胡曉蕾 堯銀光 劉素霞

原發(fā)性肝癌（HCC）是常見惡性腫瘤，據統(tǒng)計全球每年新發(fā)病例超過100萬例，其中我國約占40%，在所有惡性腫瘤發(fā)病率中占第3位［1］。肝動脈化療栓塞術（TACE）是目前應用最廣泛的肝癌治療方式之一，也是巴塞羅那分期推薦的中期肝癌標準治療方式，亦用于無法行治愈性治療的早期肝癌［2］。但是，單純TACE有腫瘤壞死不完全、易復發(fā)、加重肝功能損害等局限性，影響患者的遠期生存率。這與肝癌患者出現(xiàn)的機體抗腫瘤免疫缺陷，尤其是細胞免疫功能抑制密切相關［3］。本研究擬通過對HCC患者術后外周血免疫細胞組進行檢測，了解患者術后細胞免疫功能的變化，為檢測患者術后的免疫指標選擇提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年7月至2016年3月本院行TACE治療的HCC患者36例，男30例，女6例；年齡28～86歲。診斷符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019年版）》診斷標準［4］。排除標準：孕婦及哺乳期婦女；合并其他噬肝病毒感染及有重要器官疾病者（嚴重心、腎、甲狀腺疾病，糖尿病，精神病等），近6個月接受干擾素抗病毒及免疫調節(jié)或免疫抑制藥物治療者。

1.2 主要試劑和儀器 熒光標記的鼠抗人單克隆抗體 CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3PC5，CD11b FITC、CD15 RD1、CD14 PC5、CD45 PC7，CD4 PC7、CD127RD1、CD25 FITC、CD45 PC5，溶血素、鞘液、清洗液，BECKMAN COULTER Cytomics FC500 MCL型流式細胞儀均購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 外周血細胞免疫表型檢測 （1）標本采集：分別于行化療栓塞術前24 h內和術后72～96 h內取外周靜脈血2 mL，置EDTA抗凝管，于6 h內檢測。（2）T淋巴細胞亞群檢測：于流式管中加入單克隆抗體（CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5）10 μL，加入 100 mL血液，混勻后室溫避光溫育15 min。再加入0.5 mL溶血素混勻，避光溫育10 min后加0.5 mL鞘液上流式細胞儀檢測。（3）CD45modCD11b+CD14-CD15-細胞的檢測：于流式管中加入單克隆抗體CD11b FITC和CD15 RD1 20 μL，CD14 PC5 和 CD45 PC7 10 μL，加入100 μL血液，混勻后室溫避光溫育15 min。再加入0.5 mL溶血素裂解紅細胞，避光溫育10 min后，用鞘液洗滌1次，加0.5 mL鞘液上流式細胞儀檢測。（4）調節(jié)性T細胞（Treg）的檢測：于流式管中加入單克隆抗體（CD4 PC7、CD127RD1、CD45 PC5各10 μL，CD25 FITC 20 μL，加入100 μL血液，混勻后室溫避光溫育15 min。再加入0.5 mL溶血素裂解紅細胞，避光溫育10 min后，用鞘液洗滌1次，加0.5 mL鞘液上流式細胞儀檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件，GraphPad Prism 5 Demo軟件。符合正態(tài)分布計量資料以（）表示，非正態(tài)分布計量資料用M（Q1，Q3）表示。手術前后的對比采用配對t檢驗或配對秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者基本資料 肝癌患者在化療后WBC、N%、M%等各項指標比化療前均有不同程度的上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 化療前和化療后患者的血細胞及肝功能比較

2.2 外 周 血 中Treg和CD45modCD11b+CD14-CD15-細胞的變化情況患者化療前和化療后的CD45modCD11b+CD14-CD15-差異有統(tǒng)計學意義（Z=-3.131，P=0.002），見圖1。而化療前后Treg比較差異無統(tǒng)計學意義（Z=-0.017，P=0.987），見圖2。

