陳春梅，顏?zhàn)右遥伱?，崔亞?，陳慧蓮，徐 黃，苗成林，張 奕，謝 紅，王 惠,王 霞△

(1.四川省眉山市婦幼保健院 a.檢驗(yàn)科，b.院長(zhǎng)辦公室，c.醫(yī)務(wù)科，四川 眉山 620000；2. 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610041)

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae, S.pn)是革蘭氏陽(yáng)性菌，有莢膜，可定植在人的鼻咽部，作為一種條件致病菌，通常情況下并不致病。當(dāng)定植的環(huán)境發(fā)生變化，如機(jī)體抵抗力下降、呼吸道病毒感染或年老體弱等情況下，S.pn將透過(guò)黏膜防御體系發(fā)生侵襲性感染[1]。根據(jù)感染范圍，肺炎鏈球菌相關(guān)性疾病(pneumococcal disease, PD)分為侵襲性肺炎鏈球菌相關(guān)性疾病(invasive pneumococcal disease, IPD)和非侵襲性肺炎鏈球菌相關(guān)性疾病(noninvasive pneumococcal disease，NIPD)。2018年公布的最新研究數(shù)據(jù)顯示，全球約有50萬(wàn)名小于5歲的兒童感染S.pn 死亡，且發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率和死亡率高于發(fā)達(dá)國(guó)家。S.pn 也是引起中國(guó)嬰幼兒和老年人發(fā)病和死亡的重要病因，全球小于5歲兒童PD病例數(shù)中，中國(guó)位列第二，占全球總病例數(shù)的l2%[1]?；赑D 在全球范圍內(nèi)的高疾病負(fù)擔(dān)，WHO 將其列為極高度推薦優(yōu)先使用疫苗預(yù)防的疾病，建議并強(qiáng)調(diào)應(yīng)將S.pn 疫苗優(yōu)先納入各國(guó)免疫計(jì)劃[1]。本文回顧現(xiàn)有S.pn 疫苗研發(fā)和使用情況。

1 莢膜多糖與已上市疫苗

肺炎鏈球菌莢膜多糖是致病的主要毒力因子，不同莢膜血清型的S.pn 存活能力和致病力不同；根據(jù)莢膜多糖的組成差異，S.pn 可分為多種血清型，目前已明確的血清型有100種[2]。目前已上市應(yīng)用的疫苗以莢膜多糖為基礎(chǔ)，包括肺炎鏈球菌多糖疫苗(pneumococcal polysaccharide-based vaccine，PPVs)和肺炎鏈球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗(pneumococcal conjugate vaccines，PCVs)。

PPV-23由23種不同的莢膜多糖抗原純化制備，可對(duì)疫苗覆蓋范圍內(nèi)S.pn 血清型提供保護(hù)作用，即血清1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型，據(jù)統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)有疫苗所包含的血清型覆蓋了>85%的致病血清型[1]。然而，PPV-23為非T細(xì)胞依賴性抗原，在<2歲嬰幼兒體內(nèi)難以產(chǎn)生有效的保護(hù)性抗體。因此，PPV-23僅推薦65歲以上人群或2～65歲罹患慢性心血管疾病和糖尿病的人群使用[3]。

PCVs將莢膜多糖與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，莢膜多糖抗原由非T細(xì)胞依賴性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門細(xì)胞依賴抗原，使嬰幼兒在免疫后能產(chǎn)生良好的抗體應(yīng)答，且能產(chǎn)生記憶應(yīng)答。已上市使用的PCVs 包括PCV-7(血清4、6B、9V、14、18C、19F和23F型)、PCV-10(血清1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F型)和PCV-13(S.pn血清1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型)，包含更多血清型的PCV15,PCV20(20vPnC)處于臨床III期研究，然而PCVs 存在血清型覆蓋有限、制備過(guò)程復(fù)雜、成本價(jià)格高、非疫苗血清型替換等缺點(diǎn)[4]。

