陳建斌 劉穎 張華北 李志琛 何徐軍 梅偉群 錢佳麗 歐陽建

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）和糖尿病腎?。―N）是糖尿?。―M）常見的微血管并發(fā)癥。隨著全球糖尿病患病率的增加，DR和DN引起的視力喪失及腎功能衰竭嚴(yán)重危害患者的健康甚至生命。DM患者中，DR和DN同時或先后發(fā)生的比例較高，表明兩者可能存在共同的發(fā)病機(jī)制。本研究采用轉(zhuǎn)錄基因組測序技術(shù)檢測入組患者外周血白細(xì)胞，從中篩選DR伴DN差異表達(dá)基因，為進(jìn)一步明確DR伴DN易感基因提供候選基因。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年2月至10月聯(lián)勤保障部隊(duì)第903醫(yī)院T2DM患者14例，其中6例不伴DN和DR納入DM組，8例伴DR和DN納入DNDR組。入選患者均符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。DM組納入標(biāo)準(zhǔn)：眼底照相除外DR，ACR＜30 mg/g。DNDR組納入標(biāo)準(zhǔn)：①依據(jù)2002年DR國際分期標(biāo)準(zhǔn)［2］。雙眼眼底彩色照相檢查符合中度以上非增殖性DR（NPDR）或增殖性DR（PDR）；②依據(jù)2012年ADA篩查和診斷標(biāo)準(zhǔn)。即時尿標(biāo)本的白蛋白/肌酐（ACR）＞30 mg/gCr，且3個月內(nèi)監(jiān)測3次ACR至少有2次升高。排除標(biāo)準(zhǔn)：①T1DM、妊娠糖尿病和特殊類型糖尿??；②閉角型青光眼及葡萄膜炎患者；③除DR外的其他視網(wǎng)膜疾??；④高血壓、冠心病、慢性阻塞性肺病、惡性腫瘤、腦卒中；⑤劇烈運(yùn)動、發(fā)熱、尿路感染、腎病綜合征等其他原因?qū)е翧CR升高。兩組患者糖化血紅蛋白水平、病程、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。本項(xiàng)目經(jīng)聯(lián)勤保障部隊(duì)第903醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）主要試劑及儀器：北京愛普華美生物科技有限公司對每份外周血白細(xì)胞樣本進(jìn)行RNA抽提、文庫構(gòu)建和質(zhì)檢，華大基因公司對轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行測序和數(shù)據(jù)質(zhì)控。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測蛋白激酶C delta結(jié)合蛋白（PRKCDBP）基因、CD177抗原（CD177）基因的mRNA表達(dá)。RNase OUT?（5,000 U）（10777-019）、5X第一鏈緩沖液（18064-015）、5X第二鏈緩沖液（10812-014）、SuperScript III逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（18064-014）、Trizol（15596026）、Dynabeads mRNA 純化試劑盒（610-06）、苯酚/氯仿/異戊醇（15593-31）購自美國Invitrogen公司；Phusion DNA聚合酶（F-531L）、外切核酸酶1（M0293S）、DNA連接酶（M2200L）均購自美國NEB公司；紅細(xì)胞裂解液（批號RT122-02Lot//N2214）購于杭州開泰生物技術(shù)有限公司；dNTPs混合物（BF7801A）、熒光定量PCR試劑盒TB Green?Premix Ex Taq? II（TliRNaseH Plus）購自日本TaKaRa公司；GAPDH引物、CD177、PRKCDBP均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。PTC-100型PCR儀購自美國BIO-RAD公司；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon）購自上海天能科技有限公司；紫外線分光光度儀（nanodrop1000）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；安捷倫2100生物分析儀購自美國Agilent公司。（2）白細(xì)胞分離：空腹采集患者外周血，加入裝有抗凝劑（乙二胺四乙酸二鉀，EDTA-K2）的血常規(guī)管中。離心后沉淀部分加入紅細(xì)胞裂解液，期間再顛倒混勻幾次，沉淀中加入1 mL Trizol試劑，分離后的白細(xì)胞分裝，放置冰箱保存。（3）RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄組測序：采用RNA提取試劑盒提取總RNA，nanodropRNA質(zhì)檢和安捷倫2100生物分析儀檢測RNA完整度，然后進(jìn)行測序。（4）轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的過濾和評估：由Illumina HiSeq TM 2000測序所得的數(shù)據(jù)為raw reads。通過軟件得到clean reads，并進(jìn)行質(zhì)控。（5）基因表達(dá)注釋和定量：將clean reads比對到參考基因組和參考基因序列，統(tǒng)計其分布情況及覆蓋度。利用每個堿基長度reads數(shù)計算基因表達(dá)量。（6）GO以及Pathway顯著性富集分析：基因本體（GO）包括3個本體：分別描述參與的生物過程GO-P、所處的細(xì)胞位置GO-C、分子功能GO-F。應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，再通過富集分析確定差異基因的主要生物學(xué)功能。通過生化代謝與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Pathway）顯著性富集分析確定差異基因參與的主要生化代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。（7）基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析：對差異表達(dá)基因、直接相互作用的基因進(jìn)行基因互作網(wǎng)絡(luò)分析。（8）RT-qPCR驗(yàn)證：實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測PRKCDBP、CD177的mRNA相對表達(dá)量。同時繪制熔解曲線，采用2-ΔdΔCT法計算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列如下：PRKCDBP-forward：5'-CACGTTCTGCTCTTCAAGGAG-3'，PRKCDBP-reverse：5'-TGTACCTTCTGCAATCCGGTG-3'；CD177-forward：5'- CGGCAATGGACCCCTAAGAAC-3'，CD177-reverse：5'- AACGAGGTTGTTGCAGAAGTC-3'；GAPDH-forward：5'- CTGGGCTACACTGAGCACC-3'，GAPDHReverse：5'- AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。取DM及DNDR組基因表達(dá)量的均數(shù)（mean）和中位數(shù)（median），分別計算兩組間各個基因相應(yīng)的ratio值。差異表達(dá)基因的設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為mean和median倍數(shù)上下調(diào)均≥2.0倍。PRKCDBP和CD177mRNA表達(dá)量以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)控結(jié)果 nanodropRNA質(zhì)檢和安捷倫2100檢測14份樣本RNA質(zhì)量均合格，采用RNA-seq和qPCR定量兩種方法對轉(zhuǎn)錄組文庫質(zhì)檢均合格。全部樣本數(shù)據(jù)過濾后Q20比例均＞93.9%，GC含量為46.61%～49.15%，clean reads比例平均占raw reads的＞97%，測序數(shù)據(jù)良好。reads在基因覆蓋度以及參考序列上的分布情況均合格，可用于后續(xù)分析。

