林 波，歐陽(yáng)秋麗，余 婷，鄭佳佳，陶能?chē)?guó)，李 路*

（湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湖南 湘潭 411105）

柑橘是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，具有重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年我國(guó)柑橘種植面積約277萬(wàn) hm2，柑橘總產(chǎn)量已達(dá)4365.57萬(wàn) t[1]。在柑橘貯運(yùn)過(guò)程中，病原真菌通過(guò)橘皮表面?zhèn)诩肮俟そ唤缣幥秩竟麑?shí)，引起果實(shí)腐爛，造成的經(jīng)濟(jì)損失不容忽視[2]。其中，由指狀青霉（Penicillium digitatum）引起的綠霉病是柑橘果實(shí)采后主要病害之一，在亞熱帶和干旱地區(qū)造成的損失可占柑橘采后總損失的90%[3-4]。目前，柑橘采后病害的防控手段以化學(xué)殺菌劑為主，但化學(xué)殺菌劑引起的環(huán)境、安全及病原菌耐藥性等問(wèn)題日益嚴(yán)峻，因此篩選高效的綠色植物源殺菌劑具有重要意義[5]。

近年來(lái)，植物次生代謝產(chǎn)物生物堿對(duì)植物病原真菌的抑制作用引起了廣泛關(guān)注[6]。潘佳亮[7]發(fā)現(xiàn)苦參堿能有效抑制山核桃干腐病菌（Botryosphaeria dothidea）的孢子萌發(fā)，且抑制菌絲體生長(zhǎng)的半抑制濃度（50%inhibitory concentration，IC50）為1.512 mg/mL。Zhao Zhongmin等[8]研究表明異喹啉類(lèi)生物堿對(duì)植物病原真菌具有廣譜抑菌性，其中血根堿抑制灰葡萄孢（Botrytis cinerea）等8 種植物病原菌生長(zhǎng)的抑制中濃度（median effective concentration，EC50）在6.96～59.36 μg/mL之間。Oliva等[9]從蕓香葉（Ruta graveolens）提取的喹諾酮生物堿對(duì)灰葡萄孢（B.cinerea）也具有高度抑菌活性。

小檗堿（berberine）又名黃連素，屬于異喹啉類(lèi)生物堿，主要以鹽酸鹽形式廣泛存在于小檗科、毛莨科、蕓香科植物中。鹽酸小檗堿（berberine hydrochloride，BH）具有廣譜抑菌性，因其多靶位抑菌機(jī)制，使致病菌不易產(chǎn)生耐藥性，常作為抗腫瘤、抗炎、抗菌成分應(yīng)用于臨床制劑中[10-13]。據(jù)報(bào)道，從黃連根中提取的小檗堿氯化物可有效抑制小麥白粉病菌（Blumeria graminis）、灰葡萄孢菌（B.cinerea）、葉銹病菌（Puccinia recondit）的生長(zhǎng)，其半數(shù)致死濃度（half lethal concentration，LC50）分別為190、80、50 μg/mL[14]。譚婷等[15]從紫葉小檗果中提取的小檗堿在質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)對(duì)尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的抑菌率為89.23%。阮元等[16]在離體條件下測(cè)定BH對(duì)19 種植物病原菌的抑制作用，結(jié)果顯示100 μg/mL BH對(duì)尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌（A.alternata）的生長(zhǎng)抑制率均高于75%。Hou Dongyao等[17]發(fā)現(xiàn)BH抑制桃褐腐病菌（Moniliniafructicola）生長(zhǎng)的最低抑菌質(zhì)量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為46.9 μg/mL。

本研究擬通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)探究BH對(duì)指狀青霉的抑菌活性，利用活體實(shí)驗(yàn)研究BH對(duì)柑橘果實(shí)綠霉病的防控作用；進(jìn)一步從病原菌菌絲體表面形態(tài)、細(xì)胞壁完整性、細(xì)胞膜通透性、活性氧（reactive oxygen species，ROS）及能量代謝方面對(duì)BH抑制指狀青霉的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，為柑橘采后綠霉病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

指狀青霉（Penicillium digitatum）菌株，分離于湘潭大學(xué)附近果園中自然發(fā)病的柑橘果實(shí)。柑橘果實(shí)品種為‘宮川’（Citrus unshiuMarc.cv.Miyagawa Wase）。

