余瀟，趙振寧，杜春

（1.西南林業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南 昆明 650224）

千果欖仁（Terminalia myriocapraVaniot Huerck et Muell.-Arg.）又名大馬纓子花、千紅花樹，為使君子科訶子屬的常綠高大喬木［1］，是國家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物，在《中國生物多樣性紅色名錄-高等植物卷》中被評(píng)定為易危（VU）物種。一般多散生于熱帶雨林、季雨林及南亞熱帶季風(fēng)常綠闊葉林的河岸和溝谷地帶中，與團(tuán)花樹、八寶樹、南酸棗一起成為適生地習(xí)見的林內(nèi)上層高大喬木，因材質(zhì)優(yōu)良，生長快，是一種值得發(fā)展的速生造林樹種，適宜在我國西南部中低海拔山地、丘陵，土壤較濕潤的地區(qū)造林［2］。由于常年亂砍濫伐及毀林開荒，樹種資源破壞極大，目前已臨近瀕危。近些年千果欖仁已開始逐漸試種應(yīng)用到園林景觀中，由于其滿樹繁花，特別惹人矚目，具有極高的觀賞應(yīng)用價(jià)值。

葉綠體是植物光合作用和代謝反應(yīng)所必需的亞細(xì)胞器，它包含特定的基因組，完整葉綠體基因組的共同特征是一個(gè)典型的四分體結(jié)構(gòu)，由一對(duì)反向重復(fù)序列（IR）和大小單拷貝區(qū)（分別為LSC和SSC區(qū)）所組成。其結(jié)構(gòu)簡單，遺傳相對(duì)保守，與核基因組和線粒體基因組相比，葉綠體基因組具有自我復(fù)制機(jī)制、相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化、小基因組、低突變率和獨(dú)特的母體遺傳等特點(diǎn)［3］。因此，葉綠體基因組也常為家族和屬的進(jìn)化分析、DNA條形碼、系統(tǒng)發(fā)育重建和分類的鑒定提供信息。密碼子作為核酸和蛋白質(zhì)之間的橋梁，在遺傳信息的傳遞過程中起著重要作用［4］，基因片段攜帶的遺傳信息在tRNA結(jié)合到多肽鏈的過程中以三重密碼子的形式進(jìn)行傳遞，每個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)至少一個(gè)密碼子［5］，而編碼相同氨基酸的密碼子被稱為同義密碼子［6］。蛋白質(zhì)合成過程中，同義密碼子利用的概率不同，在自然選擇或突變偏好的情況下，一個(gè)物種或基因傾向于使用一個(gè)或多個(gè)特定的同義密碼子，則具有同義密碼子使用偏好性（CUB）［7-9］。同義密碼子偏好性不僅受環(huán)境因素、堿基突變、長期進(jìn)化過程中的基因漂移的影響，還受基因組大小、tRNA豐度和基因表達(dá)水平的作用［10-11］。隨著Illumina Hiseq廣泛用于系統(tǒng)的深度測序研究，越來越多的葉綠體基因組數(shù)據(jù)發(fā)表在NCBI（美國國家生物技術(shù)信息中心Nation?al Center for Biotechnology Information），這為葉綠體基因組密碼子的研究提供了保障，可具體分析葉綠體基因組的序列特征和密碼子使用偏好并選擇最佳密碼子來靶向目的基因［12］。到目前為止，在蝴蝶蘭屬［13］、苜蓿屬［14］、馬尾松［15］、柿屬［16］、槲蕨屬［17］、降香黃檀［18］、竹亞科［19］和樟樹［20］等不同植物中均有關(guān)于葉綠體基因組及其密碼子使用偏好性的研究。

目前針對(duì)千果欖仁的研究大多集中在其群落生態(tài)［21-22］和繁殖技術(shù)［23-24］，而葉綠體全基因組及其密碼子使用偏好性方面的研究目前還未見系統(tǒng)研究報(bào)道，本文通過第二代高通量測序技術(shù)測序、組裝并注釋了千果欖仁的葉綠體全基因組，系統(tǒng)分析了葉綠體基因的密碼子偏性特征，找到其最優(yōu)密碼子，揭示其密碼子偏性特點(diǎn)，為千果欖仁后續(xù)的基因組學(xué)研究提供強(qiáng)有力的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 DNA提取及葉綠體基因組測序組裝