2.2 差異表達(dá)基因 與DM組比較，DNDR組所篩選出的差異表達(dá)基因98個，上調(diào)42個，下調(diào)56個。見表1。

表1 DRDN與DM組比較差異表達(dá)基因

2.3 GO注釋和富集分析結(jié)果 見圖1。

圖1 差異基因本體分析

2.4 Pathway顯著性富集分析 差異表達(dá)基因參與77條Pathway（圖2結(jié)果顯示富集到差異基因最多的前20條Pathway），其中最顯著的為移植物抗宿主病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及抗原處理和遞呈。上調(diào)最明顯的ABHD11反義 RNA 1（ABHD11 antisense RNA 1，ABHD11-AS1）未富集到相關(guān)Pathway，下調(diào)最明顯的絲氨酸肽酶抑制劑Kazal 4前體（SPINK4）參與ECM-受體相互作用（ECM-receptor interaction）Pathway。

圖2 前20 pathway富集分析圖

2.5 差異基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 差異基因?qū)?yīng)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，PDZ結(jié)合激酶（PBK）與蛋白激酶C delta結(jié)合蛋白（PRKCDBP）、Ras關(guān)聯(lián)域家族成員6（RASSF6）相互作用。KIR2DL1與KIR2DS1存在相互作用。見圖3。

