袁 媛，劉洪艷

(天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457)

微生物氧化分解釋放出電子，電子經(jīng)呼吸鏈從有 機(jī)物傳遞到胞外電子受體，此過程稱為胞外電子傳遞(extracellular electron transfer，EET)[1]．胞外電子傳遞過程經(jīng)歷兩個(gè)階段[2]：第一階段是有機(jī)物被氧化后產(chǎn)生的電子，經(jīng)由電子傳遞鏈上的組分傳遞至細(xì)胞內(nèi)膜，再由細(xì)胞色素蛋白或其他功能蛋白傳遞至細(xì)胞外膜；第二階段是電子從細(xì)胞外膜到末端電子受體的傳遞，主要的4種方式為直接接觸、納米導(dǎo)線機(jī)制、應(yīng)電運(yùn)動(dòng)和電子穿梭機(jī)制[3]．

異化鐵還原是指微生物將有機(jī)物中的電子轉(zhuǎn)移到以Fe(Ⅲ)為末端的電子受體的過程，并在這一過程中將Fe(Ⅲ)還原為Fe(Ⅱ)．希瓦氏菌和地桿菌作為呼吸型異化鐵還原菌中的模式菌，在其胞外電子傳遞過程中，細(xì)胞色素c作為不可缺少的一類蛋白質(zhì)，不僅可以將電子從細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外膜，而且可以分泌到細(xì)胞外，作為外膜蛋白參與細(xì)胞表面的電子傳遞[4]．Breuer等[5]總結(jié)菌株Shewanella oneidensisMR-1存在16種細(xì)胞色素c，包括MtrC、MtrF、OmcA、MtrA、MtrD、CymA等．對(duì)于呼吸型異化鐵還原細(xì)菌，胞外電子傳遞機(jī)制的研究主要集中于直接接觸機(jī)制．而在研究發(fā)酵型異化鐵還原細(xì)菌Anoxybacter fermentansDY22613T的胞外電子傳遞機(jī)制時(shí)，Li等[6]未發(fā)現(xiàn)該菌株的全基因組序列中有編碼細(xì)胞色素c的基因．對(duì)于缺少細(xì)胞色素c的發(fā)酵型異化鐵還原細(xì)菌，利用電子穿梭體可能是胞外電子傳遞的一種策略[7]．

電子穿梭體作為胞外電子傳遞的重要組成部分，可介導(dǎo)微生物間、微生物與電子受體間以及電子供體與電子受體間的電子轉(zhuǎn)移[8]．電子穿梭體參與微生物胞外電子傳遞的基本過程：氧化態(tài)電子穿梭體接受電子變成還原態(tài)，還原態(tài)電子穿梭體將電子傳遞給胞外的電子受體完成一次電子傳遞，而自身因失去電子又變回氧化態(tài)進(jìn)行新一輪的電子傳遞[9]．電子穿梭體按照來源可分為內(nèi)源電子穿梭體和外源電子穿梭體．內(nèi)源電子穿梭體是依靠微生物自身分泌的氧化還原物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)電子從供體到受體的傳遞，而外源電子穿梭體是環(huán)境中原來就存在的或是人為添加物，在微生物胞外電子傳遞過程中起到呈遞電子的作用；按照化學(xué)組成可分為黑色素類、吩嗪類、腐殖質(zhì)類、醌類和黃素類[10-14]．

