張家翔 韓佃剛 楊云慶 周思佳 楊妮 信吉閣

摘要 CRISPR/Cas9是一種高效率、簡單操作、低成本的基因編輯工具，近年來廣泛應(yīng)用于動物、植物和微生物基因敲除研究，為深層次地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。概述CRISPR/Cas9技術(shù)在動物、植物和微生物的基因敲除中的研究進(jìn)展，并對其深入研究進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞 CRISPR/Cas9;基因敲除;基因編輯;應(yīng)用

中圖分類號 Q 78? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）03-0016-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.004

CRISPR/Cas9 Technology and Research Progress in Gene Knockout

ZHANG Jia-xiang1，HAN Dian-gang2，YANG Yun-qing2 et al

（1.College of Veterinary Medicine，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201;2.Technology Center of Kunming Customs，Kunming，Yunnan 650200）

Abstract CRISPR / Cas9? is a gene editing technology with high editing efficiency，simple operation and low cost.In recent years，this technology has been widely used in the study of gene knockout in animals，plants and microorganisms，which has laid a foundation for medical research in the future.This paper summarized the research progress of CRISPR/Cas9 technology in gene knockout in animals，plants and microorganisms，and forecasted its in-depth research.

Key words CRISPR/Cas9;Gene knockout;Gene editing;Application

基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31960658，31360532）;云南省科技計劃項(xiàng)目（2013FB041）;國家質(zhì)檢總局科技計劃項(xiàng)目（2012IK025）。

作者簡介 張家翔（1996—），男，重慶人，碩士研究生，研究方向：獸醫(yī)公共衛(wèi)生。通信作者，副教授，博士，從事獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)研究。

收稿日期 2021-04-21

近年來，CRISPR/Cas9（成簇有規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9）技術(shù)因在生物技術(shù)領(lǐng)域的主要應(yīng)用而被廣泛認(rèn)可。CRISPR/Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA[1]。CRISPR的序列最早是由日本分子生物學(xué)家石野良純（Yoshizumi Ishino）于1987年在大腸桿菌中偶然發(fā)現(xiàn)的，2003年西班牙微生物學(xué)家弗朗西斯科·莫伊卡（Francisco Mojica）進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CRISPR中獨(dú)特的非重復(fù)的序列與各種病毒的遺傳密碼相匹配。隨著研究的不斷深入，研究人員確定了CRISPR是一種源自細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[2-3]。

CRISPR/Cas9技術(shù)被認(rèn)為是第三代基因編輯技術(shù)[4]，其是一種非常有目標(biāo)性的工具，幾乎可以靶向任何基因，且操作較為簡便、敲除效率較高[5-7]。CRISPR/Cas技術(shù)改變了基因組學(xué)、基因編輯、基因治療和基因組成像等領(lǐng)域，同時這一技術(shù)的廣泛應(yīng)用為理解和操縱遺傳或表觀遺傳元素拓展了巨大的范圍。該技術(shù)在體系完成對靶標(biāo)基因的遺傳編輯后，可在后代配子形成過程中隨著染色體的分離而去除，在編輯后代中無轉(zhuǎn)基因的痕跡，無需引用外源基因，因此生物安全性高[8]。CRISPR/Cas9技術(shù)是一種流行的工具，目前已經(jīng)廣泛用于動物、植物以及微生物基因組編輯[9]。

1 原理

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理是以crRNA（CRISPR-derived RNA）通過堿基的互補(bǔ)配對，與tracrRNA（trans-activating RNA）結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物，然后通過這個過程所形成的復(fù)合物來引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白，再與crRNA 配對的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。通過人為設(shè)計這2種RNA，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA（single-guide RNA），引導(dǎo)Cas9對DNA的定點(diǎn)切割[10]，工作原理[11]見圖1。

2 應(yīng)用

2.1 在動物上的應(yīng)用

CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)目前正在改變廣泛動物模型中的遺傳學(xué)研究。CRISPR/Cas9技術(shù)在動物上的應(yīng)用主要是利用基因敲除技術(shù)和胚胎干細(xì)胞技術(shù)制備的某一特定位點(diǎn)基因缺失的動物，從而得到一些動物模型，能夠更好地獲得一些信息以及得到實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用[12]。

