嚴(yán)永興 張艷 王俊 劉慧麗 吳春麗

腦卒中已成為我國第一位死亡病因，其中缺血性腦卒中約占腦卒中總數(shù)的70%～80%，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，給家庭、社會帶來沉重負(fù)擔(dān)［1-2］。而缺血再灌注損傷是導(dǎo)致缺血性卒中重要的病理生理機(jī)制，其包括氧自由基生成、鈣超載、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等［3-4］。miRNA是一段長約21～28個(gè)核苷酸的單鏈小RNA，由非編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄而成，主要存在于細(xì)胞及血漿中且保持高度穩(wěn)定。目前已發(fā)現(xiàn)數(shù)種miRNA與腦缺血再灌注損傷過程有關(guān)聯(lián)，如miRNA-34a可調(diào)節(jié)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（NOX2）蛋白表達(dá)［5］，miRNA-29b可參與抗凋亡蛋白（Bcl2）的生成等［6］。既往研究發(fā)現(xiàn)miRNA-320可引起心肌細(xì)胞凋亡和心肌梗死［7］，但其在腦缺血再灌注損傷中的作用仍不清楚，本文探討miRNA-320對氧糖剝奪P12細(xì)胞的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 P12細(xì)胞（褐家鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤）購自南京華奧生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天公司，IGF-1抗體購于美國AFFINTY公司，SYBR Green qPCR試劑盒購于Thermo公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Fermentas公司，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基購于Hyclone公司，Tunel試劑盒購于Roche公司，MTT Cell Viability Assay Kit購于abnova公司，miRNA-320 擬似物和miRNA-320抑制劑試劑購自于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，恒溫振蕩培養(yǎng)箱（華美生化儀器有限公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國Stratagene公司），生物倒置顯微鏡（德國OLYMPUS公司），酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）。

1.2 方法 （1）實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽渑c分組：P12細(xì)胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清，5%馬血清和10 U/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃ 5% CO2濕潤的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。按照Lipofectamine 2000試劑盒的轉(zhuǎn)染步驟準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑，一只EP管（A管）用250 μL Opti-MEM稀釋5 μL Lipofectamine 2000，室溫靜置5 min，一只EP管（B管）用250 μL Opti-MEM稀釋10 μL mimics/inhibitor（儲存濃度為10 μM）；將A、B兩管的溶液混勻后，室溫靜置20 min；將siRNA-lipofectmine 2000混合液加入到含有1.5 mL完全培養(yǎng)基的6孔板中；轉(zhuǎn)染4～6 h后更換培養(yǎng)基備用。無糖DMEM培養(yǎng)基預(yù)先置于混合氣（95%N2和5% CO2）中平衡；轉(zhuǎn)染培養(yǎng)3天后P12細(xì)胞經(jīng)無糖DMEM刷洗2遍后，補(bǔ)加無糖DMEM后置于氧剝奪室。氧剝奪室預(yù)先經(jīng)混合氣體以10 L/min的流速充滿，4 min后形成缺氧環(huán)境。然后將處理后的P12細(xì)胞置于預(yù)先缺氧的剝奪室，4 h后將P12細(xì)胞恢復(fù)到正常水平的葡萄糖和氧環(huán)境中。24 h后收集細(xì)胞以備檢測。實(shí)驗(yàn)分正常對照組（正常P12細(xì)胞），模型組（氧糖剝奪組，OGD組），miRNA-320擬似物組（OGD+miRNA-320 mimics組），miRNA-320抑制劑組（OGD+miRNA-320 inhibitor組）。（2）MTT檢測：使用MTT法測定細(xì)胞增殖。取對數(shù)生長期的P12細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL Sigma公司）溶液放置培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育4 h后，再每孔加入200 μL DMSO溶解貼壁細(xì)胞，置于搖床上室溫振蕩10 min，采用酶標(biāo)儀測定各孔492 nm的吸光度，進(jìn)行細(xì)胞增殖分析。（3）TUNEL檢測：參照說明書進(jìn)行TUNEL檢測。細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定30分鐘后，將樣本浸入3% H2O2封閉液中室溫封閉10 min，PBS洗滌3次，5 min/次。加入50 μL TUNEL反應(yīng)液于標(biāo)本上，37℃孵育1 h，再次PBS沖洗后加入50 μL POG于標(biāo)本上，30 min后PBS沖洗加入50 μL DAB顯色工作液在室溫處理5 min，隨后滴加蘇木素染色1 min后浸入1%鹽酸甲醇溶液中分化5 s，蒸餾水沖洗干凈蓋玻片封片，顯微鏡下觀察拍照。（4）qRT-PCR檢測：收集各組細(xì)胞，采用TRIzol試劑提取細(xì)胞中總RNA，紫外分光度計(jì)測量RNA濃度和純度。cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為42℃，30 min；85℃，10 min。熒光定量PCR擴(kuò)增檢測miRNA-320-3p，IGF-1 mRNA的表達(dá)水平，反應(yīng)體系為95℃，3 min，95℃，12 s，62℃，40 s，40次循環(huán)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量，根據(jù)Genebank分布的各基因相應(yīng)mRNA序列，使用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，引物由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成。（5）WB檢測：P12細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪后取出，棄培養(yǎng)基后PBS洗滌3次，加入細(xì)胞裂解液。裂解完后于4℃下12,000 rpm離心15 min，收集上清液，采用碧云天BCA蛋白溶度測定試劑盒測定蛋白溶度。蛋白樣品與loading buffer混合后于100℃處理5 min。經(jīng)制備SDS-PAGE凝膠后，每孔上樣50μg蛋白，電泳分離，聚偏二氟乙烯膜（PVDF）轉(zhuǎn)膜90 min，使用TBST洗滌PVDF膜后5%脫脂奶粉封閉，室溫下?lián)u床2 h，再次洗滌后用稀釋的一抗封閉（稀釋比例：IGF-1∶1∶1,000；β-action：1∶2,000），置于4℃冰箱孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，ECL顯影，膠片曝光測定蛋白濃度，每個(gè)蛋白條帶的灰度比值代表蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-320抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)P12細(xì)胞凋亡 與對照組比較，模型組細(xì)胞增殖能力明顯減弱、細(xì)胞凋亡增加（P＜0.01）；與模型組比較，miRNA-320擬似物組細(xì)胞增殖下降（P＜0.01）、細(xì)胞凋亡增加（P＜0.05）；而miRNA-320抑制劑組細(xì)胞增殖顯著增加（P＜0.01）、細(xì)胞凋亡減弱（P＜0.05）。見圖 1～3。