核黃素作為電子穿梭體是由Canstein等[7]發(fā)現(xiàn)并確定的，其研究結(jié)果表明菌株奧奈達(dá)希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)MR-1分泌胞外電子穿梭體黃素單核苷酸(FMN)和核黃素，用于促進(jìn)菌株MR-1生長(zhǎng)和加速還原結(jié)晶度較差的Fe(Ⅲ)氧化物．除希瓦氏菌(Shewanellasp.)外，研究者發(fā)現(xiàn)在多株細(xì)菌中，核黃素具備增強(qiáng)電子傳遞的能力，例如硝酸鹽還原菌(Bacillus licheniformis)[15]可以利用希瓦氏菌分泌的核黃素加速不銹鋼的腐蝕，而鐵呼吸菌(Methylophilussp.)[16]和絲狀芽胞桿菌(Cystobasidium slooffiae)[17]均能自身分泌核黃素，前者用于異化鐵還原的胞外電子傳遞，后者用于提高其生物電產(chǎn)量．核黃素通常以游離的形態(tài)作為電子穿梭體發(fā)揮作用，即菌體分泌的核黃素在細(xì)胞內(nèi)接受電子變?yōu)檫€原態(tài)，而后還原態(tài)的核黃素通過擴(kuò)散將電子呈遞至電子受體，自身又變回氧化態(tài)，以此過程不斷循環(huán)[18]．也有研究發(fā)現(xiàn)核黃素在促進(jìn)菌株電子傳遞的過程中并非是單一的發(fā)揮作用，而是可以作為細(xì)胞色素c和MtrC的輔因子以促進(jìn)電子傳遞[11,19-20]．

本實(shí)驗(yàn)以分離自海洋沉積物中的菌株Clostridiumsp. LQ25為研究對(duì)象，分析電子穿梭體核黃素對(duì)菌株異化鐵還原性質(zhì)的影響及菌株分泌核黃素的規(guī)律，旨在為探究發(fā)酵型異化鐵還原細(xì)菌的胞外電子傳遞機(jī)制提供新的思路．

1 材料與方法

1.1 菌株來源

菌株Clostridiumsp. LQ25[21]由本課題組成員從海洋沉積物中分離得到，GenBank號(hào)為MK156151．

1.2 培養(yǎng)方法

培養(yǎng)基成分：葡萄糖20.0g/L，L-半胱氨酸0.5g/L，NaCl 4.0g/L，MgCl20.1g/L，K2HPO41.5g/L，酵母粉1.0g/L，胰蛋白胨4.0g/L，200mmol/L氫氧化鐵溶液25mL/L．

200mmol/L 氫氧化鐵溶液：稱取 16.23g FeCl3·6H2O溶于666mL去離子水中，待完全溶解后使用5mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0±0.5，最后用去離子水反復(fù)洗滌沉淀并定容至300mL，裝瓶備用.

培養(yǎng)條件：pH 7.0±0.5，溫度35℃，置于厭氧罐(英國(guó)Oxoid AnaeroJar公司)培養(yǎng)36h．

1.3 異化Fe(Ⅲ)還原性質(zhì)

以氫氧化鐵為電子受體，厭氧培養(yǎng)菌株50h，間隔取樣，測(cè)定累積Fe(Ⅱ)濃度，并以此表示菌株LQ25鐵還原能力，分析菌株LQ25異化鐵還原性質(zhì).

1.4 電子穿梭體

外源核黃素：設(shè)置核黃素濃度梯度為0、20、40、80、100、120、140mg/L，菌株LQ25分別接種于上述含不同濃度電子穿梭體的培養(yǎng)液中，3組平行樣．厭氧培養(yǎng)24h后，測(cè)定累積Fe(Ⅱ)濃度，分析外源電子穿梭體對(duì)異化鐵還原細(xì)菌LQ25鐵還原性質(zhì)的影響．

內(nèi)源核黃素：核黃素避光取樣，7600g離心15min，用0.22μm濾膜過濾．間隔時(shí)間取樣，分別測(cè)定菌體密度A600和核黃素分泌量，分析菌體分泌核黃素的規(guī)律．

1.5 測(cè)定方法

菌株生長(zhǎng)測(cè)定：分光光度計(jì)測(cè)定菌液A600，以此值表示菌株生長(zhǎng)狀況．

Fe(Ⅱ)濃度測(cè)定：采用菲洛嗪(Ferrozine)分光光度法測(cè)定[22]．取0.1mL培養(yǎng)后菌液的上清液，加入到5.0mL菲洛嗪溶液(0.4g菲洛嗪、4.766g 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶于400mL蒸餾水)中，振蕩15s，靜置30min使其顯色完全，分光光度計(jì)測(cè)定A562．