另外，在長(zhǎng)期推進(jìn)PCVs 疫苗接種的地區(qū)，出現(xiàn)了“血清型置換”現(xiàn)象-即疫苗覆蓋之外的血清型逐漸在臨床致病株中占據(jù)流行的優(yōu)勢(shì)地位，且新流行的血清型菌株并沒(méi)有喪失相關(guān)毒力特征[5]。因此，在越來(lái)越復(fù)雜的疫苗配方中添加血清型并不是控制抗生素耐藥性威脅的長(zhǎng)期解決方案，我們迫切的需要研發(fā)一種有效的、經(jīng)濟(jì)的、能發(fā)揮廣譜保護(hù)作用的肺炎鏈球菌疫苗。

2 具有疫苗潛力的候選蛋白

蛋白疫苗作為S.pn 第三代疫苗，具有較好的免疫原性和高度的保守性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生非血清型依賴的免疫保護(hù)作用，刺激T細(xì)胞誘發(fā)免疫記憶反應(yīng)，同時(shí)激活黏膜免疫和系統(tǒng)免疫反應(yīng)。此外，蛋白疫苗制備簡(jiǎn)便，成本低，易于規(guī)?；a(chǎn)，因此，蛋白疫苗是目前S.pn 疫苗研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。理想的S.pn 蛋白疫苗應(yīng)具備以下特點(diǎn)：①高度的保守性，并具有較好的免疫原性；②在S.pn 表面表達(dá)，或是通過(guò)分泌方式表達(dá)；③影響S.pn 黏附或定植關(guān)鍵毒力因子[6,7]。

2.1 肺炎鏈球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A，PspA)PspA是一種膽堿結(jié)合蛋白，存在于幾乎所有S.pn 菌株的細(xì)胞表面，可抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的肺炎鏈球菌清除。根據(jù)PspA 暴露在表面的N端結(jié)構(gòu)域和氨基酸序列變異，可分為三個(gè)家族和六個(gè)類群；其中，98%的S.pn 臨床分離株來(lái)自家族1(第1和2類群)和家族2(第3～5類群)[8]。PspA 具有多種生物學(xué)功能，包括抵抗乳鐵蛋白殺傷的抗性[9]，以及在空間位點(diǎn)上阻斷宿主對(duì)菌體表面磷酸膽堿殘基的識(shí)別，抵抗C 反應(yīng)蛋白和補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[10]。完整的PspA 蛋白在動(dòng)物模型中具有跨菌株的交叉保護(hù)效果，可以抵抗多種血清的S.pn 定植和侵襲性感染[11,12]；然而，由于PspA 氨基酸序列中包含與人類心臟肌球蛋白同源的序列，人們擔(dān)心使用完整的PspA 蛋白將誘發(fā)針對(duì)宿主心肌細(xì)胞的自身免疫反應(yīng)；因此，開發(fā)基于PspA 疫苗的新策略將集中在PspA 中不包含與肌球蛋白任何同源性的序列區(qū)域[13]。

PspA 的N端有一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)，分為A、B、C3個(gè)區(qū)域，B區(qū)域表現(xiàn)出血清學(xué)差異，被稱為進(jìn)化支區(qū)域，共分為5型。Akbari 等人構(gòu)建了一種基于PspA 的重組蛋白疫苗(PspAB1-5)，將所有5種B區(qū)域氨基酸序列融合到一起，并證實(shí)了該疫苗將能夠針對(duì)多種血清型S.pn 提供顯著的保護(hù)[14]。該型疫苗的初步成功，表明融合關(guān)鍵蛋白抗原表位的重組融合蛋白方案，可以克服多糖靶位疫苗的局限，為S.pn 蛋白疫苗的研發(fā)提供了新的可能。

2.2 膽堿結(jié)合蛋白A(choline binding protein A，CbpA/PspC)CbpA/PspC是一種細(xì)胞壁相關(guān)的表面蛋白，存在于幾乎所有S.pn 菌株表面，PspC 在細(xì)菌粘附、侵襲和補(bǔ)體逃逸中起著重要作用，是重要的毒力因子[15]。它通過(guò)與分泌型免疫球蛋白A(sIgA)和層粘連素-整合素受體相互作用而發(fā)揮粘連素的作用[16]。PspC能夠直接與補(bǔ)體組分C3結(jié)合，并將因子H 招募到細(xì)菌表面，導(dǎo)致補(bǔ)體激活減少。

