王潔如，勞雅詩，曾鑫海，梁惠芬，劉亞群，楊東娟，鄭玉忠，張振霞

（韓山師范學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，廣東 潮州 521041）

食道癌又稱食管癌，是常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率均較高［1］.它的出現(xiàn)與生活環(huán)境、飲食習(xí)慣、遺傳等因素息息相關(guān)；近些年，食道癌患病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，多發(fā)于40歲以上男性［2］.食管癌的典型癥狀表現(xiàn)為進(jìn)行性咽下困難，逐漸從硬到軟甚至到唾液也難以下咽，食道癌的發(fā)生會(huì)對(duì)患者的正常進(jìn)食及生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響［2-4］.食道癌中晚期患者難以根治，因此，早期診斷和早期有效治療對(duì)于提升患者治愈率至關(guān)重要.對(duì)于中晚期患者，即使結(jié)合手術(shù)和放化療等方法，也會(huì)給患者帶來很大的副作用，研究顯示食道癌術(shù)后不良癥狀發(fā)生率很高［5］，但其病發(fā)機(jī)制仍不清楚［4, 6］.

鬼針草（Bidens PilosaL.）作為一年生或多年生草本植物，莖直立，在我國各省均有分布，種類較多，為荒地雜草之一［7］.作為中國民間常用草藥，鬼針草最早記載于《本草拾遺》，性溫，味苦，無毒，全草均可入藥，有多種生物活性成分和廣泛的藥理作用［8-12］；藥效化學(xué)發(fā)現(xiàn)鬼針草含有大量黃酮類［11］、酚酸類等成分，具有清熱、解毒、散瘀、消腫等功效.現(xiàn)代研究認(rèn)為，鬼針草具有抑菌抗炎、抗干眼、抗衰老、抗病毒等作用；在降低患者血壓、減輕靶器官的損害方面具有重要作用［13］；能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，對(duì)白細(xì)胞增殖具有體外抑制作用［14］；對(duì)急性黃疸型肝炎［15］等有一定的治療作用.

本研究以食道癌細(xì)胞（KYSE150）為研究對(duì)象，研究鬼針草提取物對(duì)食道癌增殖、黏附、凋亡的影響，同時(shí)在分子層面上探討鬼針草提取物對(duì)食道癌的藥理機(jī)制.有效推動(dòng)中藥鬼針草在預(yù)防和治療食道癌中的運(yùn)用，降低食道癌的發(fā)病率.

1 材料

試劑：蘆丁（純度≧98%）、金絲桃苷（純度≧98%）、色譜級(jí)乙腈、色譜級(jí)甲醇、磷酸（AR）；DMEM 培養(yǎng)基、全組分牛血清白蛋白、胰蛋白酶粉；TRNzol Universal Reagent、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、無酶無菌水；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PowerUpTM SYBRTM Green、噻唑蘭（MTT）、纖連蛋白（FN）、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、過硫酸銨、四甲基乙二胺、十二烷基硫酸鈉、硝酸纖維素膜（NC 膜）、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence）；引物（生工生物工程股份有限公司）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、一抗（β-actin Mouse）、一抗（Bax Antibody）、二抗（Goat anti-Mouse IgG）、二抗（Goat anti-Rabbit IgG）.

儀器：高效液相色譜儀、Eclipse XDB 色譜柱、電子天平、PH 酸度計(jì)、恒溫水浴鍋、立式壓力蒸汽滅菌鍋、臺(tái)式高效冷凍離心機(jī)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、倒置顯微鏡、醫(yī)用超凈工作臺(tái)、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、超微量核酸蛋白測(cè)定紫外可見光光度計(jì)、旋渦混合器、二維搖床、酶標(biāo)儀、LightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（羅氏）、電轉(zhuǎn)印器、電泳儀、醫(yī)用低速離心機(jī).

2 方法

2.1 鬼針草提取物的制備

采摘新鮮的鬼針草，置于陽光下曬干.稱量100 g 曬干的鬼針草，剪碎置于鍋中，加入500 mL水，大火煮沸后中火熬煮2 h，撈出濾渣.濾渣繼續(xù)加300 mL 水，大火煮沸后中火熬煮1 h，撈出濾渣合并兩次濾液，再用過濾裝置過濾掉殘留的微小濾渣.繼續(xù)熬煮濃縮至接近稀稠狀，量取濾液總量，計(jì)算得出鬼針草提取物的濃度.