核黃素含量的測(cè)定：采用核黃素?zé)晒夥止夤舛确y(cè)定[23]．使用日立F-7100型熒光分光光度計(jì)測(cè)定樣品中核黃素在發(fā)射波長(zhǎng)處的相對(duì)熒光強(qiáng)度．首先配制2.5μg/mL的核黃素標(biāo)準(zhǔn)品，用0.22μm濾膜過濾后避光備用，然后掃描標(biāo)準(zhǔn)品的激發(fā)光譜，并從中找出吸收波長(zhǎng)作為激發(fā)波長(zhǎng)；設(shè)置儀器激發(fā)波長(zhǎng)，掃描標(biāo)準(zhǔn)品的發(fā)射光譜，從中找出吸收最強(qiáng)時(shí)對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)作為發(fā)射波長(zhǎng)；設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)后，在460～600nm的范圍內(nèi)測(cè)定樣品在發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度．利用相對(duì)熒光強(qiáng)度表示核黃素的含量．首先直接測(cè)定樣品在發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度，記為EM1；接著在樣品中添加0.1mL 20%連二亞硫酸鈉溶液，再次測(cè)定樣品在發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度，記為EM2；最終樣品發(fā)射波長(zhǎng)的相對(duì)熒光強(qiáng)度為EM＝EM1－EM2．

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行樣，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”；使用t檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異進(jìn)行顯著性分析，*表示有顯著差異(P＜0.05)，**表示有極顯著差異(P＜0.01)．

2 結(jié)果與討論

2.1 外源核黃素對(duì)菌株LQ25異化鐵還原的影響

不同質(zhì)量濃度的外源核黃素(VB2)對(duì)菌株LQ25異化鐵還原的影響如圖1所示．在設(shè)置的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，核黃素的添加均能促進(jìn)菌株LQ25的Fe(Ⅲ)還原能力．與對(duì)照組(無(wú)核黃素添加)相比，實(shí)驗(yàn)組的核黃素質(zhì)量濃度為20mg/L時(shí)，菌株LQ25的Fe(Ⅲ)還原能力無(wú)明顯提高(P＞0.05)；核黃素質(zhì)量濃度為40mg/L時(shí)，菌株LQ25的Fe(Ⅲ)還原能力顯著提高(P＜0.05)；核黃素質(zhì)量濃度在80～120mg/L的范圍內(nèi)，菌株LQ25的Fe(Ⅲ)還原能力被極顯著提高(P＜0.01)；核黃素質(zhì)量濃度為140mg/L時(shí)，菌株LQ25的Fe(Ⅲ)還原能力無(wú)明顯提高(P＞0.05).其中當(dāng)培養(yǎng)基中核黃素質(zhì)量濃度為100mg/L時(shí)，菌株LQ25還原Fe(Ⅲ)的量達(dá)到最高，累積Fe(Ⅱ)濃度為(7.73±0.05)mmol/L，當(dāng)培養(yǎng)基中的核黃素質(zhì)量濃度高于100mg/L時(shí)，菌株LQ25還原Fe(Ⅲ)的量又會(huì)降低．

圖1 不同濃度的外源核黃素(VB2)對(duì)菌株LQ25異化鐵還原的影響Fig. 1 Effect of different concentrations of exogenous riboflavin(VB2)on dissimilation iron reduction of strain LQ25

