張 偉，劉文世 ，呂文靜，花 穎，鄭冬冬，黃 榮，李曉飛***

(1 南通大學附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，南通 226001；2 南通大學醫(yī)學院；3 福建省廈門市第五醫(yī)院心血管內(nèi)科)

先天性心臟病(congenital heart disease,CHD)是胚胎早期心臟血管發(fā)育異常或障礙所致心血管畸形，在世界范圍內(nèi)影響0.8%～1.2%的活產(chǎn)嬰兒[1]。肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一種公認的CHD 嚴重并發(fā)癥，其特點在于內(nèi)皮細胞功能障礙和炎癥介質(zhì)失衡是死亡的主要原因。而早期準確的診斷是提高總體存活率的關(guān)鍵。目前，右心導管檢查是診斷PAH 的金標準，但因其為有創(chuàng)檢查且需住院治療費用較高，所以無法用于PAH 患者的長期隨訪及反復評估。臨床上多采用經(jīng)胸超聲心動圖作為右心導管檢查的替代方法，其通過三尖瓣反流速度來估算肺動脈收縮壓(pulmonary artery systolic pressure,PASP)，弊端是無法直接測量平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial pressure,PAPm)和肺血管阻力(pulmonary vascular resistance,PVR)，不適合篩查輕度無癥狀的PAH，易發(fā)生漏診。盡管已經(jīng)在PAH中已探索了多種生物標志物[2]，但只有B 型利鈉肽(B type natriuretic peptide,BNP)和N 末端前體腦利鈉肽是常規(guī)實踐以及臨床試驗中廣泛使用的僅有的生物標志物[3]，但其診斷特異性不高。研究[4]表明，聯(lián)合使用多種生物標志物比單一的生物標志物具有更大的診斷及預后價值，因此，本課題組一直尋找一些微創(chuàng)、客觀、高效的生物標志物用于CHD-PAH 患者的早期聯(lián)合診斷及嚴重程度的評估。

炎癥信號通路激活及內(nèi)皮細胞功能障礙在CHD-PAH 中起重要作用。白細胞介素-32(interleukin-32,IL-32)最初被稱為NK4 轉(zhuǎn)錄本，主要由病原體和促炎性細胞因子[IL-2、IL-12、IL-18、IL-1β 和γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)等]誘導，可進一步調(diào)節(jié)包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-6 或IL-1β 在內(nèi)的等多種炎癥途徑，是一種新型促炎性細胞因子，在最近一項包含18 例系統(tǒng)性硬化癥相關(guān)PAH 和15 例特發(fā)性PAH患者的研究[5]指出，血清IL-32 可能是篩查WHO 第Ⅰ類PAH 患者的有效生物標志物。然而，在CHD 等Ⅰ類PAH 患者中，IL-32 是否可以作為單獨的生物標記物進行早期診斷和評估病情仍需進一步驗證。

結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)是CCN 家族成員之一，是一種富含半胱氨酸，分子質(zhì)量為34～38 ku 的分泌肽，參與創(chuàng)傷修復，血管生成，細胞增殖、遷移及分化等多種病理生理過程。E.HELLA 等[6]研究發(fā)現(xiàn)兒童CHD-PAH 患者的血漿CTGF 水平高于單純CHD 患兒及對照組，且與PAPm 和PVR 呈正相關(guān)，表明血漿CTGF 對兒童CHD-PAH 具有良好的診斷和預測價值。但考慮到兒童和成人PAH 在血管的結(jié)構(gòu)及功能、病程的長短、靶向藥物治療的反應性等方面存在明顯差異，CTGF 能否作為CHD-PAH 患者的生物標志物還有待進一步驗證。本研究將檢測CTGF、IL-32 在CHDPAH 中表達量并研究其診斷價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 觀察組納入2019 年1 月—2021 年6 月收住于南通大學附屬醫(yī)院的CHD 患者52 例，其中房間隔缺損40 例，動脈導管未閉10 例，室間隔缺損2 例。根據(jù)右心導管測定的PAPm 將其分為CHD-PAH 組(PAPm≥25 mmHg)、CHD 組(PAPm ＜25 mmHg)。納入標準：(1)年齡＞18 歲；(2)診斷為CHD。排除標準：(1)其他原因?qū)е碌姆胃邏海?2)其他原因引起的PAH；(3)全麻手術(shù)者；(4)嚴重的肝腎功能不全；(5)感染性疾病；(6)惡性腫瘤；(7)其他可能影響血清IL-32、血漿CTGF 水平的疾??；(8)PAH 靶向藥物治療者。對照組納入同期于南通大學附屬醫(yī)院體檢的健康成人25 名(根據(jù)觀察組年齡、性別等構(gòu)成比將對照組分層，每層隨機抽取健康成年人)。納入標準：(1)年齡＞18 歲；(2)超聲心動圖測得的PASP 在正常范圍之內(nèi)。排除標準：(1)診斷為CHD；(2)嚴重的肝腎功能不全；(3)感染性疾?。?4)惡性腫瘤；(5)其他可能影響血清IL-32、血漿CTGF 水平的疾?。?6)合并其他可能引起PAH 的情況。本研究已獲得南通大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準(2016-52)，受試者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 臨床資料 收集觀察組CHD 患者的一般資料，包括：年齡、性別、身高、體質(zhì)量，入院后完善血常規(guī)、肝腎功能、血電解質(zhì)、血糖、血脂、BNP、血氣分析、血沉、心肌標志物、超聲心動圖、胸部CT 等，記錄右心導管術(shù)測得的血流動力學參數(shù)(PASP、PAPm、PVR 等)。對照組主要收集年齡、性別、身高、體質(zhì)量、血常規(guī)、血生化、超聲心動圖等信息。

