻（未列出）。這些高頻率等位變異的出現(xiàn)，說明種質(zhì)遺傳多樣性均勻度較差，從而降低了其遺傳多樣性指數(shù)。因此，將等位變異多少及分布2個指標(biāo)相結(jié)合，可以全面衡量不同種質(zhì)在某一位點的遺傳多樣性。

2.2 特異等位變異分析

在224份自交系中，有7份種質(zhì)共存在特異等位變異9個，分布在8個SSR位點。其中，223號材料有3個特異等位變異，其余6份種質(zhì)各有1個特異等位變異（表2）。按位點分析，umc2084w2位點出現(xiàn)的特異等位變異為2個，其余7個位點上各有1個（表1）。種質(zhì)的特異等位變異是其身份鑒定的重要特征，但也是相對的。隨著分析種質(zhì)數(shù)量的增加，特異等位變異的數(shù)目會趨于減少；但隨著檢測位點的增加，特異等位變異的數(shù)目有可能增加。

表1 224份自交系在40個核心SSR標(biāo)記的遺傳多樣性

表2 有特異等位變異的自交系

續(xù)表1

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)分析及類群的遺傳多樣性分析

應(yīng)用Structure2.3.4軟件，對224個玉米自交系進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，當(dāng)類群數(shù)（K值）在2～10之間變化時，ΔK值在K=3時出現(xiàn)明顯峰值，表明224份自交系可以劃分為3個類群（圖1）。其中104份劃分為Reid群，以‘PH6WC’和‘鄭58’為代表，占參試樣本數(shù)的46.4%；88份劃分為 Lancaster群，以‘PH4CV’、‘PHB1M’、‘ PH5AD’為代表，占參試樣本數(shù)的39.3%；32份劃分為唐四平頭群，以‘昌7-2’為代表，占參試樣本數(shù)的14.3%（圖2）。根據(jù)最大Q值分布，Q值＞0.8和0.9的自交系分別占64.3%和61.2%。然而，224個玉米自交系中有18個Q值＜0.6，占自交系總數(shù)的8.0%，表明每個類群有部分自交系含有其他類群遺傳成分，即存在跨類群自交系（表3）。在3個類群中，塘四平頭群和蘭卡斯特群群的平均等位變異數(shù)為4，瑞德群的最低為3；多肽信息量、基因多樣性與標(biāo)記索引系數(shù)的趨勢類似，塘四平頭群最高，蘭卡斯特群次之，瑞德群最低（表4）。這些結(jié)果表明，塘四平頭群的遺傳多樣性最高，蘭卡斯特群次之，Reid群最低。

表3 模型聚類的各群自交系最大Q值分布

表4 模型聚類的各類群遺傳多樣性

圖1 ΔK的變化曲線

圖2 224份自交系的遺傳結(jié)構(gòu)

2.4 遺傳距離聚類分析

利用40個SSR標(biāo)記的171個等位變異，對224個自交系進行遺傳距離聚類。在相似系數(shù)大約為0.71處可分為5大聚類群，結(jié)合各聚類支中是否含有不同種質(zhì)類群的代表性自交系，確定類群的名稱（圖3）。從圖中看出，瑞德群、蘭卡斯特群是兩個最大的群，二者數(shù)量之和超過了材料的90%；有10份材料屬于唐四平頭群；另有10個自交系的類群歸屬不明確，定為其他群。蘭卡斯特群可明顯看出有335父本群、696父本群與508父本群和其他蘭卡斯特群，即有亞類分化趨勢。

圖3 224份玉米自交系SSR標(biāo)記遺傳距離聚類圖

3 討論

當(dāng)前，商業(yè)育種已成為玉米育種的主要趨勢[27-28]。玉米商業(yè)育種的關(guān)鍵一步就是分析公司現(xiàn)有種質(zhì)資源并重新建立雜種優(yōu)勢群。因此，本研究對近年來育種企業(yè)在商業(yè)化育種中獲得的玉米自交系進行了遺傳分析。

3.1 應(yīng)用合適的標(biāo)準(zhǔn)測驗種

中國曾經(jīng)有6個標(biāo)準(zhǔn)測驗種（‘齊319’、‘黃早四’、‘B73’、‘Mo17’、‘掖478’和‘丹340’）作為群體劃分依據(jù)，它們分別代表中國玉米生產(chǎn)上主要應(yīng)用的PB、四平頭、PA、蘭卡斯特、瑞德和旅大紅骨等雜種優(yōu)勢群[29]。經(jīng)過多年采用多種技術(shù)路線分析，已經(jīng)把中國玉米種質(zhì)合并為3個雜種優(yōu)勢群（列），即A群、B群和D群[30]。商業(yè)育種是設(shè)計育種，玉米商業(yè)化育種中種質(zhì)改良與種質(zhì)創(chuàng)新的基本策略是循環(huán)育種，它們的共同基礎(chǔ)是統(tǒng)一和簡化的雜種優(yōu)勢模式[31]。如果雜種優(yōu)勢類群數(shù)目過多，育種效率有降低的可能。在明確雜種優(yōu)勢模式下用向兩個方向推開的育種策略進行選系是玉米商業(yè)化育種所需[32]。這些年來，按照這個原則，公司主要用本地種質(zhì)對優(yōu)良雜交種先鋒系列和‘鄭單958’的親本進行了改良，選育了大量的自交系。越是引進和擁有豐富的種質(zhì)資源，越是需要簡化雜種優(yōu)勢模式，這樣才便于管理和實踐，這就非常需要確定少而精且實用的標(biāo)準(zhǔn)測驗種。因此，本研究沒有用大多數(shù)研究常規(guī)用的標(biāo)準(zhǔn)測驗種，而選擇了大面積推廣品種‘先玉335’、‘先玉508’、‘先玉696’和‘鄭單958’的親本作標(biāo)準(zhǔn)測驗種。研究結(jié)果準(zhǔn)確反映了改良過程中的育種策略，也能對獲得材料可進行針對性的分析，說明筆者選擇的標(biāo)準(zhǔn)測驗種是非常正確和有效的。