Fuller等[24]研究發(fā)現(xiàn)鐵還原混合菌群在添加核黃素的培養(yǎng)條件下，其Fe(Ⅱ)濃度比空白組的有所增加，從而推測(cè)核黃素可能對(duì)胞外Fe(Ⅲ)還原作用較大．You等[25]在接種巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)LLD-1的微生物燃料細(xì)胞中加入100nmol/L核黃素后，輸出電壓和輸出電流分別提高了2.8倍和3.7倍，從而證明菌株LLD-1培養(yǎng)液中的核黃素可以作為電子穿梭物，加強(qiáng)菌株LLD-1向電極的電子傳遞．Yang等[16]為了驗(yàn)證核黃素對(duì)噬甲基菌屬(Methylophilussp.)培養(yǎng)過程中電子傳遞作用的影響，比較了添加核黃素組與不加核黃素組的Fe(Ⅲ)還原率，結(jié)果顯示前者的Fe(Ⅲ)還原率提高了33%，這表明Fe(Ⅱ)的增加是由于核黃素促進(jìn)了胞外電子傳遞．Jin等[15]發(fā)現(xiàn)地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)和S. oneidensis的混合培養(yǎng)對(duì)于金屬腐蝕具有協(xié)同作用，后經(jīng)研究證實(shí)是由于菌株S. oneidensis分泌的電子穿梭體核黃素提高了B. licheniformis的細(xì)胞外電子傳遞效率．Moradian等[17]在Cystobasidium slooffiaeJSUX1的培養(yǎng)過程中添加核黃素，其最高輸出電流約為不添加核黃素的3倍，表明核黃素能促進(jìn)電子傳遞過程．

2.2 菌株LQ25分泌核黃素的含量

經(jīng)測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)為425nm．核黃素在520nm處有熒光發(fā)射，但環(huán)境中的血紅素可將其猝滅.Miyuki等[23]通過監(jiān)測(cè)此處的熒光發(fā)射強(qiáng)度的變化，探測(cè)核黃素與蛋白復(fù)合物OmcZ的結(jié)合情況，結(jié)果表明熒光分光光度法可以鑒定出微摩爾級(jí)別的核黃素濃度．在本實(shí)驗(yàn)中，外源核黃素標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)源核黃素樣品的熒光發(fā)射峰對(duì)比如圖2所示．

圖2 外源核黃素標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)源核黃素樣品熒光發(fā)射峰對(duì)比Fig. 2 Comparison of fluorescence emission peak between exogenous riboflavin standard and endogenous riboflavin sample

外源核黃素標(biāo)準(zhǔn)品的熒光發(fā)射峰大約在525nm處，內(nèi)源核黃素樣品的熒光發(fā)射峰在524.5nm左右．此外，實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定了無(wú)生物培養(yǎng)基中的核黃素?zé)晒獍l(fā)射峰，結(jié)果顯示培養(yǎng)基不含有核黃素．這表明培養(yǎng)液中核黃素?zé)晒獍l(fā)射峰是由于菌株LQ25分泌產(chǎn)生的．由此通過測(cè)定525nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度，表示菌株培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的核黃素含量．

2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間下核黃素分泌量變化

菌株LQ25生長(zhǎng)與核黃素分泌量隨時(shí)間的變化如圖3所示．培養(yǎng)0～10h為菌株生長(zhǎng)遲緩期，最大菌體密度A600為0.26±0.01，在此期間未測(cè)出核黃素的熒光發(fā)射峰；培養(yǎng)10～15h為菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，最大菌體密度A600為1.32±0.06，核黃素的相對(duì)熒光強(qiáng)度最高可達(dá)11.30±2.00；培養(yǎng)15～35h為菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定期，最大菌體密度A600為1.41±0.02，核黃素的相對(duì)熒光強(qiáng)度在培養(yǎng)20h時(shí)達(dá)到最高，為49.50±3.92；培養(yǎng)35h后為菌體的衰退期，菌體密度A600降低，核黃素的相對(duì)熒光強(qiáng)度逐漸降低并于40h后熒光發(fā)射峰消失．

圖3 菌株LQ25生長(zhǎng)與核黃素分泌隨時(shí)間的變化Fig. 3 Growth and secretion curve of riboflavin of strain LQ25