圖1 MTT檢測細(xì)胞增殖情況

圖2 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡圖

圖3 各組細(xì)胞凋亡率比較

2.2 miRNA-320、IGF-1基因表達(dá) 與對照組比較，模型組miRNA-320表達(dá)上調(diào)、IGF-1 mRNA表達(dá)下降（P＜0.01）；與模型組比較，miRNA-320擬似物組miRNA-320表達(dá)上調(diào)、IGF-1 mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）；而miRNA-320抑制劑組miRNA-320表達(dá)下調(diào)、IGF-1 mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）。見圖4～5。

圖4 各組microRNA-320的相對表達(dá)量

圖5 各組IGF-1mRNA的對表達(dá)量

2.3 IGF-1蛋白表達(dá) 與對照組比較，模型組IGF-1蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組比較，miRNA-320擬似物組IGF-1蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；而miRNA-320抑制劑組IGF-1蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。見圖6～7。

圖6 各組IGF-1蛋白表達(dá)條帶圖

圖7 各組IGF-1蛋白相對表達(dá)量比較

3 討論

缺血性卒中是一類嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病，其具有發(fā)病率、致殘率、病死率高［8］。目前臨床上治療措施主要為早期血管開通及腦保護(hù)治療。盡管近年來缺血性卒中的診治技術(shù)取得新進(jìn)展，但卒中發(fā)生后患者的病理生理過程無法逆轉(zhuǎn)，使患者的神經(jīng)功能恢復(fù)不佳。缺血再灌注損傷是缺血性卒中的重要病理生理機(jī)制，因此如何減輕再灌注損傷，挽救缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞也是一重要治療方法［9］，值得臨床醫(yī)師重視。

P12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤分化株，具有類似神經(jīng)元的形態(tài)的生理生化特征，已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生理、藥理等研究［10］。為此本研究亦采用P12細(xì)胞建立細(xì)胞氧糖剝奪模型，探討miRNA-320在體外腦缺血再灌注損傷中的作用。結(jié)果成功建立了氧糖剝奪模型，與正常對照組比較，模型組細(xì)胞增殖明顯下降、細(xì)胞凋亡明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

miRNA與各類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其可參與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、血腦屏障破壞等病理生理過程［11-13］。SONG等［7］研究發(fā)現(xiàn)在心肌缺血再灌注損傷模型中，miRNA-320通過IGF-1途徑引起心肌細(xì)胞凋亡，而抑制miRNA-320表達(dá)后可保護(hù)心肌細(xì)胞壞死。SEPRAMANIAM等［14］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠動脈栓塞缺血1 h再灌注1 h后，通過抑制miRNA-320a的表達(dá)可增加AQP-1和AQP-4基因表達(dá)水平，通過AQP-1和AQP-4蛋白途徑從而減輕腦損傷，減少腦缺血再灌注腦梗死體積。動物實(shí)驗(yàn)研究［15］發(fā)現(xiàn)miRNA-320可增加大鼠皮層神經(jīng)元凋亡，增加梗死體積和腦水腫，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用P12細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪后正常培養(yǎng)模擬生物體內(nèi)的缺血再灌注現(xiàn)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miRNA-320可促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖，而miRNA-320抑制劑可明顯改善此種現(xiàn)象，從體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)miRNA-320在腦缺血再灌注損傷中的作用。

既往研究［7］發(fā)現(xiàn)miRNA-320可作用于IGF-1發(fā)揮作用。IGF-1是由70個(gè)氨基酸組成的單鍵堿性多肽，是一種重要的調(diào)節(jié)神經(jīng)生長的生物活性物質(zhì)，在腦缺血再灌注損傷時(shí)可減輕神經(jīng)元損傷，動物實(shí)驗(yàn)也表明腦內(nèi)注射IGF-1可限制神經(jīng)元損傷的程度，并阻止神經(jīng)元進(jìn)一步死亡。本研究結(jié)果顯示，miRNA-320擬似物組與模型組比較，miRNA-320表達(dá)上調(diào)、IGF-1 mRNA及IGF-1蛋白表達(dá)下降，而miRNA-320抑制劑組與擬似物組完全相反。提示，缺血再灌注損傷后，miRNA-320表達(dá)增高，IGF-1蛋白表達(dá)降低，應(yīng)用miRNA-320抑制劑后提高IGF-1表達(dá)后細(xì)胞增殖存活率增加，細(xì)胞凋亡減少。

綜上所述，miRNA-320可能通過調(diào)控IGF-1水平對腦缺血再灌注損傷起作用，miRNA-320對神經(jīng)元的作用及機(jī)制有望成為缺血性卒中治療的新靶點(diǎn)。