2.2 鬼針草提取物的分析

將標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解并稀釋至合適濃度，設(shè)置高效液相色譜儀相關(guān)參數(shù)，色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（Analytical 5 μm 4.6×250 mm）；流動(dòng)相A：0.1%磷酸水溶液，流動(dòng)相B：乙腈；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；吸光度：360 nm；柱溫：30 ℃.根據(jù)表1的高效液相洗脫程序?qū)σ合嗌V儀進(jìn)行方法設(shè)置，重復(fù)實(shí)驗(yàn).通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣品中蘆丁和金絲桃苷的濃度，計(jì)算其在樣品中所含含量.

表1 高效液相洗脫程序

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

將細(xì)胞狀態(tài)良好的食道癌接種于10 mL 培養(yǎng)皿（含血清和培養(yǎng)基）中，培養(yǎng)48 h，進(jìn)行細(xì)胞傳代，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.2×104個(gè)/mL.在96 孔板上標(biāo)記好加藥濃度、時(shí)間等信息，每孔接種200 μL 細(xì)胞液，靜置培養(yǎng)24 h.計(jì)算及預(yù)混含有不同濃度鬼針草提取物（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL）的新鮮DMEM，培養(yǎng)24 h 后，在避光條件下配置5 mg/mL 的MTT，加入20 μL/孔的MTT，培養(yǎng)4 h 后，加入150 μL/孔的DMSO.在二維搖床上震蕩15 min，用擦鏡紙擦拭96孔板底部后，在酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)OD值，利用軟件作圖得出細(xì)胞增殖的趨勢(shì).

2.4 黏附性法檢測(cè)細(xì)胞相互作用

取1 mL 的FN 工作液（0.2 mg/mL）用9 mL 的PBS 溶解稀釋，加入50 μL/孔稀釋后的FN 工作液于96孔培養(yǎng)皿中，用錫紙包裹做避光處理，置于冰箱中4 ℃培養(yǎng)24 h.取1 g的BSA粉末加50 mL的PBS 溶解，調(diào)節(jié)pH 至7.4 后，用0.22 μm 濾膜過濾除菌，加入100 μL/孔封閉液封閉1 h.每孔加入含有不同濃度鬼針草提取物和DMEM 的混合液（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL），培養(yǎng)1.5 h 后，在避光條件下配置5 mg/mL 的MTT，加入20 μL/孔的MTT，培養(yǎng)4 h后，加入150 μL/孔的DMSO.在二維搖床上震蕩15 min， 于酶標(biāo)儀490 nm 處檢測(cè)其吸光度，利用軟件作圖得出細(xì)胞的黏附趨勢(shì).

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞基因表達(dá)

將細(xì)胞濃度調(diào)整為1.8×105個(gè)/mL 的細(xì)胞液接種于6 孔培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h，分別加入含有不同濃度鬼針草提取物（0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）的DMEM 的混合液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h.用PBS清洗細(xì)胞兩次后備用.采用TRIzol 法分離和提取總RNA，用賽默科技的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA.

在NCBI設(shè)計(jì)引物，得到所需信息，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行引物合成.引物信息如表2 所示，以β-actin為內(nèi)參，加入正向和反向引物，以及試劑盒中其他反應(yīng)液，形成PCR反應(yīng)體系，設(shè)置PCR反應(yīng)程序，進(jìn)行擴(kuò)增，得到相關(guān)基因的表達(dá)量.

表2 引物序列信息

2.6 蛋白免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

將細(xì)胞接種于10 mL 培養(yǎng)皿中，細(xì)胞生長覆蓋率為70%時(shí)，用PBS 清洗細(xì)胞后，分別加入含有不同濃度鬼針草提取物和DMEM 的混合液（0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用PBS 清洗細(xì)胞兩次后備用.使用RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白；采用BCA法定量蛋白，按試劑盒操作，繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定蛋白濃度，確保等量的細(xì)胞進(jìn)行電泳上樣.用SDS-聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)分離蛋白樣品，濃縮膠80 V 恒壓電泳20 min，分離膠120 V恒壓電泳110 min，然后電轉(zhuǎn)至NC膜.脫脂奶粉封閉60 min，4 ℃孵育一抗16 h以上.一抗?jié)舛确謩e為Bax（1：2 500）、β-actin（1：5 000）.洗膜后加入二抗（1：10 000），4 ℃孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影.進(jìn)行FCQ拍攝，測(cè)定條帶灰度值并計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量.