本研究測序所使用的新鮮植物葉片采集于云南省鎮(zhèn)沅縣哀牢山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)（北緯23°56′8.00″ 東經(jīng)101°25′38.58″，海拔1792 m），采用 CTAB法提取其全基因組DNA，并檢測DNA的完整性、純度和含量，選取質(zhì)量合格的DNA樣品送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行葉綠體基因組測序。從NCBI中下載已知的近緣物種欖仁樹Terminalia catappa（NC_053323）葉綠體基因組序列作為參考，通過GetOrganelle軟件［25］進(jìn)行葉綠體基因組裝。利用Geneious Prime軟件對(duì)組裝好的序列進(jìn)行注釋，在完成注釋后進(jìn)行人工校正，注釋后的千果欖仁葉綠體全基因組序列上傳至Gen?bank公共數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為NC_061409.1。通過在線工具OGDRAW（Organellar Genome DRAW，http：//ogdraw.mpimp-golm.mpg.De）繪制千果欖仁葉綠體基因組結(jié)構(gòu)圖［26］。

1.2 SSR位點(diǎn)分析

使用MISA軟件［27］尋找千果欖仁葉綠體全基因組的SSR位點(diǎn)，參數(shù)設(shè)置如下：單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸單元的重復(fù)次數(shù)分別為大于等于10、6、5、5和5，2個(gè)SSR之間的最小距離設(shè)置為100 bp。

1.3 同義密碼子使用偏性分析

1.3.1 密碼子相關(guān)參數(shù)計(jì)算

通過Codon W1.4.2和在線工具CUSP分析篩選得到蛋白質(zhì)編碼基因，獲得各條蛋白質(zhì)編碼基因的ENC值、RSCU值、總GC含量（GCall）以及各個(gè)基因中不同密碼子的第一位、第二位和第三位堿基的GC含量（分別使用GC1、GC2以及GC3來表示）等相關(guān)參數(shù)，并使用分析軟件SPSS對(duì)所得到的各組數(shù)據(jù)進(jìn)行一系列的相關(guān)性分析。

1.3.2 中性繪圖結(jié)果分析

中性繪圖可以作為初步判斷密碼子偏好性影響因素的工具之一，對(duì)于分析密碼子使用的偏好性具有一定的參考價(jià)值［28］。首先計(jì)算出各組基因的GC12值（GC12=（GC1+GC2）/2），再以GC12為縱坐標(biāo)，GC3為橫坐標(biāo)做出散點(diǎn)圖，通過觀察圖表中的信息，分析GC1和GC3含量的關(guān)系，從而推斷出影響其密碼子偏性的因素。

1.3.3 ENC?plot分析

根據(jù)各組基因密碼子的GC含量和ENC值，運(yùn)用R語言繪制ENC-plot散點(diǎn)圖，計(jì)算出預(yù)期ENC值（預(yù)期ENC計(jì)算公式：ENCexp=GC3+2+29/［GC32+（1-GC3）2］），通過比較預(yù)期ENC值與實(shí)際ENC值，分析得出突變壓力對(duì)密碼子使用偏性的作用大小［29］。僅分析ENC-plot繪圖無法定量比較實(shí)際ENC值與標(biāo)準(zhǔn)ENC值的差異，因此通過計(jì)算得到ENC比值（即（標(biāo)準(zhǔn)ENC-實(shí)際ENC）／標(biāo)準(zhǔn)ENC），并統(tǒng)計(jì)各個(gè)組段ENC比值的頻數(shù)和頻率，更加準(zhǔn)確直觀地對(duì)其ENC差異進(jìn)行分析。

1.3.4 PR2?plot繪圖

PR2分析，又稱奇偶偏好分析、偏倚分析，可用來探究密碼子第3位上堿基的組成偏差是否會(huì)對(duì)密碼子使用偏性產(chǎn)生影響［30］。以A3/（T3+A3）的計(jì)算結(jié)果作為縱坐標(biāo)，G3/（C3+G3）的計(jì)算值作為橫坐標(biāo)，繪制PR2-plot散點(diǎn)圖，圖中的點(diǎn)可用來表示其密碼子偏性方向和程度，若點(diǎn)落在中心位置，則可以表示其密碼子偏性不受自然選擇壓力的影響。