鹽酸小檗堿水合物（純度98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鈣熒光白試劑（calcofluor white，CFW）、碘化吡啶（pyridine iodide，PI）、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測(cè)試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）試劑盒 南京建成生物工程研究所；2’,7’-二氯二氫熒光素-雙乙酸酯（2’,7’-dichlorodihyd rofluorescein diacetate，DCFH-DA）試劑盒 上海索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SCW-CJ-1F型垂直流潔凈工作臺(tái) 蘇州安瑞凈化科技有限公司；DDSJ-308A電導(dǎo)儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司；UV-2450型紫外分光光度計(jì)、LC-20AT型高效液相色譜儀 日本SHIMADZU公司；ECLIPSE TS100型熒光顯微鏡 日本NIKON公司；JSM-6610LV型掃描電子顯微鏡 日本SANYO電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

將指狀青霉接種于PDA平板上活化，（25±2）℃恒溫培養(yǎng)5～6 d，用接種環(huán)刮取PDA平板上的孢子于無(wú)菌水中，紗布過(guò)濾掉菌絲，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用無(wú)菌水配制成1×107、1×105個(gè)/mL的孢子懸浮液備用。

1.3.2 BH抑制指狀青霉生長(zhǎng)情況的分析

采用液體倍半稀釋法[18]測(cè)定BH對(duì)指狀青霉菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。配制BH終質(zhì)量濃度分別為0、0.02、0.04、00.8、0.16、0.32、0.64 g/L的PDB，加入孢子懸浮液后，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱（25±2）℃，160 r/min培養(yǎng)48 h。MIC定義為培養(yǎng)2 d能完全抑制病原菌生長(zhǎng)的最低BH質(zhì)量濃度，將BH質(zhì)量濃度≥MIC的培養(yǎng)液涂布在PDA平板后繼續(xù)培養(yǎng)2 d，能完全抑制病原菌生長(zhǎng)的最低BH質(zhì)量濃度即最低殺菌質(zhì)量濃度（minimum fungicidal concentration，MFC）。將濃度為1×107個(gè)/mL的孢子懸浮液加入BH質(zhì)量濃度為0.5 MIC和MIC的PDB中，對(duì)照為孢子懸浮液加入不含BH的PDB中（25±2）℃、160 r/min分別培養(yǎng)6、9、12、15 h，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。

1.3.3 BH處理及柑橘果實(shí)綠霉病病斑平均直徑的測(cè)定

將采摘的柑橘果實(shí)于室內(nèi)放置1 d，自來(lái)水清洗，用2%（體積分?jǐn)?shù)）NaClO浸泡2 min，蒸餾水漂洗3 次，自然風(fēng)干。用小刀在柑橘果實(shí)赤道附近劃大小為3 mm×3 mm的傷口，接種10 μL濃度為1×105個(gè)/mL的孢子懸浮液。靜置4 h后將果實(shí)分別浸泡在1 MFC、5 MFC、10 MFC的BH溶液中1 min，對(duì)照組為無(wú)菌水處理的果實(shí)。隨后，將柑橘果實(shí)置于溫度為（23±2）℃、相對(duì)濕度為80%～90%的條件下貯藏，用十字測(cè)量法每天測(cè)量果實(shí)的病斑直徑，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。采用下列公式計(jì)算病斑平均直徑[19]，以平均直徑表征病斑直徑。

1.3.4 菌絲體表面形態(tài)觀察

取0.5 mL濃度為1×105個(gè)/mL的孢子懸浮液加入50 mL PDB中，（25±2）℃振蕩培養(yǎng)2 d。用4 層紗布過(guò)濾得菌絲體，加入含不同質(zhì)量濃度BH（0 MIC（對(duì)照組，下同）、0.5 MIC、MIC）的PDB中振蕩培養(yǎng)120 min，過(guò)濾后用蒸餾水清洗3 次。將收集的菌絲體用3%戊二醛溶液4 ℃固定24 h，用無(wú)菌水漂洗20 min，依次用30%、50%、70%、95%乙醇溶液分別處理20 min，最后用無(wú)水乙醇脫水45 min。將處理后的菌絲體冷凍干燥，噴金后用掃描電子顯微鏡觀察其表面形態(tài)[20]。

1.3.5 菌絲體細(xì)胞壁完整性分析

收集培養(yǎng)2 d的指狀青霉菌絲體，分別加入含不同質(zhì)量濃度BH（0 MIC、0.5 MIC、MIC）的PDB中，于160 r/min、（25±2）℃分別振蕩培養(yǎng)0、30、60、120 min后過(guò)濾。分別收集上清液和菌絲體用于胞外AKP活力的測(cè)定及細(xì)胞壁完整性測(cè)定。取300 μL上清液，參考AKP試劑盒的方法測(cè)胞外AKP活力。取少量菌絲體加入10 μL CFW熒光染料處理10 s后加入等體積的10% NaOH溶液，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察[21]。