圖1 患者化療前后外周血Treg細胞占比

圖2 患者化療前后外周血CD45modCD11+CD14-CD15-細胞占比

2.3 外周血中T淋巴細胞亞群的變化情況 CD4（Z=-1.523，P=0.128）、CD8（Z=-1.235，P=0.217）和CD4/CD8（Z=-0.163，P=0.871）手術前后差異無統(tǒng)計學意義。見圖3、4、5。

圖3 患者化療前后外周血CD4+T細胞絕對計數

圖4 患者化療前后外周血CD8+T細胞絕對計數

圖5 患者化療前后外周血CD4+/CD8+比值

3 討論

機體抗腫瘤免疫反應以細胞免疫為主，T淋巴細胞起主要調控作用，CD3陽性細胞代表總T淋巴細胞，CD4+和CD8+分別代表T淋巴細胞的兩個亞群，其中CD4+細胞為輔助T細胞，不僅可以直接殺傷腫瘤細胞，還可以分泌大量細胞因子以提高CD8+T細胞殺傷腫瘤細胞的能力，CD8+T細胞包括細胞毒性T細胞和抑制性T細胞，分別具有殺傷腫瘤細胞和抑制機體免疫應答的功能，正常情況下兩者處于動態(tài)平衡，共同參與機體的免疫應答。但大多數腫瘤存在腫瘤免疫逃避機制，這也是腫瘤細胞在機體中難以被徹底清除的原因所在。髓源性抑制細胞（MDSC）和調節(jié)性T細胞（Treg）在感染產生的免疫抑制環(huán)境和腫瘤誘發(fā)的免疫抑制過程中發(fā)揮重要作用［5-6］。MDSC主要由處于早期分化階段的髓系細胞組成，是一群具有異源性、可塑性的未成熟髓系細胞［7］，由于其表型在不同的疾病或研究報道中各不相同，目前只能通過其免疫抑制功能確認。Treg在人的外周血及淋巴組織中約占CD4+T細胞的5%～10%，其中天然Treg（nTreg）大部分為CD4+CD25+Treg，以其表面高表達CD25，同時表達CD4，低表達CD127為特征［8］。

在本實驗中，對HCC患者行TACE術前后的T淋巴細胞亞群檢測發(fā)現(xiàn)化療后CD4T細胞、CD8T細胞和CD4/CD8比值均低于化療前的檢測值，差異無統(tǒng)計學意義，可能原因是標本量較少。免疫表型進一步的檢測發(fā)現(xiàn)Treg的表達在化療后比化療前有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義。本次實驗根據MDSC為早期分化階段的髓系細胞的定義，檢測免疫表型為CD45modCD11b+CD14-CD15-的細胞在化療栓塞術后3天的變化，發(fā)現(xiàn)雖然化療后早期HCC患者外周血白細胞總數及中性粒細胞和單核細胞比例均有不同程度的上升，但本實驗中代表MDSC的CD45modCD11b+CD14-CD15-細胞在化療后的表達與化療前相比下降，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002）。作者認為，在化療后早期，由于化療造成的組織細胞破壞必然引起機體的快速防御反應，因此髓系系統(tǒng)的中性粒細胞和單核細胞增多，然而反應需更多時間的特異性免疫系統(tǒng)則未見明顯變化。本實驗中處于早期分化階段的髓系細胞CD45modCD11b+CD14-CD15-細胞的明顯變化或許可提示MDSC能夠反映肝癌患者在接受化療栓塞術后早期的細胞免疫狀況的變化，進而為患者的長期預后提供預判。為證明這一點，需長期隨訪患者，并納入更多的研究對象?；贛DSC在腫瘤免疫調節(jié)中的重要作用，以及本實驗中CD45modCD11b+CD14-CD15-細胞在肝癌患者化療后早期有明顯的變化，提示MDSC可能成為肝癌患者療效檢測和預后判斷的指標尋找的切入點，值得進一步探尋。