現(xiàn)已經(jīng)利用CRISPR/Cas9技術(shù)誘導(dǎo)豬胎兒成纖維細(xì)胞 （pig fetal fibroblasts，PFF）發(fā)生非同源性末端接合（non-homologous end joining，NHEJ），通過體細(xì)胞核移植 （somatic cell nuclear transfer，SCNT） 技術(shù)和胚胎移植 （embryo transfer，ET）技術(shù)獲得了MSTN雙等位基因敲除豬（knockout，KO）[13]。張婷婷等[14]利用電轉(zhuǎn)染法把CRISPR/Cas9、sgRNA和目的載體共同轉(zhuǎn)入巴馬豬PFF，篩選單細(xì)胞克隆，合成了hHBB突變體，共制備出15株有hHBB突變體定點(diǎn)敲入細(xì)胞系。許金蔓等[15]根據(jù)豬的PFKM基因序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計出了sgRNA序列，同時構(gòu)建CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒，試驗(yàn)結(jié)果表明，在已經(jīng)轉(zhuǎn)染了的CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒篩選到的單細(xì)胞克隆中，有2株細(xì)胞PFKM基因序列發(fā)生了基因突變，其中1個克隆為堿基插入，另1個為堿基插入、替換及缺失，再通過qRT-PCR定量檢測后，篩選到1株細(xì)胞PFKM mRNA表達(dá)量下降89.41%，差異極顯著。曹興林等[16]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構(gòu)建敲除了IFN-β1編碼序列的MDCK單細(xì)胞克隆。該克隆生長旺盛、病毒增殖能力維持較高水平，為禽流感病毒抗原的規(guī)模增殖及相關(guān)機(jī)理研究奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。李忠慧[17]運(yùn)用CRISPR/Cas9對羊毛生長性狀相關(guān)的功能基因進(jìn)行修飾，以獲得基因編輯綿羊。

隨著技術(shù)不斷更新，CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)日趨成熟，利用該技術(shù)已經(jīng)成功改良了一些家畜的產(chǎn)肉產(chǎn)毛量，改善了家畜的健康狀況等，為之后更多的動物領(lǐng)域研究提供了便利。

2.2 在植物上的應(yīng)用

傳統(tǒng)的改良作物性狀的育種方法是利用一系列的回交和選擇，將一個有益性狀導(dǎo)入優(yōu)良種質(zhì)中，是比較耗費(fèi)時間和資源的。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種先進(jìn)的用于植物基因功能研究和作物改良的通用工具，近年來該系統(tǒng)在植物上的研究也越來越廣泛，在主要糧食及經(jīng)濟(jì)作物的精準(zhǔn)育種方面發(fā)揮了重要作用[18]。

張宗飛等[19]、李孟珠等[20]都將CRISPR/Cas9技術(shù)運(yùn)用在了水稻上，張宗飛團(tuán)隊(duì)成功創(chuàng)建了2個已鑒定的水稻OsFRK家族基因的敲除突變體，獲得28株OsFRK1的T0代轉(zhuǎn)基因植株[19];李孟珠團(tuán)隊(duì)則是構(gòu)建了水稻的OsSUT4缺失變體，通過進(jìn)一步分析OsSUT4在水稻蔗糖源端裝載以及籽粒庫端卸載等生理過程發(fā)揮重要作用[20]。李星坤等[21]以擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶同工酶基因UGT84A1和UGT84A2為靶向基因，構(gòu)建了CRISPR/Cas9雙突變體表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌浸染擬南芥，同時定向敲除靶向基因成功構(gòu)建了UGT84A1/UGT84A2雙突變體。李鵬[22]也利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功完成對擬南芥AtILR3編輯靶位點(diǎn)的篩選及載體構(gòu)建。Badhan Sapna等[23]首次在鷹嘴豆原生質(zhì)體中利用CRISPR/Cas9進(jìn)行DNA基因編輯抗旱相關(guān)基因，成功培育出抗旱植株。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一個快速、經(jīng)濟(jì)、精確的作物改良工具，不涉及相關(guān)倫理問題，同時在植物上表現(xiàn)的脫靶效應(yīng)較小，因此，該技術(shù)在植物上的應(yīng)用越來越廣泛，也為后續(xù)研究提供了便利。

