葛陽(yáng)陽(yáng) 何灼奮 黃黎琳 林丹櫻 曹慧群 屈軍樂(lè) 于斌?

1) (深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院，光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518060)

2) (深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，深圳 518060)

多焦點(diǎn)結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)(multifocal structured illumination microscopy，MSIM)能在50 μm 的成像深度內(nèi)和1Hz 的成像速度下實(shí)現(xiàn)兩倍于衍射極限分辨率的提升，相比傳統(tǒng)的寬場(chǎng)結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)，具有較大的成像深度和層析能力，更適合應(yīng)用于厚樣品的長(zhǎng)時(shí)程三維超分辨成像.然而，MSIM 存在成像速度慢、圖像處理過(guò)程復(fù)雜等問(wèn)題.本文提出了一種基于平場(chǎng)復(fù)用多焦點(diǎn)結(jié)構(gòu)光照明的快速超分辨顯微成像方法和系統(tǒng)(flat-field multiplexed MSIM，F(xiàn)M-MSIM)，通過(guò)在照明光路中插入光束整形器件，將高斯光束轉(zhuǎn)變?yōu)榫鶠榉植嫉钠巾敼馐岣呒ぐl(fā)點(diǎn)陣的強(qiáng)度均勻性和擴(kuò)大視場(chǎng);通過(guò)將每個(gè)衍射受限的激發(fā)點(diǎn)沿y 方向延長(zhǎng)，形成新的多路復(fù)用多焦點(diǎn)陣照明圖案，提高能量利用率，減少掃描步數(shù)，進(jìn)而提高成像速度和信噪比;結(jié)合基于多重測(cè)量矢量模型的稀疏貝葉斯學(xué)習(xí)圖像重構(gòu)算法，簡(jiǎn)化圖像重構(gòu)步驟，在保證空間分辨率的同時(shí)實(shí)現(xiàn)至少4 倍于傳統(tǒng)MSIM 的成像速度.在此基礎(chǔ)上，利用搭建的FM-MSIM 系統(tǒng)進(jìn)行了BSC 細(xì)胞微管樣片和小鼠腎切片標(biāo)準(zhǔn)樣片的超分辨成像實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了該系統(tǒng)的快速三維超分辨成像能力，對(duì)于MSIM 的發(fā)展具有重要的意義.

1 引言

近年來(lái)，超分辨熒光顯微成像技術(shù)(super-resolution fluorescence microscopy，SRFM)蓬勃發(fā)展，突破了光學(xué)衍射極限的限制，能夠以納米尺度的空間分辨率觀察到細(xì)胞內(nèi)的精細(xì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)過(guò)程，已成為生命科學(xué)等領(lǐng)域重要的研究工具，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)等諸多領(lǐng)域的發(fā)展.