1.3.6 菌絲體細(xì)胞膜通透性分析

參照Tang Xu等[22]的方法觀察BH對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響。稱(chēng)取0.10 g上述菌絲體，加入1 mL PBS和10 μL 1 g/L PI染液，37 ℃水浴5 min后用PBS清洗3 次，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。將上述收集的上清液用電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)率[23]。將上述上清液4 000 r/min離心10 min后，取0.5 mL上清加入0.5 mL蒸餾水，與5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染劑混勻，595 nm處測(cè)吸光度，根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算可溶性蛋白的質(zhì)量濃度[22]。

1.3.7 菌絲體活性氧水平及丙二醛濃度分析

用DCFH-DA試劑盒檢測(cè)菌絲體胞內(nèi)ROS水平，按照說(shuō)明書(shū)處理待測(cè)菌絲體，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，用Image-J軟件分析熒光強(qiáng)度，以相對(duì)熒光值（與初始熒光強(qiáng)度的比值）表征ROS水平。根據(jù)丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒提供的方法測(cè)定菌絲體胞內(nèi)MDA的濃度。

1.3.8 線粒體膜電位及能量代謝水平的測(cè)定

參考MMP檢測(cè)試劑盒（JC-10染色法）說(shuō)明書(shū)測(cè)定MMP的變化情況，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，并用Image-J軟件分析熒光強(qiáng)度，以紅/綠熒光強(qiáng)度比值表征MMP。

參照Tang Xu等[22]的方法測(cè)定BH對(duì)指狀青霉ATP含量及胞內(nèi)能荷水平的影響。稱(chēng)取0.50 g上述菌絲體，加入5 mL沸騰的2 mol/L MgSO4溶液混勻后于100 ℃水浴10 min，冰浴冷卻并研磨至勻漿狀。4 000 r/min離心10 min，取上清液于高效液相色譜測(cè)定胞內(nèi)ATP含量及能荷水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

液相色譜條件：C18柱（5 μm×250 mm×4.60 mm）；柱溫：25℃；流動(dòng)相為緩沖液：甲醇-緩沖液（含1 mmol/L乙二胺四乙酸-KH2PO4-K2HPO4緩沖液（50 mmol/L、pH 6））體積比為97.5∶2.5；流速：0.80 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：259 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

通過(guò)Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Ducan多重比較進(jìn)行組間差異性分析，P＜0.05表示差異顯著，用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BH對(duì)指狀青霉生長(zhǎng)情況的影響

不同質(zhì)量濃度BH對(duì)指狀青霉生長(zhǎng)情況的影響如表1所示，PDB培養(yǎng)2 d后，BH質(zhì)量濃度為0.16 g/L時(shí)可完全抑制指狀青霉的生長(zhǎng)，表明BH抑制指狀青霉菌絲體生長(zhǎng)的MIC值為0.16 g/L；將BH質(zhì)量濃度≥MIC的培養(yǎng)液涂布到PDA平板繼續(xù)培養(yǎng)2 d后發(fā)現(xiàn)，0.32 g/L BH可以完全抑制指狀青霉的生長(zhǎng)，表明MFC為0.32 g/L。

表1 BH對(duì)指狀青霉菌絲體生長(zhǎng)情況的影響Table 1 Effect of BH on the mycelial growth of P.digitatum

從圖1可以看出，不同質(zhì)量濃度BH處理后，指狀青霉的孢子萌發(fā)率均有所下降。對(duì)照組指狀青霉孢子在6 h開(kāi)始萌發(fā)，此時(shí)，BH處理組的孢子均不萌發(fā)。15 h時(shí)，對(duì)照組孢子萌發(fā)率達(dá)（92.48±3.35）%。而0.5 MIC和MIC BH處理組的孢子萌發(fā)率分別為（12.55±0.71）%和（4.40±1.05）%，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。表明BH可顯著抑制指狀青霉孢子的萌發(fā)。

圖1 BH對(duì)指狀青霉孢子萌發(fā)率的影響Fig.1 Effect of BH on the spore germination of P.digitatum