2.3 在微生物上的應(yīng)用

雖然細(xì)菌的CRISPR/CAS系統(tǒng)已經(jīng)衍生出多種技術(shù)，但遺憾的是，這些技術(shù)在細(xì)菌中的應(yīng)用還遠(yuǎn)不如在真核生物中的應(yīng)用廣泛，也偶見報道[24]。大多數(shù)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在微生物上的應(yīng)用，主要是獲得基因缺失菌株以及構(gòu)建系統(tǒng)，為進(jìn)一步的研究提供技術(shù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)[25]。

有學(xué)者在研究中分別將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)運(yùn)用在了酵母菌上。劉磊等[26]利用CRISPR/Cas9敲除gpd2，構(gòu)建了適用于釀酒酵母的基因敲除系統(tǒng);李夢琦等[27]成功地在Lager酵母中構(gòu)建了基因敲除系統(tǒng);胡婧等[28]采用整合型CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將sgRNA克隆到pV1093質(zhì)粒中，通過醋酸鋰法轉(zhuǎn)化白念珠菌野生型菌株SN148和PCR驗(yàn)證基因型，成功構(gòu)建了MTQ2純合子缺失菌株;Huang等[29]在杜邦嗜熱菌中開發(fā)了嗜溫和嗜熱2個CRISPR/Cas9系統(tǒng)，并表征了熱內(nèi)酯生物合成和真菌適應(yīng)中的關(guān)鍵基因功能。

基因操縱微生物的能力對于理解微生物的生物學(xué)和新陳代謝至關(guān)重要。該技術(shù)的出現(xiàn)為各種微生物的基因功能、代謝調(diào)控等研究提供了簡單、快速和高效的方法。隨著日后CRISPR/Cas9技術(shù)的改進(jìn)和完善，其在微生物上的應(yīng)用也將越來越廣泛。

3 小結(jié)與展望

以CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組編輯是一種高效、有潛力的技術(shù)，其可以替代傳統(tǒng)的基因組編輯方法，同時由于這項(xiàng)技術(shù)有著快速、靈活和高效的特性，使其能夠廣泛應(yīng)用于植物、動物以及微生物等許多領(lǐng)域。近年來新興起了鋅指核酸酶技術(shù)（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)（TALENs）及CRISPR/Cas9技術(shù)等多種基因高效靶向修飾和調(diào)控技術(shù)。CRISPR/Cas9相比于ZFNs和TALENs，其最顯著的優(yōu)勢是特異性更高，但該特性取決于sgRNA的識別序列[30]。自2012年首次證明了CRISPR/Cas9可以在體外進(jìn)行DNA切割試驗(yàn)以來，CRISPR技術(shù)逐漸在基因編輯研究中獲得了迅速的發(fā)展，除了應(yīng)用于基因編輯領(lǐng)域之外，它在基因表達(dá)調(diào)控、基因成像、基因分析等方面也展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力[31]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)目前已經(jīng)為基因組編輯提供了前所未有的可能性，但是，也存在著一些局限性，包括實(shí)現(xiàn)高效的一步多基因組目標(biāo)，以節(jié)省成本、時間，并確保高質(zhì)量。同時CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)雖然存在著脫靶、工具質(zhì)粒不穩(wěn)定、Cas9蛋白毒性作用等問題，但因有著簡單、高效等優(yōu)勢，使其在目前廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域（微生物、動物、植物等），尤其在哺乳動物和人類的多種疾病治療、藥物以及作物培育研究等方面的應(yīng)用越來越成熟[32]。同時對CRISPR/Cas9技術(shù)潛在應(yīng)用的進(jìn)一步研究將有助于克服這些難關(guān)，相信隨著CRISPR系統(tǒng)的不斷改進(jìn)，該技術(shù)不僅能為研究人員提供基因的操縱和改變及功能研究，促進(jìn)研究人員對疾病分子基礎(chǔ)的認(rèn)識和新的靶向治療方法的開發(fā)，而且在今后的生物學(xué)、農(nóng)學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)⒕哂懈鼮閺V闊的應(yīng)用前景。

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