目前，SRFM 主要可以分為受激發(fā)射損耗(stimulated emission depletion，STED)顯微技術(shù)[1-3]、單分子定位顯微術(shù)(single molecule localization microscopy，SMLM)[4，5]和結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)(structured illumination microscopy，SIM)[6-10]3 類(lèi)技術(shù).STED的空間分辨率通常在60—100 nm 的數(shù)量級(jí)，由于其采用點(diǎn)掃描的成像方式，可實(shí)現(xiàn)數(shù)十微米成像深度的超高分辨率成像.但是，其成像速度與觀察樣品區(qū)域大小成反比關(guān)系，而且需要特定的熒光標(biāo)記及高能量的損耗光，光漂白和光毒性大，難以用于研究較大的活體生物樣本.SMLM 技術(shù)如隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)[4]和光激活定位顯微技術(shù)[5]，雖然可實(shí)現(xiàn)橫向10—30 nm、縱向20—50 nm 空間分辨率的寬場(chǎng)成像，但通常需要采集數(shù)千甚至數(shù)萬(wàn)幅單分子熒光圖片來(lái)獲得一幅超分辨圖像，成像速度慢，成像深度一般在幾個(gè)微米，而且還受到光開(kāi)關(guān)熒光探針標(biāo)記的限制，不適合活體厚樣品的超分辨成像.傳統(tǒng)寬場(chǎng)SIM 利用線(xiàn)性光柵結(jié)構(gòu)光照明，實(shí)現(xiàn)了橫向100—120 nm、縱向200 nm 左右空間分辨率的寬場(chǎng)、快速成像，三維成像時(shí)間分辨率遠(yuǎn)高于SMLM，可達(dá)1 Hz[6]，而且需要的光照劑量很小，不需要特殊的熒光蛋白，避免了對(duì)樣品的損傷和干擾，更適合活細(xì)胞成像過(guò)程觀測(cè).新出現(xiàn)的海森結(jié)構(gòu)光照明顯微[9]和掠入射結(jié)構(gòu)光超分辨顯微技術(shù)進(jìn)一步提高了SIM 時(shí)空分辨率，實(shí)現(xiàn)了優(yōu)于100 nm 分辨率的長(zhǎng)時(shí)程、快速超分辨成像，幀頻達(dá)到200 fps 左右，但成像深度仍然有限.目前，寬場(chǎng)SIM 成像深度一般在20 μm 以?xún)?nèi)，無(wú)法對(duì)深層組織進(jìn)行超分辨成像，主要原因在于寬場(chǎng)照明光容易受到樣品不均勻性和散射作用的影響.為了進(jìn)一步提升SIM 的成像深度，2010 年，Müller 和 Enderlein[11]提出了一種新型點(diǎn)掃描結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)，命名為圖像掃描顯微(image scanning microscopy，ISM)，它用陣列探測(cè)器代替?zhèn)鹘y(tǒng)的共焦顯微鏡的點(diǎn)探測(cè)器，利用數(shù)字像素重定位后續(xù)圖像處理技術(shù)，在保持高信噪比的同時(shí)將成像分辨率提升至寬場(chǎng)照明成像的1.63 倍.然而，由于受到EMCCD 相機(jī)幀頻的限制，ISM 獲取一個(gè)2 μm×2 μm 的樣品信息需要花費(fèi)25 s 的成像時(shí)間，極大限制了其應(yīng)用.為了解決這一問(wèn)題，2012 年York 等[12]提出了多焦點(diǎn)結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)(multifocal structured illumination microscopy，MSIM)，采用高速數(shù)字微反射鏡器件 (digital micromirror device，DMD)同時(shí)實(shí)現(xiàn)多焦點(diǎn)結(jié)構(gòu)光的產(chǎn)生和掃描，通過(guò)數(shù)字像素重定位和解卷積技術(shù)進(jìn)行超分辨圖像重構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了在成像深度50 μm 內(nèi)的橫向約145 nm、軸向約400 nm 的空間分辨率和1 Hz 時(shí)間分辨率的三維超分辨成像，為活體厚樣品的超分辨成像提供了強(qiáng)有力的工具.2013 年，Schulz 等[13]提出了基于轉(zhuǎn)盤(pán)式共聚焦顯微鏡的ISM，其成像處理步驟與MSIM基本一致，但光學(xué)系統(tǒng)相對(duì)復(fù)雜.德國(guó)Zeiss 公司于2014 年起，在共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上，推出了多種型號(hào)的基于Airyscan 探測(cè)器的ISM，成像速度和信噪比獲得很大的提升.隨后，研究人員為了進(jìn)一步提高ISM 的成像速度、簡(jiǎn)化后續(xù)圖像處理過(guò)程，發(fā)展了多種基于光學(xué)像素重定位技術(shù)的ISM，如瞬時(shí)結(jié)構(gòu)光照明超分辨顯微[14]、二次掃描共聚焦顯微[15]和光學(xué)光子再分配顯微[16]等.雖然，這些系統(tǒng)不依賴(lài)于后期的像素重定位技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)超分辨，但光學(xué)掃描系統(tǒng)復(fù)雜，光路準(zhǔn)直要求高，不便于實(shí)際操作和應(yīng)用.因此，ISM 顯微技術(shù)在成像速度、成像深度和功能上仍有很大的提升空間.