2.2 BH對(duì)柑橘果實(shí)綠霉病發(fā)病進(jìn)程的影響

BH對(duì)柑橘果實(shí)綠霉病發(fā)病進(jìn)程的影響如圖2所示。接種指狀青霉3 d后，對(duì)照組柑橘果實(shí)開(kāi)始發(fā)病，并表現(xiàn)出明顯病癥，貯藏5 d后全果腐爛。而經(jīng)5 MFC、10 MFC BH處理的柑橘果實(shí)第4天才開(kāi)始發(fā)病，貯藏5 d后，10 MFC BH處理的果實(shí)病斑直徑為（1.13±0.02）cm，顯著小于對(duì)照組（（5.62±0.09）cm，P＜0.05）（表2）。說(shuō)明BH處理延緩了柑橘果實(shí)綠霉病的發(fā)病進(jìn)程，且抑制作用呈濃度依賴性。

表2 BH對(duì)柑橘果實(shí)綠霉病病斑直徑的影響Table 2 Effect of BH on the lesion diameter of green mold in citrus fruit

2.3 BH對(duì)指狀青霉菌絲體表面形態(tài)的影響

BH處理對(duì)指狀青霉菌絲體表面形態(tài)的影響如圖3所示。120 min時(shí)，對(duì)照組菌絲體表面形態(tài)飽滿完整，無(wú)褶皺凹陷（圖3A）；而0.5 MIC BH處理組部分菌絲體呈干癟、褶皺、扭曲狀（圖3B）；MIC BH處理組菌絲的損傷程度更加明顯（圖3C）。表明BH可破壞指狀青霉菌絲體表面形態(tài)，且處理質(zhì)量濃度越大，菌絲體的損傷程度越大。

圖3 BH對(duì)指狀青霉菌絲體表面形態(tài)的影響Fig.3 Effect of BH on the mycelial morphology of P.digitatum

2.4 BH對(duì)指狀青霉菌絲體細(xì)胞壁完整性的影響

細(xì)胞壁在真菌的生長(zhǎng)和存活中起重要作用，因此經(jīng)常作為真菌抑制劑的作用靶標(biāo)[24]。CFW可以與真菌細(xì)胞壁成分幾丁質(zhì)和β-葡聚糖結(jié)合產(chǎn)生藍(lán)色熒光，因此熒光強(qiáng)度的減弱則表明細(xì)胞壁完整性受損[25-26]。指狀青霉菌絲體經(jīng)CFW染色后，MIC BH處理組的熒光強(qiáng)度隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減弱，而對(duì)照組菌絲體的熒光強(qiáng)度基本不變（圖4A）。其中，30 min時(shí)，MIC BH處理組的熒光值為初始值的0.93 倍，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05，圖4B），說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞壁完整性已受損。AKP存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，細(xì)胞壁受損將導(dǎo)致AKP泄漏[24,27]，因此進(jìn)一步測(cè)定胞外AKP活力的變化對(duì)細(xì)胞壁受損情況進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，30 min時(shí)，MIC BH處理組的胞外AKP活力為（4.58±0.31）U/L，顯著高于對(duì)照組（（3.68±0.09）U/L，P＜0.05）（圖4C）。說(shuō)明MIC BH處理30 min時(shí)，細(xì)胞壁完整性已受損，導(dǎo)致AKP從細(xì)胞周質(zhì)空間釋放到胞外。

圖4 BH對(duì)指狀青霉菌絲體細(xì)胞壁完整性的影響Fig.4 Effect of BH on the cell wall integrity of P.digitatum mycelia

2.5 BH對(duì)指狀青霉菌絲體細(xì)胞膜完整性的影響

細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性對(duì)真菌的生存和生長(zhǎng)至關(guān)重要，細(xì)胞膜的損傷可導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，同時(shí)膜滲透性的增加可促進(jìn)抑菌物質(zhì)對(duì)菌體的作用，加速細(xì)胞的凋亡[28-31]。PI是一種熒光染料，可穿過(guò)受損的細(xì)胞膜與核酸結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光[20]。因此，本實(shí)驗(yàn)先通過(guò)PI染色實(shí)驗(yàn)研究BH對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響。結(jié)果表明，30 min時(shí)MIC BH處理的菌絲體呈現(xiàn)明顯的紅色熒光，其熒光強(qiáng)度為初始值的（1.24±0.02）倍，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且熒光強(qiáng)度隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，而對(duì)照組未觀察到紅色熒光（圖5A、B）。進(jìn)一步測(cè)定胞外電導(dǎo)率及可溶性蛋白質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響進(jìn)行驗(yàn)證。30 min時(shí)，0.5 MIC BH和MIC BH處理組的胞外電導(dǎo)率相對(duì)初始增量和可溶性蛋白質(zhì)量濃度均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，胞外電導(dǎo)率相對(duì)初始增量和可溶性蛋白質(zhì)量濃度持續(xù)增加（圖5C、D）。說(shuō)明0.5 MIC BH處理30 min時(shí)，指狀青霉菌絲體的細(xì)胞膜已受損，導(dǎo)致內(nèi)容物泄漏。