圖3 基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析圖

2.6 PRKCDBP和CD177mRNA表達(dá)RT-qPCR檢測結(jié)果 DNDR組PRKCDBPmRNA表達(dá)量低于DM組，DNDR組CD177的mRNA表達(dá)量高于DM組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 2組PRKCDBP和CD177 mRNA表達(dá)比較

3 討論

糖尿病發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重威脅人類健康，我國約20%～40%的DM患者合并DN［3］，而糖尿病患者中約有1/3 出現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變癥狀［4］。研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)格控制血糖可降低DR和DN的發(fā)生風(fēng)險，但不能完全阻止其發(fā)生和進(jìn)展［5］。臨床觀察顯示，部分DM患者持續(xù)高血糖但不發(fā)生微血管并發(fā)癥，而部分DM患者病程較短，血糖控制良好，卻發(fā)生嚴(yán)重的DR和DN。在單卵雙生雙胞胎中，DR和DN的患病率一致［6］，表明遺傳因素在DR和DN發(fā)病中具有重要作用。

本研究共篩選出98個DNDR差異表達(dá)基因，為進(jìn)一步驗(yàn)證DRDN易感基因提供了候選基因。差異基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示多個差異基因之間存在相互作用，富集性分析發(fā)現(xiàn)一個基因可以參與多個GO或Pathway，也可以多個基因參與一個GO或Pathway，表明DNDR發(fā)生發(fā)展是多基因相互作用的結(jié)果。

KIR2DL1、KIR2DS1通過自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性調(diào)節(jié)NK細(xì)胞活性，在抗原處理與提呈過程中發(fā)揮作用。有文獻(xiàn)報道，活化的KIR2DS1受體與自身免疫性疾病［7］，病毒感染的控制［8］、惡性腫瘤［9］等有關(guān)。KIR2DL1是NK細(xì)胞表面主要的抑制性因子，PARHAM等［10］發(fā)現(xiàn)，KIR2DL1識別KG1A細(xì)胞株表面HLA-C2表型，可抑制NK細(xì)胞對KG1A細(xì)胞的殺傷活性。KIR2DL1作為NK細(xì)胞表面主要的抑制性因子，在各種惡性腫瘤免疫效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。SHASTRY等［11］研究發(fā)現(xiàn)，KIRs與糖尿病易感性相關(guān)且存在種族差異。在拉脫維亞成人患者中，KIRs 2DL1、2DS2和2DS4是易感因子，2DS5是保護(hù)因子；而在印度成人患者中，KIRs 2DL5和3DL1是易感因子，2DS1和2DS3是保護(hù)因子。本研究中DNDR組KIR2DL1、KIR2DS1下調(diào)，KIR2DL1、KIR2DS1與DR伴DN之間的關(guān)系仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

文獻(xiàn)報道，上調(diào)最明顯的ABHD11-AS1基因主要與腫瘤有關(guān)［12-13］，下調(diào)最明顯的絲氨酸肽酶抑制劑Kazal 4型（SPINK4）參與ECM-受體相互作用（ECM-receptor interaction）的Pathhway SPINK4在乳糜瀉（CD）患者中顯示差異基因表達(dá)，在未治療患者中最高，在無谷蛋白飲食開始時急劇下降，與CD病理改變相關(guān)的差異基因表達(dá)，可能來自杯狀細(xì)胞活性的改變［14］。PIETZ等［15］發(fā)現(xiàn)活動性CD的腸上皮細(xì)胞中SPINK4顯著上調(diào)，活動性CD中，SPINK4和抗微生物凝集素1（ITLN1）的表達(dá)水平的顯著增加表明對細(xì)菌的先天免疫。研究揭示下調(diào)最明顯的SPINK4與炎癥過程有關(guān)，而在DNDR發(fā)病機(jī)制中的作用仍待深入研究。