2.7 數(shù)據(jù)分析

該研究所得數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用Origin 軟件進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.各組間數(shù)據(jù)比較分析采用Tukey檢驗(yàn).*表示P＜0.05，為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.**表示P＜0.01，為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

3 結(jié)果

3.1 鬼針草提取物的濃度測(cè)定

100 g 曬干的鬼針草，加水熬煮，重復(fù)兩次，合并濾液繼續(xù)濃縮至稀稠狀，量取濾液，計(jì)算得到鬼針草提取物物質(zhì)含量為145.625 mg/mL.

3.2 鬼針草提取物含量分析

根據(jù)HPLC 檢測(cè)結(jié)果，制得蘆丁和金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，蘆丁Y=15033X+43.683（R2=0.999 9）、金絲桃苷Y=205 66X+37.807（R2=0.999 5）.利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，可知在鬼針草提取物中，蘆丁含量為0.996 mg/g、金絲桃苷含量為1.390 mg/g.

3.3 鬼針草提取物對(duì)食道癌細(xì)胞增殖的影響

如圖1（抑制增殖*P＜0.05，**P＜0.01）可知鬼針草提取物對(duì)食道癌細(xì)胞的抑制作用整體上呈抑制作用加強(qiáng)的趨勢(shì).藥物濃度大于1 mg/mL時(shí)抑制作用明顯，且其抑制效果具有顯著的量效關(guān)系.初步說明鬼針草提取物能抑制食道癌細(xì)胞的增殖活動(dòng).

圖1 鬼針草提取物對(duì)食道癌細(xì)胞增殖的抑制作用

3.4 鬼針草提取物對(duì)食道癌細(xì)胞黏附的影響

細(xì)胞黏附分子使細(xì)胞-基質(zhì)-細(xì)胞間發(fā)生黏附，以受體-配體結(jié)合的形式發(fā)揮作用，參與細(xì)胞的增殖與分化，是檢驗(yàn)?zāi)[瘤轉(zhuǎn)、移免疫應(yīng)答等的必要手段.如圖2（抑制黏附*P＜0.05）所示，在藥物濃度為1.4 mg/mL 時(shí)，鬼針草提取物對(duì)食道癌細(xì)胞參與黏附的活動(dòng)起顯著的抑制作用，進(jìn)一步表明鬼針草能抑制食道癌細(xì)胞間的信息交流與遷移.

圖2 鬼針草提取物對(duì)食道癌細(xì)胞黏附特性的抑制作用

3.5 鬼針草提取物對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響

鬼針草提取物對(duì)食道癌增殖具有抑制作用，可能與凋亡基因表達(dá)有關(guān)聯(lián).結(jié)果如圖3（促進(jìn)基因表達(dá)*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）所示，鬼針草提取物能刺激細(xì)胞凋亡基因Bak、Bax、Fas、P53的mRNA 表達(dá)量呈劑量依賴的上升趨勢(shì)，其中對(duì)Bak和Bax的影響比后兩者更加顯著，說明鬼針草對(duì)細(xì)胞促凋亡基因的影響有差異，可能是由于不同凋亡基因的作用機(jī)制不同.

圖3 鬼針草提取物對(duì)基因表達(dá)的影響

3.6 鬼針草提取物對(duì)BAX蛋白表達(dá)的影響

以β-Actin 為內(nèi)參，研究鬼針草提取物對(duì)BAX 蛋白表達(dá)量的影響，如圖4 和圖5（促進(jìn)蛋白表達(dá)*P＜0.05）所示，鬼針草提取物能誘導(dǎo)BAX 蛋白表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，且濃度越高，上調(diào)越明顯.與Bax基因的mRNA表達(dá)量趨勢(shì)相似，從蛋白水平上驗(yàn)證了鬼針草對(duì)食道癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng).