3.2 所選用SSR標(biāo)記的通用型及結(jié)果可比性

許多研究在玉米雜種優(yōu)勢類群劃分時使用的SSR標(biāo)記類型及數(shù)量因不同的研究者而異，因而，研究結(jié)果對其他研究者的參考價值不太大。本研究所用的40個SSR標(biāo)記，是北京農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心通過10多年的努力，從3000多個SSRs中經(jīng)過反復(fù)篩選后確定的一套核心標(biāo)記，具有穩(wěn)定可靠、揭示的多樣性水平高、且部分標(biāo)記與農(nóng)藝性狀連鎖的特點，現(xiàn)已成為中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《玉米品種鑒定DNA指紋方法》的20對核心引物和20對輔助核心引物，非常具有通用型[33]。該套引物非常適合研究中國玉米種質(zhì)資源，已廣泛應(yīng)用于中國玉米資源指紋構(gòu)建、一致性鑒定及遺傳結(jié)構(gòu)分析[34]。本研究采用的毛細管電泳系統(tǒng)和農(nóng)業(yè)部《玉米品種鑒定DNA指紋方法》所用的電泳系統(tǒng)及統(tǒng)計方法完全相同，結(jié)果具有可比性。這也是玉米商業(yè)化育種技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化和流程化所需要的標(biāo)準(zhǔn)檢測條件，體現(xiàn)了商業(yè)育種體系的價值和效率[28]。

3.3 遺傳多樣性分析

研究結(jié)果表明，每個位點檢測出2～8個等位變異，平均4.28個；平均每個位點多態(tài)性信息量PIC、標(biāo)記索引指數(shù)、基因多樣性指數(shù)分別為0.44、2.02和0.50；有些位點存在優(yōu)勢等位變異。這一切說明，這些自交系的遺傳多樣性不太豐富，這主要是由于大部分的自交系定向由骨干自交系而來，加上環(huán)境壓力和人為選擇，導(dǎo)致同一單位選育的自交系遺傳相似度較高，血緣關(guān)系較近。因此，在自交系的改良和創(chuàng)育中，需要加大其他血緣及地方種質(zhì)的引用；另外，在分析和選擇中，加強每個自交系特有等位變異的分析，對含有特有等位變異的自交系要重點注意及有目標(biāo)、有計劃地選留，加大群體的遺傳多樣性。另外，分析群體內(nèi)的等位基因多樣性與頻率來判斷群體間的遺傳距離及對選擇的響應(yīng)，達到既實現(xiàn)在群體內(nèi)積累有益基因，又沒有縮小群體間的距離，從而實現(xiàn)有益基因分別向兩個不同群體積累，為利用雜種優(yōu)勢奠定基礎(chǔ)[31]。

3.4 綜合考慮兩種聚類方法結(jié)果，獲得全面的分析

研究結(jié)果顯示，模型聚類中18份(8.0%)自交系Q值＜0.6，這可能由以下原因造成。一是由于這些材料在選擇中沒有向兩邊推，導(dǎo)致雜優(yōu)類群屬性不典型，屬于中間性材料；另一方面，也有可能是在改良中有其他的育種方案，這些自交系有較多其他血緣成分造成。在遺傳聚類中，90%的材料聚在了瑞德群和蘭卡斯特群中。兩種方法劃分群體的依據(jù)不同但結(jié)果大致一致，模型聚類可通過各自交系的Q值分布解析各自交系的遺傳基礎(chǔ)，細化自交系間的分群；遺傳聚類則反映了自交系間的遺傳距離及亞群間的遺傳關(guān)系。因此，綜合兩種方法的結(jié)果去考慮，可準(zhǔn)確地進行雜種優(yōu)勢類群劃分及遺傳關(guān)系分析，這更有利于指導(dǎo)田間的育種工作、提高育種效率。

4 結(jié)論

本研究根據(jù)40個位點的SSR標(biāo)記，分別采用模型聚類法和遺傳距離聚類法，對山西省商業(yè)育種公司的224份種質(zhì)進行了遺傳結(jié)構(gòu)分析、優(yōu)勢類群的劃分及親緣關(guān)系的確定。其結(jié)果既能結(jié)合田間表現(xiàn)對不適合的材料進行淘汰，提高選擇效率，又能在優(yōu)選的基礎(chǔ)上指導(dǎo)進一步種質(zhì)改良與創(chuàng)新。同時，在大群分類的基礎(chǔ)上，選擇不同的亞群有計劃地進行親本組合，選配雜交種。因此，本研究為這些自交系的改良和利用及選配新雜交組合奠定了理論依據(jù)，也為其它玉米育種者提供了研究思路與方法作參考。