綜上，研究和開(kāi)發(fā)新型ISM 系統(tǒng)和方法，進(jìn)一步提升其性能，使其更適用于活體厚樣品的快速三維高分辨成像，對(duì)于生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究具有重要的意義.本課題組在前期的研究工作中，提出基于多重測(cè)量矢量模型的稀疏貝葉斯學(xué)習(xí)(multiple measurement vector sparse bayesian learning，MSBL)的MSIM 圖像重構(gòu)算法(MSIMMSBL)[17]，不需要估計(jì)多焦點(diǎn)的空間位置信息，將重建過(guò)程視為多重探測(cè)矢量的重建問(wèn)題，簡(jiǎn)化了處理步驟，并進(jìn)一步提高了MSIM 的空間分辨率.在前期工作基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步提高M(jìn)SIM 的分辨率、成像速度和信噪比，本文提出了一種平場(chǎng)復(fù)用的多焦點(diǎn)結(jié)構(gòu)光照明顯微成像方法(flat-field multiplexed MSIM，F(xiàn)M-MSIM)和系統(tǒng)，通過(guò)在照明光路中引入光束整形器件，將高斯光束轉(zhuǎn)變?yōu)槠巾敼馐?，獲得成像視場(chǎng)內(nèi)更加均勻的激發(fā)點(diǎn)陣，提高系統(tǒng)分辨率;通過(guò)設(shè)計(jì)新的“4×1”多像素復(fù)用多焦點(diǎn)照明模式，采集的點(diǎn)陣源圖像僅為MSIM 中所采用“1×1”單像素多焦點(diǎn)照明模式的1/4，大大提高了MSIM 的成像速度和信噪比;結(jié)合 MSBL 進(jìn)行超分辨圖像處理，得到約2 倍于寬場(chǎng)顯微分辨率的提升.設(shè)計(jì)和搭建了FM-MSIM 系統(tǒng)，開(kāi)展了細(xì)胞微管樣片和小鼠腎切片標(biāo)準(zhǔn)樣片的超分辨顯微成像實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了系統(tǒng)的分辨率和視場(chǎng);編制了MSBL 圖像重構(gòu)程序，實(shí)現(xiàn)了厚樣品的超分辨三維圖像重構(gòu).實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了系統(tǒng)同時(shí)提升了MSIM 的時(shí)空分辨率和信噪比，為MSIM 發(fā)展及其在活體厚樣品快速高分辨成像方面的應(yīng)用提供了理論和技術(shù)基礎(chǔ).