PRKCDBP，又稱為細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷相關(guān)蛋白3（CAVIN3），通過CAVIN1靶向細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷，與窖蛋白1（caveolin1）的支架結(jié)構(gòu)域相互作用并促進(jìn)細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷動力學(xué)［16］，CAVIN3缺失減少平滑肌中細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷的數(shù)量，且部分使CAVIN1不穩(wěn)定，使血管對一氧化氮的敏感性升高，在嚴(yán)重細(xì)胞應(yīng)激的情況下干擾高爾基體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。ZHU等［17］研究發(fā)現(xiàn)，CAVIN3有助于體內(nèi)平滑肌中細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷的形成。CAVIN3消融使平滑肌細(xì)胞中細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷的密度降低40%～45%，而內(nèi)皮細(xì)胞保持細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷豐度。PRKCDBP是一種推定的腫瘤抑制因子，已經(jīng)在幾種癌癥中觀察到改變［18］，也有研究發(fā)現(xiàn)與潰瘍性結(jié)腸炎（UC）有關(guān)，PRKCDBP被鑒定為響應(yīng)腫瘤壞死因子（TNF）-α而被核因子-κB激活。PRKCDBP的黏膜表達(dá)與UC患者中的TNF-α表達(dá)強(qiáng)烈相關(guān)，且IFX治療導(dǎo)致PRKCDBP和TNF-α的顯著降低。因此，這些發(fā)現(xiàn)支持PRKCDBP表達(dá)受TNF-α嚴(yán)格控制，且IFX的抗炎作用可能部分源于阻斷TNF-αPRKCDBP信號傳導(dǎo)途徑［19］。本研究中PRKCDBP明顯下調(diào)，其對DR、DN的影響是否與血管平滑肌內(nèi)陷或炎癥作用有關(guān)需進(jìn)一步研究。

編碼分泌信號蛋白結(jié)構(gòu)的相關(guān)基因組成了WNT基因家族。WNT3通過激活WNT-β-catenin信號通路參與腫瘤發(fā)生，WANG等［20］發(fā)現(xiàn)胃癌中的WNT3表達(dá)顯著升高，表明上調(diào)的WNT3可以通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并通過抑制癌細(xì)胞的凋亡在胃腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)［21］WNT3可通過WNT3α/β-catenin信號通路影響足細(xì)胞，可能與腎病有關(guān)。ZHOU等［22］報道，WNT信號通路在年齡相關(guān)性黃斑變性和DR動物模型的視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中被激活，誘導(dǎo)血管生成和炎癥因子的過量產(chǎn)生。另一方面，由經(jīng)典WNT途徑的激活誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生可能通過NF-B途徑促成炎性因子的過表達(dá)，反過來炎性因子的過度表達(dá)加劇炎癥的發(fā)展，經(jīng)典WNT途徑的激活誘導(dǎo)視網(wǎng)膜炎癥和氧化應(yīng)激，在DR中發(fā)揮致病作用，本研究中WNT3上調(diào)，上述機(jī)制是否參與其在DR、DN發(fā)病中的作用需進(jìn)一步探討。

CD177是由可變比例的人嗜中性粒細(xì)胞表達(dá)的糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，其介導(dǎo)抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體（ANCA）抗原蛋白酶3的表達(dá)，D177與β2整聯(lián)蛋白結(jié)合并識別血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子［23］。在抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體相關(guān)的系統(tǒng)性血管炎（AASV）患者中發(fā)現(xiàn)膜表達(dá)蛋白酶3（PR3）的增加依賴于CD177表達(dá)，并且與CD177基因的轉(zhuǎn)錄相關(guān)，中性粒細(xì)胞亞群向MPR3+/CD177+表型轉(zhuǎn)變與成熟中性粒細(xì)胞過度產(chǎn)生CD177有關(guān)，表明CD177在中性粒細(xì)胞遷移中的作用。成熟的MPR3和CD177在包括AASV患者在內(nèi)的所有個體的中性粒細(xì)胞質(zhì)膜上共同表達(dá)。AASV和SLE患者的中性粒細(xì)胞中，MPR3+/CD177+表型以及PR3和CD177的mRNA表達(dá)增加［24］，以上研究表明CD177與炎癥有關(guān)。本研究中DNDR組CD177表達(dá)上調(diào)，其在DR、DN發(fā)病中的作用是否與其致炎癥作用有關(guān)，需進(jìn)一步證實(shí)。