1.3 檢測方法 觀察組患者入院后次日清晨(無藥物治療)，在空腹狀態(tài)下無菌操作抽取肘正中靜脈血裝入一次性抗凝管或血清管，于2 h 內(nèi)3 000 r/min 離心10 min，收集上清液，保存于-80 ℃超低溫冰箱。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測各組血清IL-32 及血漿CTGF 的水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用IBM SPSS Statistics 26.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。若不符合正態(tài)分布，計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距(IQR)表示，兩組間數(shù)據(jù)的比較，采用Mann-Whitney U 檢驗，多組間數(shù)據(jù)的比較，采用Kruskal-Wallis 檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 精確檢驗。Spearman 秩相關(guān)分析用于變量之間的相關(guān)性分析。根據(jù)血清中IL-32、血漿CTGF 水平繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC 曲線)。多因素Logistic 回歸分析以篩選CHDPAH 的獨立危險因素。Graphpad Prism 5 用于繪制圖片，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料及IL-32 和CTGF 水平比較 3 組左心房內(nèi)徑、左心室收縮末、舒張末內(nèi)徑、左心室射血分數(shù)、紅細胞分布寬度、BNP、PAPm、PASP、混合靜脈血氧飽和度(mixed venous oxygen saturation,SvO2)以及PVR 的差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)。而各組在性別構(gòu)成、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、肌酐、血糖、肺體循環(huán)血量之比(Qp/Qs)等方面差異均無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)，見表1。3 組IL-32和CTGF 水平比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，CHD-PAH 組較CHD 組及對照組顯著升高，見表1。

表1 各組臨床資料比較(n,%,,IQR)

表1 各組臨床資料比較(n,%,,IQR)

注：與CHD-PAH 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.2 相關(guān)性分析 CHD 患者血清IL-32 水平與PAPm、PASP 呈正相關(guān)(r=0.376、0.131,P＜0.01)，而與BNP、PVR、SvO2、Qp/Qs 無相關(guān)性。CHD 患者的血漿CTGF 水平與PASP、PAPm、PVR 呈正相關(guān)(r=0.620、0.662、0.652,P ＜0.05)，CHD患者的IL-32水平與CTGF 呈正相關(guān)(r=0.409,P＜0.05)，見圖1。

圖1 血清IL-32 水平和血漿CTGF 水平相關(guān)性分析

2.3 IL-32 和CTGF 診斷CHD 合并PAH 的效能分析 通過ROC 曲線分析IL-32 和CTGF 的最佳截斷值分別為81.07、10.12 pg/mL，兩項指標聯(lián)合檢測的靈敏度、特異度、準確率及約登指數(shù)分別為95.8%、71.4%、89.0%及0.672，除特異度外均明顯高于兩項指標單獨檢測，見表2、圖2。

表2 IL-32 和CTGF 診斷CHD 合并PAH 的效能分析

圖2 血清IL-32、血漿CTGF 及聯(lián)合診斷PAH 的ROC 曲線分析

2.4 單因素和多因素Logistic 回歸分析 單因素Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)左心房內(nèi)徑、左心室收縮末內(nèi)徑、左心室舒張末內(nèi)徑、SvO2、BNP、IL-32 及CTGF 是CHD-PAH 的危險因素，將單因素分析中P＜0.05 的變量納入多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在進行多變量調(diào)整后，血漿CTGF、血清IL-32 均是CHDPAH 的獨立危險因素，見表3。

表3 CHD-PAH 患者的單因素及多因素Logistic 回歸分析

3 討論

PAH 是左向右分流CHD 最常見的并發(fā)癥，其發(fā)病機制多且復雜，包括胞質(zhì)鈣增多、線粒體功能障礙、骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2 基因突變、慢性炎癥、纖維化等。在臨床實踐中，通常由于患有PAH 的患者癥狀缺乏特異性而出現(xiàn)漏診誤診，錯過了最佳的診療時間。理想情況下，生物標志物水平隨時間的變化能更準確地反映疾病進展。因此為了尋找可以診斷并評估PAH 的新型生物標志物，本研究選擇了IL-32和CTGF 作為全新的聯(lián)合診斷指標。