1.3.5 確定最優(yōu)密碼子

把上文選擇的53條基因的ENC值作為偏性標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行排序，取前后各5個(gè)基因構(gòu)建高低偏性表達(dá)庫，計(jì)算得出各組密碼子的RSCU和ΔRSCU，將同時(shí)滿足RSCU>1且ΔRSCU≥0.08（同時(shí)表現(xiàn)為高頻和高表達(dá)）的密碼子作為最優(yōu)密碼子［31］。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

為明確千果欖仁在訶子屬的系統(tǒng)發(fā)育位置，從NCBI中下載使君子科已公開的13個(gè)物種及外類群薔薇科2個(gè)物種的葉綠體基因組。采用MAFFT v7.429軟件進(jìn)行序列比對(duì)，通過MEGA v.11軟件探索最佳的建樹模型，DNA模型預(yù)測結(jié)果表示選擇“GTR+G”為最佳擬合模型，使用該模型構(gòu)建最大似然（ML）樹，所有分支節(jié)點(diǎn)均在1000次Bootstrap檢驗(yàn)各分支的置信度，對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 千果欖仁葉綠體基因組的基本特征

千果欖仁葉綠體基因組全長159 467 bp，為典型的雙鏈環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)（圖1），其中大單拷貝區(qū)（LSC）為88 015 bp，小單拷貝區(qū)（SSC）為 18 814 bp，反向重復(fù)區(qū)（IR）為26 319 bp。葉綠體基因組全序列GC總含量為37%，IR區(qū)GC含量（43.02%）高于LSC區(qū)（34.80%）和SSC區(qū)（30.65%）。葉綠體基因組共注釋了129個(gè)基因，其中包括85個(gè)CDS基因，8個(gè)rRNA基因和36個(gè)tRNA基因（表1）。其中17個(gè)基因在IR區(qū)域復(fù)制且互為反向重復(fù)，包括6個(gè)蛋白編碼基因（rpl23、rpl2、rps12、ndhB、rps7、ycf2），7個(gè)tRNA基因（trnM?CAU、trnL?CAA、trnV?GAC、trnE?UUC、trnA?UGC、trnR?ACG、trnN?GUU）和4個(gè)rRNA基 因（rrn16、rrn23、rrn4.5、rrn5S）。葉綠體基因功能方面，與自我復(fù)制相關(guān)的基因有68個(gè)，與光合作用相關(guān)的基因49個(gè)，6個(gè)其它編碼蛋白質(zhì)的基因和2個(gè)功能未知的基因。千果欖仁葉綠體基因組檢測到101個(gè)SSR位點(diǎn)，其中，單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸的SSRs數(shù)分別為86、5、5、5和0。SSR位點(diǎn)的分類重復(fù)類型的頻率（考慮序列互補(bǔ)），單核苷酸重復(fù)基元A/T共計(jì)86個(gè)（85.15%），二核苷酸重復(fù)基元AT/AT共計(jì)5個(gè)（4.95%），三核苷酸重復(fù)基元AAT/ATT共計(jì)5個(gè)（4.95%），四核苷酸重復(fù)基元AAAC/GTTT、AAAG/CTTT、AATT/AATT和AGAT/ATCT分 別 為1個(gè)（0.99%）、1個(gè)（0.99%）、2個(gè)（1.98%）、1個(gè)（0.99%）。顯然，SSR位點(diǎn)中A/T基元占優(yōu)勢(shì)，與該物種葉綠體全基因組富含AT（85.15%）堿基是一致的，說明千果欖仁葉綠體全基因組序列容易解鏈。