在動(dòng)物感染模型中，PspC 具有強(qiáng)免疫原性，抗PspC 特異性抗體能夠保護(hù)小鼠抵抗S.pn 定植和侵襲性感染。盡管PspC 基因存在于幾乎所有的肺炎鏈球菌中，但它具有高度多態(tài)性，使PspC 變異體在結(jié)合因子H 的能力上存在差異。據(jù)報(bào)道，表達(dá)與抗體特異性匹配的PspC 變異體的肺炎鏈球菌菌株能被有效地殺死，但抗體對(duì)不匹配的PspC變異體無(wú)效[17]。由于PspC蛋白序列的高度多樣性，PspC全長(zhǎng)蛋白可能不能作為理想的交叉保護(hù)性免疫疫苗。

2.3 肺炎鏈球菌溶血素(pneumolysin，Ply)Ply是一種膽固醇依賴性的胞膜成孔蛋白毒素，幾乎在所有S.pn 菌株中均有表達(dá)[18]；其生物學(xué)結(jié)構(gòu)定位在細(xì)胞壁，亦可通過(guò)輔助Sec 系統(tǒng)分泌至菌體外發(fā)揮毒性作用[19]。作為S.pn 最有力的毒力決定因子，Ply 幾乎可以殺死任何宿主細(xì)胞。同時(shí)，Ply 具有高度的保守性和抗原性，PD 患者會(huì)針對(duì)Ply 產(chǎn)生高滴度抗體[20]。研究人員通過(guò)基因編輯和基因重組技術(shù)，對(duì)Ply 第146位的丙氨酸進(jìn)行敲除后，極大減弱了Ply 的蛋白毒性；并將減毒Ply 作為融合蛋白抗原組分，證實(shí)了DanJ-ΔA146Ply 可以減輕S.pn 在小鼠肺部的定植數(shù)量，并可延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間，具有一定的蛋白疫苗潛力[21,22]。

2.4 組氨酸三聯(lián)體(fragile histidine triad ,Pht)Pht蛋白家族包括四個(gè)高度保守的菌體表面暴露蛋白(PhtA、PhtB、PhtD和PhtE)，其共同特征是具有一個(gè)特征性的三組氨酸基序(HXXHXH)，在氨基酸序列中重復(fù)5～6次。Pht 氨基酸序列高度保守，對(duì)鋅離子具有高親和力，發(fā)揮黏附素作用；鼻咽部和肺部的高鋅離子水平可以增加S.pn 的黏附面積和數(shù)量[23]。其中，PhtD 變異性最低，并且在幾乎所有的S.pn 菌株表面表達(dá)，在不同菌株中具有大于97%的同源性，被認(rèn)為是具有疫苗潛力的蛋白抗原。

在小鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型中，PhtD 疫苗可以抵抗S.pn 菌體對(duì)鼻咽部和肺部的定植和侵襲；然而，這種保護(hù)作用具有血清型依賴性，PhtD 抗血清可以抵抗血清 3、4、6A 、6B 型菌株感染小鼠，但無(wú)法抵抗血清1、5型菌株的侵襲[24，25]。在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，PhtD 重組蛋白疫苗具有足夠的安全性和免疫原性，并且在加強(qiáng)免疫后可以顯著提升特異性抗體效價(jià)[26]；同時(shí)，人類抗PhtD 特異性抗體可以在小鼠模型中針對(duì)血清3型菌株發(fā)揮被動(dòng)保護(hù)作用[27]。

2.5 延長(zhǎng)因子Tu(elongation factor,EF-Tu)EF-Tu是肺炎克雷伯菌、化膿性鏈球菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌等致病菌中最保守、最普遍的表達(dá)因子,具有分子伴侶活性，參與肽的生物合成、蛋白質(zhì)折疊和細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)。Nagai 等研制了一種僅含有S.pn D39菌株中EF-Tu 全長(zhǎng)蛋白的重組蛋白疫苗(rEF-Tu)[28]。rEF-Tu 免疫后，小鼠血清中細(xì)胞因子的濃度顯著升高，包括IL-6、TNF-α、IFN-y和IL-17。此外，在小鼠模型中還觀察到脾細(xì)胞中CD4+T 細(xì)胞數(shù)量的增加以及IgG 抗體亞類IgG1 和IgG2a 抗體的增加。抗rEF-Tu 血清可增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)S.pn 的吞噬活性，且與S.pn 血清型無(wú)關(guān)；且rEF-Tu免疫后小鼠可抵抗血清2型和血清15A型(MDR菌株，multidrug resistance)S.pn 菌株的致死劑量攻擊[28]。因此，肺炎鏈球菌EF-Tu 蛋白可能是一種具有疫苗潛力的蛋白抗原，并具有跨S.pn 血清型的保護(hù)作用。