由此可見，菌體生長(zhǎng)狀態(tài)和核黃素分泌關(guān)系密切，菌株LQ25在旺盛生長(zhǎng)時(shí)期分泌核黃素，這有利于電子傳遞合成ATP用于自身生長(zhǎng)，隨著菌體生長(zhǎng)減緩，電子傳遞過程減弱，分泌核黃素也減少．Baron等[26]發(fā)現(xiàn)突變體Shewanella oneidensisMR-1(保留編碼核黃素基因)在無(wú)外源核黃素的培養(yǎng)條件下仍能檢測(cè)到存在電子轉(zhuǎn)移，然后使用循環(huán)伏安法確定核黃素添加前后的菌液電位均在同一電位處，以上結(jié)果表明這種電子轉(zhuǎn)移的產(chǎn)生是由菌株自身分泌核黃素導(dǎo)致的．周雨行等[27]研究菌株Shewanella oneidensis的氧化還原特征峰強(qiáng)度變化，其峰強(qiáng)度經(jīng)歷了由弱增強(qiáng)再減弱的過程，這表明微生物的生長(zhǎng)導(dǎo)致大量核黃素產(chǎn)生，電子傳遞速率加快；當(dāng)培養(yǎng)基中的物質(zhì)逐漸耗盡時(shí)，微生物的生長(zhǎng)活性減弱并進(jìn)入生長(zhǎng)后期，電子傳遞過程被削弱，因此氧化還原峰強(qiáng)度開始減?。甋ong等[28]比較Pachysolen tannophilus的生長(zhǎng)和核黃素分泌隨時(shí)間變化的關(guān)系，認(rèn)為菌株P(guān). tannophilus主要在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期分泌核黃素，這與本實(shí)驗(yàn)菌株LQ25的分泌規(guī)律相似．Jain等[29]發(fā)現(xiàn)菌株Shewanella loihicaPV-4在一定時(shí)間內(nèi)，隨著孵育時(shí)間的增加，培養(yǎng)液中核黃素的相對(duì)峰值強(qiáng)度呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)．Tian等[30]研究發(fā)現(xiàn)微生物燃料電池中的蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)DIF1和赤紅球菌(Rhodococcus ruber)DIF2在生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期之前，核黃素濃度不斷增加，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后核黃素濃度又會(huì)降低．

大多數(shù)細(xì)菌可自行分泌核黃素，并且能將核黃素轉(zhuǎn)化為FMN和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，F(xiàn)MN和核黃素可被分泌到胞外，作為電子穿梭體發(fā)揮功能，其濃度高低表征著細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，而FAD主要存在于胞內(nèi)，可作為細(xì)胞裂解的指標(biāo)[30]．由菌株LQ25的生長(zhǎng)曲線可知，在培養(yǎng)的前20h，菌株LQ25大量分泌的核黃素用于胞外電子傳遞以供給生長(zhǎng)，此后由于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等的消耗及生長(zhǎng)環(huán)境中有害分泌物的積累，導(dǎo)致菌株逐漸走向衰亡，因此推測(cè)菌株LQ25分泌的核黃素在培養(yǎng)20h后逐漸分解．此外，實(shí)驗(yàn)未采用避光的黑暗培養(yǎng)，長(zhǎng)時(shí)間的光照也會(huì)促使菌株LQ25分泌的核黃素降解[26]．

2.4 異化鐵培養(yǎng)條件下核黃素分泌量變化

以氫氧化鐵為電子受體，對(duì)菌株LQ25核黃素分泌量的影響進(jìn)行研究，結(jié)果如圖4所示．

圖4 菌株LQ25生長(zhǎng)、核黃素分泌及累積Fe(Ⅱ)濃度隨時(shí)間的變化Fig. 4 Changes of growth，secretion of riboflavin and Fe(Ⅱ) concentration of strain LQ25 with time