2 FM-MSIM 系統(tǒng)與方法

2.1 系統(tǒng)設(shè)計(jì)與搭建

所搭建的FM-MSIM 系統(tǒng)光路如圖1 所示.首先，一臺(tái)功率為200 mW，波長(zhǎng)為488 nm 的固體激光器(Sapphire 488-200CW CDRH，相干，美國(guó))發(fā)出的激光束經(jīng)過(guò)一個(gè)由透鏡L1 (f1=10 mm)和L2 組成的4f系統(tǒng) (f2=75 mm)將光束直徑擴(kuò)大到原來(lái)直徑的7.5 倍;然后，經(jīng)一個(gè)光束整形器BeamShaper (TopShape，TSM25-10-D-D-355，Asphericon Inc.美國(guó))將高斯光束轉(zhuǎn)化為平場(chǎng)光束;平場(chǎng)光束與DMD 面板法線(xiàn)呈24°角照射在DMD 光學(xué)面上，并被‘on’狀態(tài)的微鏡反射進(jìn)入由透鏡L3 (f3=75 mm)和L4 (f4=75 mm)組成的4f濾波系統(tǒng)，在其頻譜平面上放置一個(gè)可調(diào)式針孔光闌來(lái)阻擋DMD 的多余衍射級(jí)的反射光，以免產(chǎn)生雜散光干擾.經(jīng)DMD 調(diào)控的反射光束會(huì)聚在4f濾波系統(tǒng)中透鏡L4 的后焦面上形成稀疏的激發(fā)點(diǎn)陣，并且其位置與管鏡TL1 (fTL1=300 mm)前焦面重合，確保DMD 的光學(xué)反射面與管鏡的前焦面共軛，激發(fā)濾光片F(xiàn)1 放置在管徑TL1 后面用來(lái)防止雜散光進(jìn)入顯微鏡;最終，激發(fā)點(diǎn)陣經(jīng)過(guò)由管鏡TL1 和物鏡(60×，NA=1.27，尼 康，日本)構(gòu)成的顯微系統(tǒng)，尺寸縮小為原來(lái)的1/90 后成像到樣品面上并形成最終的激發(fā)模式.樣品經(jīng)激發(fā)后發(fā)出的熒光經(jīng)同一個(gè)物鏡、雙色片和發(fā)射濾光片F(xiàn)2 后，再經(jīng)成像管鏡TL2 (fTL2=200 mm)成像到高靈敏度sCMOS相機(jī)(ORCA-Fusion BT，像素?cái)?shù)2304×2304，像素尺寸6.5 μm×6.5 μm，濱松，日本)上.實(shí)驗(yàn)中，DMD 面板的像素?cái)?shù)為1024×768，每個(gè)像素尺寸大小為10.8 μm×10.8 μm，經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)縮小為原來(lái)的1/90后，其在樣品面上的對(duì)應(yīng)大小為120 nm×120 nm.在FM-MSIM數(shù)據(jù)采集過(guò)程中，為了實(shí)現(xiàn)掃描和數(shù)據(jù)采集的同步，使用Labview 軟件通過(guò)采集卡(NI USB-6363，美國(guó))分別控制DMD、三維納米位移臺(tái) (E545，PI，德國(guó))和sCMOS 相機(jī).

圖1 FM-MSIM 系統(tǒng)光路示意圖Fig.1.Schematic diagram of FM-MSIM system.

2.2 平場(chǎng)照明

在FM-MSIM 系統(tǒng)的激發(fā)光路中引入光束整形器件，將入射的準(zhǔn)直高斯光束整形為準(zhǔn)直的平頂光束，入射到DMD 反射面上的光強(qiáng)分布的均勻性得到了很大改善，獲得了光強(qiáng)分布更加均勻的激發(fā)點(diǎn)陣，并且最大限度地利用DMD 的面板來(lái)獲得更大的照明視場(chǎng).首先，利用羅丹明均勻溶液對(duì)光束整形器件的平場(chǎng)照明效果進(jìn)行了測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示.圖2(a)和圖2(b)分別為無(wú)光束整形器和有光束整形器的羅丹明均勻溶液寬場(chǎng)成像圖，圖2(c)為沿中心一條直線(xiàn)處的歸一化光強(qiáng)分布輪廓圖，可以明顯看出經(jīng)過(guò)光束整形器調(diào)制后的光強(qiáng)分布更加均勻;圖2(d)和圖2(e)為有無(wú)光束整形器的激發(fā)點(diǎn)陣效果對(duì)比圖，同樣可以看出經(jīng)調(diào)制后可以得到更加均勻的激發(fā)點(diǎn)陣，從而改善后續(xù)的熒光成像和超分辨圖像重建.

圖2 平場(chǎng)照明實(shí)驗(yàn)表征 (a)無(wú)光束整形器的羅丹明均勻溶液寬場(chǎng)成像;(b)有光束整形器的羅丹明均勻溶液寬場(chǎng)成像;(c)圖(a)和圖(b)中藍(lán)色虛線(xiàn)部分布?xì)w一化強(qiáng)度輪廓圖;(d)無(wú)光束整形器的激發(fā)點(diǎn)陣;(e)有光束整形器的激發(fā)點(diǎn)陣Fig.2.Experimental characterization of flat-field illumination:(a) Wide field imaging of uniform Rhodamine 6 G solution without a beam shaper;(b) wide field imaging of uniform Rhodamine 6 G solution with a beam shaper;(c) normalized intensity fitting profiles along blue dotted line in panel (a) and panel (b);(d) a multifocal excitation pattern without a beam shaper;(e) a multifocal excitation pattern with a beam shaper.