表1 千果欖仁葉綠體基因組基因信息Table 1 Genes information of T. myriocarpachloroplast genome

圖1 千果欖仁葉綠體基因組圖譜Fig.1 Gene map of the T. myriocarpa chloroplast genome

2.2 密碼子堿基組成及偏好性分析

從千果欖仁葉綠體基因組中篩選到適用于密碼子使用偏好性分析的CDS基因共53條，分析其葉綠體基因組密碼子3個(gè)位置的GC含量及ENC值（表2），53個(gè)CDS基因GC1、GC2、GC3和GCall的平均GC含量分別為47%（33.44%~57.87%）、39.44%（28.1%~57.55%）、28.61%（22.19%~37.38%）和38.35%（29.96%~45.32%）。表明GC含量在密碼子的3個(gè)位置之間的分布不均，GC3含量遠(yuǎn)低于GC1和GC2含量，千果欖仁葉綠體基因更加偏向于使用A與U作為末尾堿基。ENC值最低為37.9，最高為60.29，平均值為47.42，由此可以判斷，千果欖仁葉綠體基因組的密碼子偏性較弱。

表2 千果欖仁葉綠體基因組密碼子3個(gè)位置的GC含量及ENC值Table 2 GC content and ENC value of three codons in the chloroplast genome of T. myriocapra

運(yùn)用SPSS軟件對(duì)千果欖仁葉綠體全基因組的GC1、GC2、GC3、GCall、ENC和密碼子數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析（表3），相關(guān)性達(dá)到極顯著水平的參數(shù)有5組，分 別 為GC1與GC2、GC1與GCall、GC2與GCall、GC3與GCall、GC3與ENC，而GC3分別與GC1、GC2含量的相關(guān)性均不顯著，說明密碼子第1、2位堿基的成分近似，但與第3位上的堿基具有較大差異。ENC除與GC2、GCall含量的相關(guān)性不顯著外，其它均具有顯著相關(guān)性，說明密碼子第1、3位堿基構(gòu)成會(huì)對(duì)密碼子的使用偏好性有影響。N值只與GC2顯著相關(guān)，說明第2堿基組成的密碼子會(huì)影響有效密碼子數(shù)。N值與ENC的相關(guān)系數(shù)為0.202，未達(dá)到顯著水平，說明基因序列長度對(duì)密碼子偏好性的影響較小。

表3 GC1， GC2， GC3， GCall， ENC和密碼子數(shù)量的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of GC1， GC2， GC3， GCall，ENC and number of codons

千果欖仁各氨基酸密碼子的RSCU分析顯示（表4），RSCU值>1的密碼子中有13個(gè)密碼子以A作為結(jié)尾，有16個(gè)密碼子以U作為結(jié)尾，而把G作為末尾堿基的密碼子僅有1個(gè)，由此可知千果欖仁偏好于使用A、U作為密碼子的末尾堿基。

表4 各氨基酸密碼子的 RSCU 分析Table 4 RSCU analysis of individual amino acid codons

2.3 中性繪圖、ENC?plot及PR2?plot分析

由中性繪圖分析結(jié)果可得（圖2），葉綠體基因組密碼子中GC12分布在0.322~0.558，GC3分布在0.221~0.374，相關(guān)系數(shù)為0.229，而回歸系數(shù)為0.317 6，說明密碼子第1位和第2位堿基的組成情況與第3位堿基的組成情況存在著顯著的差異性，相關(guān)性較弱。推測密碼子偏好性受到選擇壓力的影響較大，GC含量相對(duì)比較保守。

圖2 中性繪圖分析Fig.2 Neutrality plot analysis

由ENC-plot繪圖分析結(jié)果可知（圖3），分布在標(biāo)準(zhǔn)ENC曲線下方的基因較多，其大多與預(yù)期ENC值差距較大，僅有少數(shù)基因位于曲線附近，說明其主要受到自然選擇因素的影響。進(jìn)一步計(jì)算ENC比值，并對(duì)其ENC比值在各個(gè)組段的頻數(shù)和頻率進(jìn)行分析（表5），位于?0.05~0.05區(qū)間的基因頻數(shù)為22，這個(gè)組段基因的ENC值與標(biāo)準(zhǔn)值比較接近，而其余區(qū)間有31個(gè)基因，這些基因的ENC值與標(biāo)準(zhǔn)值相差較大，說明千果欖仁密碼子的偏性模式受選擇壓力的影響相對(duì)較大。