由圖4可知：培養(yǎng)前10h，菌株LQ25經(jīng)歷快速繁殖的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在此階段核黃素分泌逐漸增加；10h之后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，20h時(shí)菌體密度A600達(dá)到最大，為2.32±0.05，15h時(shí)培養(yǎng)液中核黃素的相對(duì)熒光強(qiáng)度達(dá)到最高，為56.23±7.93；20h后菌株開始衰退，菌體密度A600降低，核黃素的相對(duì)熒光強(qiáng)度逐漸降低并于35h后熒光發(fā)射峰消失．菌株LQ25在培養(yǎng)過程中分泌積累的核黃素呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)再減弱的變化．在對(duì)照組(無(wú)氫氧化鐵添加)條件下培養(yǎng)20h時(shí)，菌株LQ25中核黃素含量才達(dá)到峰值，20～25h降低51.43%，25～30h降低36.43%；實(shí)驗(yàn)組條件下，菌株LQ25分泌積累的核黃素最高值提前至15h，15～20h降低13.98%，20～25h降低16.32%，25～35h降低39.41%．

對(duì)比實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的核黃素相對(duì)熒光強(qiáng)度最高值，實(shí)驗(yàn)組的是對(duì)照組的1.14倍，實(shí)驗(yàn)組中氫氧化鐵可能作為電子受體促進(jìn)了菌體分泌核黃素．Li等[22]對(duì)菌株Anoxybacter fermentansDY22613T培養(yǎng)液的高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，核黃素確實(shí)在對(duì)數(shù)期產(chǎn)生，添加氫氧化鐵組相比不添加組發(fā)酵產(chǎn)生的核黃素濃度高 2倍．Liu等[31]的研究結(jié)果顯示，在3.8μmol/L苯存在下，微生物不僅保持了完整的細(xì)胞形態(tài)，并且60h還原Fe(Ⅲ)形成Fe(Ⅱ)的量是無(wú)苯條件下的2倍，微生物對(duì)Fe(Ⅲ)還原的促進(jìn)歸因于苯誘導(dǎo)的細(xì)胞膜通透性的增加，促進(jìn)了胞外電子傳遞和核黃素作為電子穿梭因子或輔因子的分泌和釋放.

菌株LQ25還原Fe(Ⅲ)并不是與生長(zhǎng)同時(shí)進(jìn)行的，培養(yǎng)前10h生長(zhǎng)旺盛，但幾乎不進(jìn)行Fe(Ⅲ)還原；培養(yǎng)10～35h時(shí)，菌株LQ25大量進(jìn)行Fe(Ⅲ)還原，35h時(shí)培養(yǎng)液中累積的Fe(Ⅱ)濃度達(dá)到最高值(8.79±0.01)mmol/L；35h后培養(yǎng)液中累積的Fe(Ⅱ)濃度逐漸減少，由此可見Fe(Ⅲ)的還原過程主要是在菌株生長(zhǎng)的后期．

相比對(duì)照組(無(wú)氫氧化鐵添加)，菌株LQ25在35h達(dá)到生長(zhǎng)高峰，氫氧化鐵的加入使得菌株LQ25在20h就達(dá)到菌體密度最大值，且此刻菌體密度是未添加氫氧化鐵的3.27倍．宋文杰等[32]在腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)的培養(yǎng)基中加入檸檬酸鐵，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Fe(Ⅱ)濃度與其生物活性存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系，表明Fe(Ⅲ)還原與微生物的生長(zhǎng)耦合在一起．劉洪艷等[33]發(fā)現(xiàn)在菌株Klebsiellasp. KB52的生長(zhǎng)過程中，無(wú)論添加不可溶性電子受體氫氧化鐵還是添加可溶性電子受體檸檬酸鐵，菌株KB52的細(xì)胞生長(zhǎng)均高于未添加電子受體的對(duì)照組．