2.3 復(fù)用的多焦點(diǎn)結(jié)構(gòu)光照明圖案

在MSIM 中[12]，利用一個(gè)DMD 同時(shí)實(shí)現(xiàn)激發(fā)點(diǎn)陣的產(chǎn)生和數(shù)字掃描，具體實(shí)現(xiàn)方式如下，根據(jù)DMD 工作基本原理，當(dāng)光束以特定角度入射DMD 面板時(shí)，每個(gè)處于工作on 狀態(tài)的微反射鏡都在樣品面對(duì)應(yīng)位置產(chǎn)生一個(gè)衍射受限激發(fā)點(diǎn)，只要將一些特定位置的微反射鏡處于工作on 狀態(tài)就能在樣品面上獲得規(guī)則的多焦點(diǎn)激發(fā)模式.實(shí)際操作時(shí)，通過(guò)控制軟件加載相同尺寸的黑白圖片來(lái)決定DMD 上微反射鏡的工作狀態(tài)，當(dāng)加載的圖片黑白像素點(diǎn)的位置發(fā)生變化時(shí)對(duì)應(yīng)的DMD 微反射鏡工作狀態(tài)也產(chǎn)生相應(yīng)的改變，從而形成我們想要的激發(fā)模式.然而，在最初的MSIM 的激發(fā)點(diǎn)陣圖案中，每個(gè)激發(fā)點(diǎn)采用DMD 上“1×1”處于on 狀態(tài)的像素構(gòu)成，考慮到圖像信噪比，設(shè)置點(diǎn)陣間隔為14 pixels×16 pixels，則需要采集224 幅點(diǎn)陣源圖像來(lái)重構(gòu)一幅超分辨圖像;對(duì)于480×480 視場(chǎng)，相機(jī)幀頻222 Hz，超分辨成像速度大約1 Hz，相對(duì)較慢;而且光能利用率非常低，造成圖像的信噪低，影響超分辨圖像的重構(gòu)，因此，需要發(fā)展新的MSIM照明圖案.

基于此，在FM-MSIM 中，考慮到點(diǎn)陣圖像的信噪比，設(shè)計(jì)了新的“4×1”多像素復(fù)用多焦點(diǎn)照明模板，相當(dāng)于4 行像素同時(shí)并行掃描，匹配點(diǎn)陣模板尺寸，點(diǎn)陣間隔設(shè)置為16 pixels×18 pixels，則掃描步數(shù)為72，而普通“1×1”單像素多焦點(diǎn)照明模式的掃描步數(shù)288，如圖3 所示，普通“1×1”單像素多焦點(diǎn)照明模式在y方向上的掃描步數(shù)為“4×1”多像素復(fù)用多焦點(diǎn)照明模式的4 倍，因此，利用新型模板掃描的成像速度是原先模板掃描速度的4 倍;在同樣的激發(fā)光強(qiáng)度下，經(jīng)DMD 反射的光能量利用率變?yōu)樵瓉?lái)的4 倍;利用羅丹明均勻染料樣品的點(diǎn)陣熒光圖像，根據(jù)信噪比的計(jì)算公式10log10(Isignal/Inoise)，計(jì)算激發(fā)點(diǎn)陣的平均峰值信噪比約提高了20%.圖3(a)為4×1 激發(fā)點(diǎn)陣模板掃描原理示意圖，每次移動(dòng)1 個(gè)像素點(diǎn)，對(duì)應(yīng)樣品面上移動(dòng)120 nm.圖3(b)為普通1×1 激發(fā)點(diǎn)陣模板掃描原理圖，圖3(c)為單張點(diǎn)陣圖的羅丹明均勻染料熒光圖像.