3 全菌體疫苗(whole cell vaccines，WCVs)

WCVs包含菌體所有類型抗原，而不需要純化單個(gè)組分。因此，它可以在發(fā)展中國(guó)家中作為PPVs 和PCVs 的經(jīng)濟(jì)替代品。研究表明，S.pn 滅活全菌體和減毒全菌體疫苗能夠通過(guò)體液免疫和細(xì)胞免疫途徑，提供不依賴于血清型的保護(hù)作用[29]。但是目前全菌體疫苗仍存在很多隱患，疫苗的保護(hù)效力受到滅活途徑、給藥途徑、免疫途徑等多因素的影響，仍需更多研究去探索。

Malley 等利用S.pn 菌株RX1 構(gòu)建了一種滅活全菌體疫苗RX1ΔlytA ，它是由血清2型菌株衍生而來(lái)的一種不表達(dá)莢膜的突變體，并敲除了毒力基因lytA[30]。在動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)中，搭配霍亂毒素(cholera toxin,CT)作為佐劑進(jìn)行鼻內(nèi)黏膜接種，可以在小鼠和大鼠模型中，提供針對(duì)S.pn 血清6B 、3型的保護(hù)作用，減少S.pn 鼻咽部定植并延長(zhǎng)生存時(shí)間[30]；搭配霍亂毒素結(jié)合亞基(Cholera toxin binds subunits,CTB)作為佐劑免疫小鼠，可顯著降低S.pn 血清6B 、14、23F 型S.pn 菌株在小鼠鼻咽部和中耳部的定植數(shù)量[31]。Lu 等為減少疫苗株自溶以提升菌體產(chǎn)量，對(duì)ply 基因進(jìn)行了修飾，并使用卡那霉素抗性基因替換整個(gè)lytA 基因，構(gòu)建了RM200疫苗株(RX1EPdTΔlytA)。研究表明，RM200 降低了S.pn 血6B 型在小鼠鼻咽部的定植， 并能激活I(lǐng)L-17A 信號(hào)通路，具有良好的保護(hù)作用[32]。臨床前研究表明，以氫氧化鋁為佐劑的RM200 可誘導(dǎo)小鼠血清中IgG 抗體效價(jià)顯著升高和IL-17信號(hào)通路效應(yīng)[33]，可進(jìn)展到臨床試驗(yàn)中進(jìn)行深入評(píng)估。Kim 等基于S.pn D39 菌株，敲除其pep27基因和comD基因，制備了一種無(wú)法黏附或定植肺組織、血液和腦組織的減毒全菌體疫苗D39Δpep27ΔcomD ，且該型減毒株無(wú)法恢復(fù)為野生型表型[34]。研究表明，D39Δpep27ΔcomD 免疫后小鼠的血清中，針對(duì)D39 株的IgG 抗體效價(jià)顯著升高，同時(shí)，可誘發(fā)抗PspA 特異性IgG 抗體；該減毒疫苗顯著延長(zhǎng)了小鼠遭到異源S.pn 菌株攻擊后的生存時(shí)間，并且能夠誘導(dǎo)跨血清型的的肺部菌體清除。同時(shí)，D39Δpep27ΔcomD 在免疫功能正常和異常小鼠體內(nèi)的生物安全性也得到驗(yàn)證，表明其可能作為全菌體疫苗的潛力[34]。

4 肺炎球菌納米疫苗

通常而言，單獨(dú)的蛋白作為疫苗候選因子，往往因其免疫原性不高，難以有效刺激宿主發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，常常輔以佐劑并以肌肉注射的方式接種。但是，肌肉注射難以誘發(fā)在上呼吸道黏膜的sIgA 抗體生成，無(wú)法在S.pn 定植第一步提供保護(hù)作用；因此，需要利用適當(dāng)?shù)淖魟┗蛎庖哌f送系統(tǒng)，通過(guò)鼻腔或口腔黏膜途徑，促進(jìn)抗原的攝取并延長(zhǎng)抗原的效應(yīng)性。