圖3 ENC-plot 繪圖分析Fig.3 ENC-plot analysis

表5 ENC比值分布Table 5 Distribution of ENC ratio

根據(jù)PR2-plot分析可知（圖4），圖中的大部分基因分布于右下角象限內(nèi)，密碼子第三位T堿基的出現(xiàn)頻率于A堿基，G堿基的出現(xiàn)頻率于C堿基，說明嘧啶出現(xiàn)頻率高于嘌呤，密碼子第三位堿基的使用存在著一定的偏好性，其密碼子使用模式受突變壓力、選擇壓力以及其它多種因素的影響。

圖4 PR2-plot分析Fig.4 PR2-plot analysis

2.4 最優(yōu)密碼子的確定

按照53個(gè)CDS基因的ENC值對(duì)其進(jìn)行排序，用前5位高表達(dá)基因（ycf2、ycf3、ycf4、rpl2、atpE）和后5位低表達(dá)基因（psbA、petD、rps8、ccsA、rps14）構(gòu)建高低表達(dá)庫，運(yùn)用Codon W 1.4.2對(duì)其進(jìn)行分析，根據(jù)千果欖仁葉綠體基因最優(yōu)密碼子的確定結(jié)果，分別統(tǒng)計(jì)其RSCU值并計(jì)算出ΔRSCU（表6），將同時(shí)滿足高頻（RSCU>1）和高表達(dá)（ΔRSCU≥0.08）的密碼子作為最優(yōu)密碼子。最終篩選得到了CUU、UCC、ACA、UAG、AAU、GAU、AGA、GGA等8個(gè)最優(yōu)密碼子，其中有3個(gè)以A結(jié)尾，3個(gè)以U結(jié)尾，1個(gè)以C結(jié)尾，1個(gè)以G結(jié)尾。

表6 千果欖仁葉綠體基因最優(yōu)密碼子的確定Table 6 Preferred codons in chloroplast genome of T. myriocapra

續(xù)表

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用15個(gè)物種的葉綠體基因組序列構(gòu)建最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹，每個(gè)分支都具有較高的支持率（圖5）。外類群薔薇科的蘋果和繅絲花與內(nèi)類群使君子科的物種明顯分開。使君子科可聚為5支，第1和第2支都為訶子屬植物；第3支為風(fēng)車子屬（Com?bretum）的克勞斯風(fēng)車藤（Combretum kraussii）、Combretum indicum與 使 君 子 屬（Quisqualis）的Quisqualis littorea聚為一支；第4支為榆綠木屬（Anogeissus）的榆綠木（Anogeissus acuminata）和對(duì)葉欖李屬（Laguncularia）的拉關(guān)木（Laguncularia racemosa）聚為一支；第5支由欖李屬（Lumnitzera）的兩個(gè)物種聚為一支。由圖5還可見：千果欖仁與Terminalia phillyreifolia先聚為1支，再與小葉欖仁（Terminalia neotaliala）聚為1支，說明千果欖仁與Terminalia phillyreifolia親緣關(guān)系最近。

圖5 基于葉綠體基因組序列構(gòu)建的最大似然法樹Fig.5 Established maximum likelihood method tree based on chloroplast genome sequences

3 討論

葉綠體基因的結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，且為獨(dú)立的母系遺傳，其對(duì)植物進(jìn)化學(xué)和分類學(xué)的相關(guān)研究具有重要價(jià)值和意義［32］。千果欖仁的葉綠體基因組GC含量為37%，這與大多數(shù)雙子葉植物葉綠體31%~38%的GC含量相似。同樣的，其IR、LSC和SSC區(qū)的GC含量與其它植物一樣表現(xiàn)出了明顯的差別，分別為43.02%、34.80%和30.65%，且IR區(qū)明顯高于其它2區(qū)。有研究表明IR區(qū)變化可能是引起葉綠體基因組大小發(fā)生差異的主要因素，如：金花茶植物在進(jìn)化過程中葉綠體基因組IR區(qū)可能存在一定擴(kuò)張［33］；陜甘花楸（Sorbus koehneana）、爪瓣花楸（Sorbus unguiculata）等8種植物IRa/LSC邊界均出現(xiàn)明顯收縮［34］，這說明IR區(qū)的保守特性研究可幫助深入了解葉綠體基因組特征。而造成這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是由于rRNA基因在該區(qū)域的具有較高的GC值水平表達(dá)，而NADH基因可能是導(dǎo)致SSC區(qū)的低GC含量表達(dá)的關(guān)鍵。