圖5 BH對(duì)指狀青霉菌絲體細(xì)胞膜通透性的影響Fig.5 Effect of BH on membrane permeability of P.digitatum mycelia

2.6 BH對(duì)指狀青霉菌絲體胞內(nèi)ROS和MDA水平的影響

許多真菌抑制劑的作用機(jī)制與脂質(zhì)過(guò)氧化密切相關(guān)，脂質(zhì)過(guò)氧化使細(xì)胞質(zhì)膜功能發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。MDA作為膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，其含量是衡量膜脂過(guò)氧化水平的重要指標(biāo)[20]。為研究BH對(duì)指狀青霉菌絲體氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，測(cè)定了胞內(nèi)ROS和MDA的水平，結(jié)果如圖6所示。30 min時(shí)，BH處理組的胞內(nèi)ROS和MDA水平與對(duì)照組無(wú)顯著性差異；而60 min時(shí)，MIC BH處理組ROS水平為1.040±0.027，胞內(nèi)MDA濃度增加至（0.171±0.007）μmol/L，均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。說(shuō)明60 min時(shí)，MIC BH處理組的指狀青霉菌絲體胞內(nèi)ROS積累并發(fā)生膜脂過(guò)氧化反應(yīng)。

圖6 BH對(duì)指狀青霉ROS（A）及MDA（B）水平的影響Fig.6 Effect of BH on the ROS (A) and malondialdehyde (B) contents of P.digitatum mycelia

2.7 BH對(duì)指狀青霉線粒體膜電位及能量代謝的影響

線粒體是細(xì)胞能量代謝的主要場(chǎng)所。ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可直接引起線粒體損傷，而MMP在維持線粒體功能中起重要作用，因此MMP在多種細(xì)胞凋亡刺激下呈下降趨勢(shì)[32-33]。由圖7A可知，30 min時(shí)，BH對(duì)指狀青霉菌絲體MMP沒(méi)有造成顯著影響，但處理60 min時(shí)，0.5 MIC和MIC處理組的菌絲體MMP分別為0.388±0.017、0.262±0.010，均顯著低于對(duì)照組（0.435±0.013，P＜0.05）。說(shuō)明此時(shí)線粒體功能已受損。此外，BH處理對(duì)指狀青霉菌絲體的能量代謝造成顯著影響。處理30 min時(shí)，菌絲體ATP含量迅速減少，0.5 MIC和MIC BH處理組的ATP含量分別為（72.91±2.85）μg/g和（76.16±0.87）μg/g，均顯著低于對(duì)照組（（116.52±5.18）μg/g，P＜0.05）；處理60 min時(shí)，ATP含量進(jìn)一步下降（圖7B）。胞內(nèi)能荷水平也呈現(xiàn)類(lèi)似變化趨勢(shì)（圖7C）。結(jié)果暗示BH處理30 min時(shí)，指狀青霉菌絲體能量代謝已受到影響；60 min時(shí)，線粒體功能受損，能量代謝進(jìn)一步失衡。

圖7 鹽酸小檗堿對(duì)指狀青霉MMP及能量代謝的影響Fig.7 Effect of BH on the mitochondrial membrane potential and energy metabolism of P.digitatum