通過比較對照組、CHD 組、CHD-PAH 組患者的臨床資料發(fā)現(xiàn)，左心房內(nèi)徑、左心室舒張末、收縮末內(nèi)徑、紅細胞分布寬度、BNP、PVR、SvO2、IL-32、CTGF等組間具有差異。CHD 患者如室間隔缺損，動脈導管未閉等，分流量大者，可造成不同程度的左心室、左心房肥大，PAH。有趣的是，還發(fā)現(xiàn)氧分壓組間差異無統(tǒng)計學意義，而SvO2差異有統(tǒng)計學意義，這可能是因為混合靜脈血一般在行右心導管時直接于肺動脈內(nèi)抽取行血氣分析，其能更直觀動態(tài)反映CHD-PAH 患者氧平衡的變化，而氧分壓一般抽取外周動脈血，其對CHD-PAH 患者不同組別之間微小氧濃度差異的敏感性較SvO2低。IL-32 可通過誘導其他促炎細胞因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8 來促進炎癥，活化的炎癥因子如IL-6 可通過激活成纖維細胞生長因子途徑，刺激內(nèi)皮細胞的凋亡和平滑肌增殖并破壞BMPR2 信號傳導途徑來連續(xù)激活炎癥反應[7]。本研究表明CHD-PAH 患者的血清IL-32 水平高于無PAH 的CHD 患者及對照組，證明IL-32 在CHD-PAH 發(fā)病過程中發(fā)揮了作用，而且經(jīng)ROC 曲線分析結(jié)果，IL-32 的最佳截斷值為81.07 pg/mL，靈敏度為45.8%，特異度為78.6%。單因素及多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)血清IL-32 是CHDPAH 的獨立危險因素(P＜0.05)。在D.J.SON 等[8]研究中提出IL-32α 通過上調(diào)Timp3 和Reck 抑制microRNA-205 的產(chǎn)生而抑制內(nèi)皮炎癥及血管平滑肌細胞活化，與本課題組目前設想的不同，他們認為IL-32α 是一種抗炎的細胞因子，這可能是因為IL-32有9 種不同的同工型，其中IL-32α、IL-32β 和IL-32γ是最具代表性的形式。而在本研究中，使用的ELISA試劑盒能夠識別3 種主要同工型(α、β 和γ)?？紤]本研究主要目標是評估是否可以用IL-32 作為新的相關(guān)生物標志物來早期診斷CHD-PAH，因此沒有分析其具體作用于何種同工型，后續(xù)可進一步研究來確定每種同工型在PAH 發(fā)展過程中的具體機制。CTGF 具有促進細胞有絲分裂、黏附、遷移，誘導細胞外基質(zhì)合成和纖維化的作用。其過度表達與多種纖維化疾病有關(guān)，如肝纖維化、心肌纖維化、腎纖維化[9-11]。近年來，多項研究[12-13]表明CTGF 能誘導細胞外基質(zhì)的沉積和肺動脈血管平滑肌的增殖并最終導致肺血管重塑。本研究發(fā)現(xiàn)，CHD-PAH 患者的血漿CTGF 水平高于單純CHD 患者及對照組，CTGF 的最佳截斷值為10.12 ng/mL，靈敏度為91.7%，特異度為67.9%，結(jié)果表明CTGF 是反映CHD-PAH 的有效指標及CHD-PAH 的獨立危險因素。

血流動力學參數(shù)是診斷及評估PAH 的關(guān)鍵指標。本研究發(fā)現(xiàn)，血清IL-32 水平與PAPm、PASP 呈正相關(guān)，這與既往研究結(jié)論[5]相似，提示IL-32 可能參與了疾病進程，血清IL-32 具有評估CHD-PAH患者嚴重程度的潛力。血漿CTGF 水平與PASP、PAPm 及PVR 均呈正相關(guān)，這與G.LI 等[14]的研究結(jié)論不同，部分原因可能是兒童與成人CHD-PAH 的差異性。且發(fā)現(xiàn)IL-32 與CTGF 呈正相關(guān)，提示IL-32可能具有血管生成特性，參與了肺叢狀病變的異常內(nèi)皮細胞的激活與增殖，而過度增生的內(nèi)皮細胞有助于肺動脈重塑，導致血管腔閉塞。

當前，臨床研究越來越傾向于多項生物標志物聯(lián)合檢測以提高對疾病診斷的準確性。本研究將IL-32 聯(lián)合CTGF 作為一個全新的組合，發(fā)現(xiàn)這兩項指標聯(lián)合檢測的靈敏度、準確率及約登指數(shù)均高于兩項指標單獨檢測，因此IL-32、CTGF 聯(lián)合檢測可提高CHD-PAH 早期診斷的效率，指導臨床盡快采取干預治療，改善患者預后。但本研究是單中心研究，樣本量較少，后續(xù)研究需擴大樣本量來明確其真正的診斷效果，并可研究生物標志物是否能夠評價PAH 治療的效果。