圖3 復(fù)用多焦點(diǎn)照明原理圖 (a) 4×1 激發(fā)點(diǎn)陣掃描原理圖;(b) 1×1 激發(fā)點(diǎn)陣掃描原理圖;(c)復(fù)用的多焦點(diǎn)激發(fā)羅丹明均勻染料樣品熒光圖像Fig.3.Schematic diagram of multiplexed multifocal excitation illumination:(a) Schematic diagram of 4×1 excitation spot array scanning;(b) schematic diagram of 1×1 excitation spot array scanning;(c) fluorescece image of the excitation foci in a uniform solution of Rhodamine 6G at the sample plane.

2.4 超分辨圖像重構(gòu)方法

MSIM[12]超分辨重構(gòu)需要經(jīng)過(guò)數(shù)字像素重定位技術(shù)，即多焦點(diǎn)位置標(biāo)定、數(shù)字針孔濾波、圖像縮放、求和等4 個(gè)圖像處理步驟來(lái)重建超分辨圖像，然后再經(jīng)過(guò)解卷積來(lái)進(jìn)一步提升圖像的分辨率，最終獲得2 倍于寬場(chǎng)顯微鏡的分辨率.在數(shù)字像素重定位過(guò)程中，多焦點(diǎn)參考位置的精確估計(jì)，對(duì)于MSIM 重建算法至關(guān)重要.本課題組在前期的研究工作中，提出的MSBL 圖像重構(gòu)算法[17]，并不需要估計(jì)多焦點(diǎn)的空間位置，將重建過(guò)程視為多重探測(cè)矢量的重建問(wèn)題，簡(jiǎn)化了處理步驟，而且進(jìn)一步提高了MSIM 的空間分辨率.在FM-MSIM中，由于采用了新的結(jié)構(gòu)光照明圖案，在MSBL 圖像重構(gòu)算法中，對(duì)照明模板作相應(yīng)修改即可.

利用MSBL 進(jìn)行的超分辨圖像重構(gòu)的基本原理如下:樣品被第m個(gè)激發(fā)模式em(r)照射時(shí)，像面上的熒光強(qiáng)度分布ym(r)可表示為

式中，s(r) 為樣品的結(jié)構(gòu)信息，em(r)為激發(fā)多焦點(diǎn)的強(qiáng)度分布，在本文中為新設(shè)計(jì)的多像素復(fù)用多焦點(diǎn)陣列模板，P SFdet(r)為系統(tǒng)探測(cè)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù).基于壓縮感知理論，將連續(xù)信號(hào)轉(zhuǎn)換成離散信號(hào)表示，其中第m個(gè)激發(fā)模式在空間中的強(qiáng)度分布表示為em，對(duì)應(yīng)的樣品發(fā)射的熒光信號(hào)為vmS·em，其中Sdiag(s1，···，sN)為非負(fù)對(duì)角矩陣，表示N像素網(wǎng)格化的結(jié)構(gòu)信息.將樣品熒光信息卷積 P SFdet(r)的過(guò)程用矩陣H表示，則(1)式改寫(xiě)為

其中矩陣Y和H分別代表熒光點(diǎn)陣圖像序列和光學(xué)系統(tǒng)的響應(yīng)函數(shù)，S和E分別為樣品的真實(shí)結(jié)構(gòu)信息和光學(xué)系統(tǒng)的激發(fā)模式.而(2)式又可進(jìn)一步改寫(xiě)成

其中Y[y1，y2，···，yN]，其中ym是由第m張點(diǎn)陣數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換來(lái)的列向量，H是測(cè)量矩陣，XS·E[x1，x2，···，xN]，xm則是s(r)·em(r)得 來(lái)的列向量，S和E分別為s(r)和em(r)構(gòu)成的矩陣，于是，整個(gè)圖像重構(gòu)過(guò)程如圖4 所示.