3 討 論

生物堿是植物次生代謝物中含量最高的一類(lèi)，因其具有高效、低毒、選擇性高、對(duì)有益生物安全及病原物不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，生物堿農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[34]。BH作為一種具有廣譜抑菌性的生物堿，對(duì)玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌（A.alternata）、桃褐腐病菌（M.fructicola）等多種植物病原真菌的抑菌活性已有初步報(bào)道[16-17,35]，但BH對(duì)植物病害的防控效果鮮有研究。在本實(shí)驗(yàn)中，BH抑制指狀青霉生長(zhǎng)的MIC和MFC分別為0.16、0.32 g/L（表1），處理15 h后，0.5 MIC處理組和MIC BH處理組的孢子萌發(fā)率分別僅為（12.55±0.71）%和（4.40±1.05）%（圖1），說(shuō)明離體條件下，BH對(duì)指狀青霉具有較強(qiáng)的抑制作用。進(jìn)一步研究了活體條件下BH對(duì)柑橘果實(shí)綠霉病的防控效果，結(jié)果顯示BH處理能降低發(fā)病果實(shí)的病斑直徑，有效延緩發(fā)病進(jìn)程，且防控效果呈現(xiàn)劑量依賴型（表2）。BH的離體實(shí)驗(yàn)效果優(yōu)于活體實(shí)驗(yàn)，此現(xiàn)象與安托芬在離體和活體條件下對(duì)指狀青霉的抑制效果[20]相似，可能與人工接種孢子濃度較高以及果實(shí)傷口揮發(fā)物誘導(dǎo)病原菌孢子萌發(fā)有關(guān)[36]。此外，果實(shí)的酸度、硬度、成熟度等因素均對(duì)柑橘果實(shí)的發(fā)病進(jìn)程有一定影響[37]。

掃描電子顯微鏡結(jié)果顯示，經(jīng)BH處理的菌絲體干癟褶皺（圖3），說(shuō)明BH可改變指狀青霉菌絲體的表面形態(tài)。而真菌細(xì)胞壁作為小分子物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的第一道屏障，對(duì)維持細(xì)胞形態(tài)、抵抗外界壓力及真菌的生長(zhǎng)和定植等生命活動(dòng)有重要意義[38-39]。真菌細(xì)胞膜具有維持細(xì)胞秩序和完整性的作用，細(xì)胞膜的破裂可使細(xì)胞內(nèi)容物外泄并引起真菌細(xì)胞組織的破裂[32]。本實(shí)驗(yàn)中，BH處理后指狀青霉菌絲體的細(xì)胞壁完整性和細(xì)胞膜通透性均受損，引起胞內(nèi)物質(zhì)的外泄。結(jié)果與高磊[40]報(bào)道的小檗堿顯著破壞煙曲霉（Aspergillus fumigatus）的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)這一結(jié)論相似。值得注意的是，30 min時(shí)，0.5 MIC BH處理組的細(xì)胞膜通透性已受損，而該質(zhì)量濃度下細(xì)胞壁完整性受損發(fā)生在30 min之后（圖4、5），說(shuō)明細(xì)胞膜是BH最初的作用位點(diǎn)。

研究表明，真菌細(xì)胞膜上存在多種離子通道，對(duì)細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)和能量交換具有重要意義，而抑菌物質(zhì)誘導(dǎo)真菌細(xì)胞膜通透性的改變可導(dǎo)致ATP的泄漏[41-42]。本實(shí)驗(yàn)中，BH處理30 min時(shí)，指狀青霉菌絲體胞內(nèi)ATP含量及能荷水平均急劇下降（圖7B、C）。因此推斷30 min時(shí)指狀青霉能量代謝失衡與細(xì)胞膜通透性的改變有關(guān)，與胞外糖脂對(duì)酵母的抑菌機(jī)制相似[41]。膜脂質(zhì)過(guò)氧化和ROS反應(yīng)在真菌體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡維持著細(xì)胞正常的新陳代謝，這種平衡的打破即造成細(xì)胞損傷。這種氧化性損傷不僅僅發(fā)生在質(zhì)膜，還是引起線粒體損傷的主要途徑之一[7,43]。本實(shí)驗(yàn)中，60 min時(shí)，BH處理組的菌絲體中ROS積累并發(fā)生膜脂過(guò)氧化反應(yīng)（圖6），MMP也顯著降低（圖7A），表明ROS的積累造成了線粒體功能的損傷，該結(jié)果與前期報(bào)道的生物堿安托芬對(duì)指狀青霉的抑菌機(jī)理[43]相似。而線粒體功能受損加劇了能量代謝的失衡，表現(xiàn)為胞內(nèi)ATP含量和能荷水平的進(jìn)一步降低。

綜上，BH能有效抑制指狀青霉的孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，并延緩柑橘果實(shí)綠霉病的發(fā)病進(jìn)程。BH損傷病原菌的細(xì)胞通透性，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)泄漏和能量失衡。隨后，胞內(nèi)ROS積累造成膜脂過(guò)氧化和線粒體損傷，進(jìn)一步影響能量代謝，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。