細(xì)菌樣顆粒(Bacterioid particles,BLPs)是由食品級(jí)乳酸乳球菌通過(guò)簡(jiǎn)單的熱酸處理制成，形狀和大小與細(xì)菌相似(0.5～5 μm)，可作為免疫激動(dòng)劑應(yīng)用于黏膜免疫。Wang 等開發(fā)了一種基于BLP 遞送系統(tǒng)的新型PspA 蛋白疫苗，PspA 通過(guò)與BLP 中蛋白錨點(diǎn)PA 相互作用而進(jìn)行表面結(jié)合[35]。在小鼠模型中，可以抵抗S.pn 感染而發(fā)揮保護(hù)作用。在此基礎(chǔ)上，Lu 等將PspA 家族1和家族2進(jìn)行重組融合表達(dá)，可在小鼠模型中誘導(dǎo)更高水平的血清特異性IgG 抗體和黏膜特異性sIgA 抗體的表達(dá)，并能防止來(lái)自家族1和家族2的S.pn 菌株對(duì)小鼠的致死性呼吸系統(tǒng)攻擊[36]。

殼聚糖是一種無(wú)毒、可生物降解、生物相容的天然多糖，被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)為安全的佐劑和疫苗遞送系統(tǒng)，能夠提高肽類的疫苗的免疫原性并誘導(dǎo)以IgG2a 為主的體液免疫反應(yīng)。Xu 等使用殼聚糖遞送PsaA 蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)黏膜免疫，可誘導(dǎo)細(xì)胞因子IFN-γ 、IL-17A 、IL-4 和特異性IgG 、sIgA 抗體效應(yīng)水平的顯著提升；同時(shí)，可顯著延長(zhǎng)小鼠在遭受S.pn 血清3、14型菌株致死性攻擊后的生存時(shí)間[37]。Haryono 等使用殼聚糖遞送PCV13 疫苗，相較于Quil-A 佐劑，可誘導(dǎo)IgG1、IgG2a、IgG2b和 IgG3抗體效價(jià)的顯著提升[38]。

DOTAP/DC-chol 脂質(zhì)體屬于陽(yáng)離子脂質(zhì)體，在人體中具有生物相容性和可生物降解性，其大小、表面電荷和化學(xué)成分是作為疫苗遞送系統(tǒng)時(shí)需要考慮的重要因素。Tada 等使用 DOTAP/DC-chol 脂質(zhì)體搭載PspA 蛋白，向小鼠鼻內(nèi)黏膜的樹突狀細(xì)胞遞送抗原，可對(duì)小鼠之后遭受的致死性S.pn 攻擊提供保護(hù)作用，延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間；該研究結(jié)果表明，DOTAP/DC-chol 脂質(zhì)體可能是S.pn 疫苗經(jīng)鼻腔給藥的潛在佐劑[39]。

5 結(jié)論及展望

一個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，肺炎鏈球菌相關(guān)性疾病在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率和死亡率，特別是在兒童、老年和免疫功能低下的人群中，接種S.pn 疫苗成為了防治PD 的最有效手段。當(dāng)前，由于免疫原性不強(qiáng)、保護(hù)范圍局限、誘發(fā)流行株血清型置換、制備工藝成本較高等因素，限制了已上市S.pn 疫苗 PPV-23 和PCV-13 的應(yīng)用，亟需研發(fā)和生產(chǎn)新型S.pn 疫苗。目前科研人員正從蛋白疫苗、全菌體疫苗和新型材料結(jié)合疫苗等方面，探索新型S.pn 免疫策略，以尋找兼顧免疫原性強(qiáng)、非血清型依賴、廣譜菌株保護(hù)、生產(chǎn)成本低的解決方案。相信在不久的將來(lái)，市面上將出現(xiàn)多種新型S.pn 疫苗，以彌補(bǔ)現(xiàn)有疫苗的劣勢(shì)，從多途徑抵抗PD 在全球范圍內(nèi)的流行。