首先，將所有的探測(cè)圖像序列和系統(tǒng)PSF 根據(jù)圖4(a)和圖4(b)轉(zhuǎn)換成矩陣形式.其中Y矩陣的每一個(gè)列矢量對(duì)應(yīng)一幅探測(cè)圖像，而H的第i列對(duì)應(yīng)著當(dāng)樣品中只有一個(gè)分子發(fā)射熒光，且它的位置隨著圖4(b)中的箭頭移動(dòng)到第i個(gè)位置處時(shí)，得到的探測(cè)圖像.假設(shè)每幅探測(cè)圖像的尺寸為m×n、超分辨成像的尺寸為m0×n0(m0，n0＞m，n)、探測(cè)圖像數(shù)量為N，則對(duì)應(yīng)矩陣Y，H和X的大小分別為mn×N，mn×m0n0，和m0n0×N.由于X=SE，X中的所有列矢量具有相同的空間支撐，并且這個(gè)空間支撐與S相同，因此重構(gòu)X的問(wèn)題可以作為一個(gè)多測(cè)量矢量問(wèn)題.

圖4 原始數(shù)據(jù)與系統(tǒng)PSF 轉(zhuǎn)換為矩陣形式的過(guò)程 (a) FM-MSIM 點(diǎn)陣數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為矩陣Y;(b)系統(tǒng)PSF 轉(zhuǎn)換為矩陣HFig.4.Process of converting raw images and system PSF into matrix form:(a) FM-MSIM multifocal patterns data is converted to matrix Y;(b) System PSF is converted to matrix H.

其次，利用MSBL 算法來(lái)求解(4)式.根據(jù)貝葉斯推理，公式的解X′

由最大后驗(yàn)概率估計(jì)得到:

最后，估計(jì)值X′中所有的列矢量相加并轉(zhuǎn)換成一個(gè)大小為m0×n0的超分辨圖像.

通過(guò)上述算法流程，可以重構(gòu)出樣品的超分辨圖像.

3 成像結(jié)果與討論

3.1 細(xì)胞微管樣品的超分辨成像

為了驗(yàn)證FM-MSIM 系統(tǒng)的超分辨成像能力，首先利用Alexa Fluor 488 標(biāo)記的非洲綠猴腎細(xì)胞(BSC)微管樣品進(jìn)行系統(tǒng)的分辨率標(biāo)定.利用MSBL 算法分別對(duì)傳統(tǒng)的“1×1”多焦點(diǎn)點(diǎn)陣模板和新設(shè)計(jì)的“4×1 ”多像素復(fù)用點(diǎn)陣模板采集得到的圖像進(jìn)行超分辨重構(gòu)，得到的結(jié)果如圖5 所示.圖5(a)為減去背景噪聲的寬場(chǎng)圖像(subtract background widefield，SubWF)，圖5(b)為傳統(tǒng)“1×1”多焦點(diǎn)點(diǎn)陣模板得到的MSBL 重構(gòu)圖像，圖5(c)為“4×1 ”多像素復(fù)用點(diǎn)陣模板得到的MSBL 重構(gòu)圖像，圖5(d)和圖5(e)分別為圖中藍(lán)色和白色實(shí)線(xiàn)處的微管強(qiáng)度歸一化輪廓曲線(xiàn)，并對(duì)多組微管數(shù)據(jù)進(jìn)行了x，y兩個(gè)方向上的半高全寬(full width at half maximum，F(xiàn)WHM)值進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)計(jì)算，x方向由高斯擬合得到的FWHM 分別為(315 ±15) nm，(183 ± 10) nm，(162 ± 10) nm 同 理，y方向半高全寬分別為(306 ± 15) nm，(174 ± 10) nm，(169 ± 10) nm.可以看出，利用“4×1 ”多像素復(fù)用點(diǎn)陣模板采集得到的數(shù)據(jù)經(jīng)超分辨重構(gòu)后的圖像分辨率略高，原因在于使用其對(duì)樣品進(jìn)行掃描時(shí)得到的熒光強(qiáng)度更強(qiáng)，在相同的激光功率以及采集頻率150 Hz 情況下，擁有更高的信噪比，這也導(dǎo)致經(jīng)MSBL 算法重構(gòu)后獲得的分辨率更高，基本達(dá)到了寬場(chǎng)顯微分辨率的2 倍.此外，實(shí)驗(yàn)中使用的傳統(tǒng)的“1×1”多焦點(diǎn)點(diǎn)陣模板的掃描步數(shù)為288，采集一幅二維圖像所需時(shí)間約為1.92 s，而使用“4×1 ”多像素復(fù)用照明模板的掃描步數(shù)72，采集一幅二維圖像僅需約0.48 s，可以看出FMMSIM 的成像速度為原先MSIM 成像速度的4 倍.

圖5 FM-MSIM 分辨率標(biāo)定 (a)減去背景噪聲的寬場(chǎng)微管圖像;(b) 1×1 點(diǎn)掃模板的MSBL 重構(gòu)圖像;(c) 4×1 點(diǎn)掃模板的MSBL 重構(gòu)圖像;(d)藍(lán)色實(shí)線(xiàn)處微管強(qiáng)度輪廓線(xiàn);(e) 白色實(shí)線(xiàn)處微管強(qiáng)度輪廓線(xiàn)Fig.5.Resolution in FM-MSIM:(a) Wide field image of microtubule in BSCs labeled with Alexa Fluor 488 phalloidin by subtracting background noise;(b) MSBL reconstructed image of 1×1 point scan mode;(c) MSBL reconstructed image of 4×1 point scan mode;(d) plots of intensity along blue solid line in panels (a)—(c);(e) plots of intensity along white solid line in panels (a)—(c).

3.2 小鼠腎切片的三維超分辨成像

為了測(cè)試FM-MSIM 系統(tǒng)的三維成像能力，使用小鼠腎切片標(biāo)準(zhǔn)樣片(FluoCellTM prepared slide#3 mouse kidney section，*AF 488 WGA，AF568 phalloidin，Product of US)進(jìn)行成像.相機(jī)采集頻率200 Hz，使用“4×1 ”多像素復(fù)用點(diǎn)陣模板對(duì)樣品進(jìn)行二維橫向掃描，并通過(guò)Labview控制納米位移臺(tái)實(shí)現(xiàn)z軸步進(jìn)掃描成像，如圖6 所示，整個(gè)成像區(qū)域大小為55.3 μm×55.3 μm，每幅圖成像時(shí)間為0.36 s，軸向的成像位置分別是0，3 和6 μm.從圖6 可以明顯觀察到小鼠腎切片不同層樣品結(jié)構(gòu)的變化和超分辨的效果，同時(shí)，F(xiàn)MMSIM 處理后的圖像分辨率具有顯著的提高，進(jìn)一步驗(yàn)證了所提出和搭建的FM-MSIM 的三維超分辨成像能力.

4 結(jié)論

本文提出和搭建了一套基于數(shù)字微鏡器件和光束整形器件的平場(chǎng)復(fù)用的多焦點(diǎn)結(jié)構(gòu)光照明快速超分辨顯微成像系統(tǒng).利用DMD 同時(shí)完成了新型“4×1 ”多像素復(fù)用點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)光的產(chǎn)生和快速掃描，提高了信噪比，減少了采樣時(shí)間，成像速度提升為原來(lái)MSIM 成像速度的4 倍;同時(shí)，在系統(tǒng)中加入了光束整形器，將高斯分布的光束調(diào)制為均勻分布的平場(chǎng)光束，提高了點(diǎn)陣均勻性和系統(tǒng)分辨率;建立了基于多重測(cè)量矢量模型的稀疏貝葉斯學(xué)習(xí)FM-MSIM 圖像重構(gòu)算法，實(shí)現(xiàn)了超分辨圖像重構(gòu).最后，利用該系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞微管和小鼠腎切片進(jìn)行三維超分辨成像，證明了該系統(tǒng)具有快速三維超分辨成像能力，為進(jìn)一步開(kāi)展活細(xì)胞及組織的超分辨成像打下了基礎(chǔ).