菌體分泌核黃素和還原Fe(Ⅲ)密切相關(guān)，核黃素的分泌能達(dá)到最大積累量主要是在菌體培養(yǎng)前期，還原Fe(Ⅲ)這一過程主要是在培養(yǎng)后期進(jìn)行．這可能是由于核黃素作為電子穿梭體，將菌體通過分解葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)獲得的電子從胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞外，轉(zhuǎn)移到胞外的電子可用于不溶性氫氧化鐵的還原，從而使得培養(yǎng)基中會(huì)在菌體培養(yǎng)的后期大量積累Fe(Ⅱ).Dereven’kov等[34]在水鈷胺素(H2OCbl)和NADH的混合物中添加的核黃素顯著加速了Cbl(Ⅱ)的積累，并且還原速率與核黃素濃度呈線性關(guān)系，證明了核黃素對(duì)NADH向水合鈷胺電子轉(zhuǎn)移的催化作用．周雨行等[27]在探究S. oneidensis的鐵硫還原過程時(shí)發(fā)現(xiàn)，核黃素的加入將菌株的鐵硫轉(zhuǎn)化能力提高了3倍，從而推測(cè)核黃素是作為電子穿梭體參與到菌株的電子傳遞過程中，并將電子從乙酸鹽呈遞給單質(zhì)硫和黃鉀鐵礬．Zhou等[35]在S. oneidensisMR-1降解磺胺甲惡唑(SMX)的過程中加入了不同濃度的核黃素，其最大降解率能達(dá)到95.3%，從核黃素介導(dǎo)的SMX降解和鐵還原的總體性能看，SMX的降解率隨著鐵還原的加強(qiáng)而逐漸增加．

2.5 外源核黃素對(duì)菌株LQ25異化鐵還原性質(zhì)分析

外源核黃素對(duì)菌株LQ25異化鐵還原性質(zhì)分析結(jié)果如圖5所示．培養(yǎng)20h，菌株LQ25的菌體密度相比對(duì)照組(無(wú)氫氧化鐵添加)的菌體密度無(wú)顯著變化(P＞0.05)；培養(yǎng)25h，菌株LQ25累積Fe(Ⅱ)濃度為(9.05±0.02)mmol/L，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株LQ25累積Fe(Ⅱ)濃度還將持續(xù)上升．

圖5 外源核黃素對(duì)菌株LQ25異化鐵還原性質(zhì)分析Fig. 5 Dissimilated iron reduction properties of strain LQ25 by riboflavin

外源核黃素對(duì)菌株LQ25的生長(zhǎng)幾乎無(wú)影響，但能促進(jìn)菌株LQ25進(jìn)行異化鐵還原．Yarlagadda等[36]也證明外源電子穿梭體對(duì)菌株Clostridiumsp. BC1的生長(zhǎng)幾乎沒有影響．List等[37]分析不同來源的電子穿梭體對(duì)菌株丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的異化鐵還原性的影響，結(jié)果表明外源蒽醌-2-磺酸(AQS)和內(nèi)源核黃素均能增強(qiáng)菌株的異化鐵還原能力，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相似．

3 結(jié) 語(yǔ)

(1)外源核黃素可以促進(jìn)菌株LQ25的異化鐵還原能力，當(dāng)核黃素質(zhì)量濃度為100mg/L時(shí)，異化鐵還原能力最高，相比對(duì)照組提高了63.26%．

(2)在設(shè)定的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，通過熒光分光光度法測(cè)定核黃素，菌株LQ25具有分泌核黃素的能力，最高相對(duì)熒光強(qiáng)度可達(dá)56.23±7.93．

(3)菌株LQ25核黃素分泌量受到培養(yǎng)時(shí)間、Fe(Ⅲ)濃度等因素的影響．目前對(duì)呼吸型異化鐵還原細(xì)菌胞外電子傳遞機(jī)制的研究較為深入，相比之下，發(fā)酵型異化鐵還原細(xì)菌胞外電子傳遞機(jī)制還有待進(jìn)一步的揭示．本研究結(jié)果為豐富發(fā)酵型異化鐵還原細(xì)菌胞外電子傳遞機(jī)制提供了理論支持．