圖4 鬼針草提取物對(duì)BAX蛋白表達(dá)的影響

圖5 鬼針草提取物對(duì)BAX蛋白表達(dá)量的影響

4 結(jié)論與討論

鬼針草為中國民間常用草藥，主治多種炎癥，具有清熱解毒、散瘀活血的功效［7］.近年研究發(fā)現(xiàn)，鬼針草提取物具有抗腫瘤作用［16］，但其作用機(jī)制尚不清楚.鬼針草主要成分是黃酮類化合物，在降低血壓、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤以及抗炎等方面具有顯著的藥理作用［17］.鬼針草黃酮類物質(zhì)中，主要有槲皮素、蘆?。?8］、金絲桃苷、木犀草素等，其中蘆丁和金絲桃苷具有一定的抑癌作用［19-21］，因此鬼針草在抗癌研究上具有良好的前景.

為此，本文研究了鬼針草對(duì)食道癌的抑制作用及機(jī)制.結(jié)果顯示，高濃度的鬼針草提取物能抑制食道癌的細(xì)胞增殖，對(duì)食道癌細(xì)胞黏附活動(dòng)起到一定抑制作用，破壞了食道癌細(xì)胞間的信息交流與轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.說明鬼針草作為民間常用草藥在預(yù)防以及治療癌癥中具有抑制癌細(xì)胞增殖擴(kuò)散、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，從而發(fā)揮其藥性.

我國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一，且只能早發(fā)現(xiàn)早治療，其治愈率也不高.對(duì)此，本文進(jìn)一步研究鬼針草對(duì)不同的細(xì)胞凋亡基因的調(diào)節(jié)作用.結(jié)果顯示，鬼針草提取物能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡基因Bak、Bax、Fas、P53的mRNA 表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，其中對(duì)前兩者的影響比后兩者的更顯著，說明鬼針草對(duì)細(xì)胞凋亡基因的影響有差異.本文還研究了鬼針草提取物對(duì)BAX 蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果表明BAX蛋白表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)，說明鬼針草可以通過調(diào)控BAX 蛋白表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.通過查閱大量文獻(xiàn)，Bax促凋亡基因不是單獨(dú)起作用，而是與P53、Bcl-2等基因通過不同比例而共同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［22］；對(duì)于正常細(xì)胞來說，通過下調(diào)Bax/Bcl-2 的比例抑制正常細(xì)胞的凋亡［23］；對(duì)于癌細(xì)胞來說，可以通過Akt/Bcl-2/Bax信號(hào)通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，抑制增殖，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤的作用［24］.從總體而言，鬼針草可能主要是通過增加Bax的mRNA 量，導(dǎo)致其蛋白表達(dá)量的增加，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡.因?yàn)椋车腊┘?xì)胞周期調(diào)節(jié)的關(guān)鍵蛋白Cyclin D1 與Cyclin E 的表達(dá)下調(diào)，將食道癌阻滯于G0/G1期，其機(jī)制可能系BAX 蛋白上調(diào)所介導(dǎo)的［25］.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試驗(yàn)表明，凋亡蛋白BAX 蛋白的上調(diào)激活了線粒體通路，破壞線粒體膜電位，導(dǎo)致了凋亡的發(fā)生［26］.

綜上所述，鬼針草提取物對(duì)食道癌的增殖、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散具有一定的抑制作用；對(duì)細(xì)胞促凋亡基因Bak、Bax、Fas、P53的mRNA 表達(dá)量呈上升趨勢(shì)；進(jìn)一步上調(diào)BAX 蛋白表達(dá)量，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.目前，國內(nèi)在鬼針草的作用機(jī)制這方面的研究較少，如細(xì)胞膜、靶細(xì)胞、BMP、Wnt等信號(hào)通路，有待進(jìn)一步深入探究分析，后續(xù)研究可以主要集中在鬼針草對(duì)食道癌產(chǎn)生抑制機(jī)制的信號(hào)通路，或以小鼠模型加以驗(yàn)證，進(jìn)一步完善鬼針草的作用機(jī)制，為后續(xù)治療食道癌提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù).