◎ 高雅倩，馬詩經(jīng)，林 麗，楊宜婷

（1.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510623；2.廣州市康倫生物技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510000）

食用菌多糖是一種特殊的生物活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫的功能，國際上將食用菌多糖稱為“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物”[1]。茶樹菇（Agrocybe aegerita）隸屬于擔(dān)子菌綱、傘菌目、糞銹傘科、田蘑屬[2]，是溫帶至亞熱帶地區(qū)從春季至秋季生長的一種食用菌[3]，中醫(yī)認(rèn)為其具有健脾、利尿、止瀉滲濕等多種效果。研究表明，茶樹菇含有氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分[4-5]。茶樹菇多糖基本結(jié)構(gòu)以β-（1→6）-支鏈（1→3）-β-D-葡聚糖為主鏈[6-7]，其單糖組成為葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖和木糖等[8]。研究證實，茶樹菇多糖具有抗衰老[9]、抗腫瘤[10]、增強(qiáng)免疫力[11]、抗氧化[12]等生物活性。

茶樹菇多糖提取工藝研究包括以茶樹菇子實體或粗碎粉為原料，經(jīng)超聲波與微波提取、堿法提、酶法提及熱水浸提等工藝制備[13-14]，而茶樹菇多糖主要存在于茶樹菇子實體細(xì)胞的細(xì)胞壁內(nèi)，其細(xì)胞壁具有蛋白質(zhì)、多糖結(jié)合的結(jié)構(gòu)，因此，上述方法難以破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，充分釋放出多糖。本研究對茶樹菇采用超微粉碎處理后再進(jìn)行熱水浸提，通過單因素與正交試驗方法優(yōu)化分析了茶樹菇多糖提取工藝中提取溫度、料液比、提取時間、提取次數(shù)因素的影響，將最佳工藝所得茶樹菇粗多糖通過不同濃度乙醇醇沉法進(jìn)一步純化，得到純化后茶樹菇多糖，測定并分析其抗氧化活性，為茶樹菇在抗氧化食品方面的研究開發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶樹菇干制品，由廣州市康倫生物技術(shù)有限公司提供；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%），購自阿拉?。ˋladdin）試劑公司；無水乙醇、濃硫酸、苯酚等均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠；蒸餾水為實驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀1510：美國Thermo Fisher公司；紫外可見光分光光度計UV-3600 Plus：SHIMADZU公司；超微粉碎機(jī)WZJ-6B：濟(jì)南倍力粉體工程技術(shù)有限公司；電熱恒溫水浴鍋DK-S22：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；離心機(jī)Z326K：德國Hermle公司；數(shù)控超聲波清洗器KQ3200DE：昆山市超聲儀器有限公司；高速萬能粉碎機(jī)DYF-400C：上海利聞科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 茶樹菇多糖的提取

茶樹菇干制品置于60 ℃烘箱干燥20 min后，經(jīng)高速萬能粉碎機(jī)粉碎并過100目篩，然后用超微粉碎機(jī)進(jìn)行超微粉碎10 min，得到茶樹菇超微粉，備用。

稱取茶樹菇超微粉按設(shè)定液料比加入水，浸泡20 min后，再按實驗設(shè)計的液料比、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)進(jìn)行提取；茶樹菇提取液經(jīng)300目過濾后，置于65 ℃減壓濃縮至1/10體積，經(jīng)5 000 r·min-1離心10 min，取上層清液加入4倍體積的95%乙醇進(jìn)行沉淀后減壓抽濾，沉淀物依次用無水乙醇、丙酮洗滌后冷凍干燥，得茶樹菇多糖凍干粉，測定多糖得率。

1.3.2 茶樹菇多糖含量測定

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用苯酚硫酸法測定[15]。稱取適量葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，置于105 ℃烘箱中烘至恒重；稱取100 mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，在100 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，搖勻備用。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL置10 mL容量瓶，加蒸餾水定容，配制成含 葡 萄 糖 0 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1和 0.10 mg·mL-1的系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取上述系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，置10 mL具塞玻璃試管中，依次加入0.5 mL 5%苯酚溶液，2.5 mL濃硫酸搖勻，靜置5 min，于90 ℃水浴加熱20 min，然后冰浴冷卻至室溫，另取1 mL蒸餾水，按照上述操作，作為空白對照。將上述溶液分別在490 nm波長處測定吸光度值，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）茶樹菇多糖含量與得率測定。茶樹菇多糖得率測定。將茶樹菇多糖溶于水中，并稀釋至一定質(zhì)量濃度，吸取1 mL于具塞試管中，測定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出粗多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計算公式如下：

式中：X-茶樹菇多糖提取率，%；C-測得茶樹菇多糖的濃度，mg·mL-1；V-提取液的體積，mL；n-稀釋倍數(shù)；0.9-葡萄糖換算成多糖的正交系數(shù)；M-原料質(zhì)量，g。

1.3.3 茶樹菇多糖提取單因素試驗

以茶樹菇多糖得率為指標(biāo)，研究不同提取液料比、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)因素對茶樹菇多糖提取效果的影響。①確定時間2 h、提取溫度為100 ℃條件下，提取1次，探討提取液料比（mL∶g）為10∶ 1、20∶ 1、30∶1、40∶1和 50∶1對茶樹菇多糖提取率的影響。②確定提取液料比為30∶1、提取時間為2 h，提取1次條件下，探討不同提取溫度（70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃）對茶樹菇多糖提取率的影響。③確定提取溫度100 ℃，提取液料比為30∶1，提取1次條件下，探討不同提取時間（1 h、2 h、3 h、4 h和5 h）對茶樹菇多糖提取率的影響。④確定提取溫度100 ℃，提取液料比為30∶1，提取2 h條件下，探討不同提取次數(shù)（1次、2次、3次和4次）對茶樹菇多糖提取率的影響。

1.3.4 正交試驗

為了進(jìn)一步確定最佳提取條件，在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，以茶樹菇多糖得率為指標(biāo)，選取液料比A、提取溫度B、提取時間C3個因素進(jìn)行L9（33）正交試驗對提取條件進(jìn)一步優(yōu)化，因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.5 茶樹菇多糖醇沉處理試驗

采用不同濃度乙醇醇沉獲得茶樹菇多糖，取最佳工藝所得茶樹菇提取液，在65 ℃濃縮至提取液體積的1/10，濃縮液中加入4倍量體積的乙醇，使得溶液中乙醇終濃度為70%、80%，放置過夜后，于5 000 r·min-1離心10 min，去上清液得沉淀，冷凍干燥得茶樹菇多糖，記為C1、C2，進(jìn)行體外抗氧化活性測試。

1.3.6 茶樹菇多糖體外抗氧化實驗

參照文獻(xiàn)方法[16]，測定1.3.5項下的茶樹菇多糖C1、C2的DPPH自由基清除能力。取1 mL不同濃度（0.01 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1和 0.80 mg·mL-1）的 C1、C2溶液于試管中，分別加入1.0 mL 0.1 mmol·L-1DPPH溶液，充分混勻后避光反應(yīng)20 min，在517 nm處測定吸光度為Ai；對照組以無水乙醇代替DPPH，測定吸光度Aj；空白組以蒸餾水代替多糖溶液，測定吸光度為A0。DPPH自由基清除率=[A0-Ai+Aj]/A0×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，得到回歸方程y=8.875 7x-0.000 3，R2=0.999 6，表明葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在0.00～0.10 mg·mL-1內(nèi)濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2 茶樹菇多糖提取工藝優(yōu)化試驗結(jié)果

超微粉碎茶樹菇得到茶樹菇超微粉，并采用單因素與正交試驗優(yōu)化茶樹菇多糖的提取工藝，茶樹菇多糖提取實驗結(jié)果如圖2～圖5所示。

2.2.1 液料比對提取率的影響

由圖2可知，在茶樹菇超微粉熱水浸提過程中，隨著液料比的增加，茶樹菇多糖的得率明顯提高，表示較高的液料比增加了茶樹菇多糖在水中的溶出，液料比為40∶1時，茶樹菇多糖得率最高，液料比為50∶1的茶樹菇多糖得率與液料比為30∶1相比，并非顯著性增加，說明在此條件下，茶樹菇提取液料比為（20～40）∶1最為適宜。

2.2.2 提取溫度對提取率的影響

由圖3可知，而隨著提取溫度增加，多糖得率顯著增加，提取溫度為100 ℃時，茶樹菇多糖得率最高，表示溫度升高提高了茶樹菇超微粉中多糖的溶出速度。

2.2.3 提取時間對提取率的影響

由圖4可知，在提取時間由1 h提高至2 h時，多糖得率顯著增加，在提取3 h時多糖得率達(dá)到最大值，隨著提取時間增加，多糖得率呈下降趨勢，表示延長提取時間，促使茶樹菇中非多糖的水溶性成分溶出，所以多糖得率降低。

2.2.4 提取次數(shù)對提取率的影響

由圖5可知，進(jìn)一步地增加提取次數(shù)，茶樹菇多糖提取得率并非顯著升高，提取1次與2次多糖得率相差很小，提取2次及以上時，多糖得率沒有明顯增加，說明在設(shè)定條件下提取1次時，茶樹菇多糖已基本溶出完全。由上述結(jié)果可知，提取液料比、提取溫度及時間對茶樹菇多糖提取影響較大，需要進(jìn)一步優(yōu)化提取條件。

為對比茶樹菇超微粉碎后的提取增益效果，取高速粉碎后的茶樹菇碎粉按提取溫度100 ℃、液料比為30∶1、提取3 h條件下，提取1次時（離心、濃縮及醇沉工藝一致），茶樹菇多糖得率為6.36%±0.26%，明顯低于茶樹菇超微粉的多糖得率。由此可見，茶樹菇經(jīng)超微粉碎后，其細(xì)胞壁破碎，有利于多糖溶出而提高多糖得率。

2.2.5 提取工藝優(yōu)化

通過表2和表3分析結(jié)果可知，影響因素主次順序為B（提取溫度）＞A（液料比）＞C（提取時間）。試驗指標(biāo)值越大越好，由K值大小得出茶樹菇多糖的最佳提取條件為A2B3C2，即提取溫度100 ℃，液料比為30∶1，提取時間3 h，提取1次；由方差分析得出，提取溫度顯著影響茶樹菇多糖提取工藝（P＜0.05），提取液料比和提取時間無顯著影響。按最佳工藝條件提取茶樹菇多糖，平行3次，結(jié)果顯示茶樹菇多糖的平均得率為11.96%±1.06%，高于正交試驗中的最大值。

表2 提取工藝條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析表

表3 正交試驗方差分析結(jié)果表

2.3 茶樹菇多糖抗氧化實驗結(jié)果

不同醇沉濃度獲得茶樹菇多糖的抗氧化結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，茶樹菇多糖C1、C2對DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)出濃度依賴性，C1、C2在質(zhì)量濃度為0.01～0.80 mg·mL-1對DPPH自由基清除率范圍分別為3.12%～36.77%、4.31%～46.88%。從以上結(jié)果分析，不同乙醇濃度醇沉所得的茶樹菇多糖其抗氧化功效也有所差別，濃度越高效果較好。

3 結(jié)論

本研究用超微粉碎預(yù)處理熱水浸提法從茶樹菇中提取茶樹菇多糖，結(jié)果表明，各因素影響茶樹菇多糖提取率的主次順序為：提取溫度＞液料比＞提取時間，經(jīng)正交試驗方法得其最優(yōu)化工藝條件為提取溫度100 ℃，液料比為30∶1，提取時間3 h，提取1次。在最佳工藝條件下，茶樹菇多糖平均得率為11.96%±1.06%，茶樹菇多糖得率高于常規(guī)粉碎處理后熱水浸提工藝，說明該工藝方法可有效提高茶樹菇多糖得率。此外，不同乙醇濃度醇沉所得茶樹菇多糖對DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，以乙醇濃度高所得茶樹菇多糖抗氧化效果更好。