密碼子偏好性在植物的葉綠體基因組中普遍存在，同義密碼子使用偏好（SCUB）是生物體分類群中不可避免的現(xiàn)象，通常導(dǎo)致不同物種或同一物種基因組中密碼子出現(xiàn)使用頻率的差異［35］。前人研究表明黃花文心蘭（Oncidium gower ramsey）［11］、萵苣（Lactuca sativa）［36］和銀白楊（Populus alba）［37］等由于進(jìn)化相對(duì)保守，同義密碼子的使用偏好于以A和U堿基結(jié)尾。而千果欖仁葉綠體基因組的53條CDS序列的密碼子偏好性相關(guān)分析表明密碼子偏向于以堿基A/T（U）結(jié)尾，這與前人研究相符。此外，千果欖仁葉綠體基因組密碼子不同位置GC含量的總體順序?yàn)镚C1>GC2>GC3，也與蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）［14］和 紫 苜 蓿（Medicago sati?va）［38］等表現(xiàn)出一致性。根據(jù)分子進(jìn)化的中性理論，密碼子第三堿基的同義突變不能改變氨基酸的類型，但它仍然被認(rèn)為是決定氨基酸類型的一個(gè)重要特征，堿基突變和自然選擇對(duì)密碼子第三堿基變化的影響是中性或接近中性的［39］，受到自然選擇壓力的影響相對(duì)要小一些，因此針對(duì)密碼子上第三位堿基的分析結(jié)果經(jīng)常作為衡量密碼子使用偏好性的重要指標(biāo)之一。如果密碼子的使用受到自然選擇的影響，GC3值往往分布在一個(gè)小范圍內(nèi)，GC12和GC3沒有顯著相關(guān)性［40］。在臺(tái)灣蝴蝶蘭（Phalae?nopsis aphroditesubsp.formosana）［13］和 黃 花 文 心蘭（Oncidium gower ramsey）［11］等的葉綠體基因組的研究表明自然選擇和堿基突變是影響CUB的主要因素；而金花茶［33］的同義密碼子使用偏好性則可能受到堿基組成的影響。在本研究中，ENC-plot繪圖分析、中性繪圖分析、PR2-plot繪圖分析、相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，千果欖仁葉綠體基因組的密碼子偏好性可能通過突變和自然選擇受到影響。這說明在植物葉綠體中，植物密碼子使用偏好受到多種因素的影響，不同植物物種中影響CUB的主要因素也可能不同［18］。

在自然選擇、突變偏差和其它因素的壓力下，SCUB不同程度地發(fā)生［36］，在強(qiáng)正選擇和突變壓力下，會(huì)形成大量的最優(yōu)密碼子。相反，在純化選擇下，最佳密碼子的數(shù)量相對(duì)較少［7］。對(duì)所挑選的CDS序列，根據(jù)ENC值的高低，選取前端和末尾各5個(gè)基因，分別構(gòu)建基因高表達(dá)庫和基因低表達(dá)庫，對(duì)其進(jìn)行分析，將同時(shí)表現(xiàn)出高頻（即RSCU值>1）且高表達(dá)（即ΔRSCU≥0.08）的密碼子視為其最優(yōu)密碼子。根據(jù)這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)共篩選出了8個(gè)最優(yōu)密碼子，其中6個(gè)以A和U作為結(jié)尾，說明千果欖仁葉綠體基因組最優(yōu)密碼子偏好于以A和U作為結(jié)尾。由此推測，千果欖仁葉綠體基因組可能正在進(jìn)行純化選擇，這也與香花枇杷（Eriobotrya fragrans）［41］、葡萄（Vitis vinifera）［42］、巨桉（Eucalyptus grandis）［43］等植物的研究結(jié)果一致，這可能是由于這些植物葉綠體基因組中富含A和T堿基，且密碼子在進(jìn)化關(guān)系偏于保守的原因。同時(shí)本研究在研究千果欖仁葉綠體基因組的基礎(chǔ)上第1次對(duì)使君子科已公布在NCBI平臺(tái)上的12個(gè)物種的葉綠體基因組序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，確定了千果欖仁的系統(tǒng)發(fā)育位置。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究通過對(duì)千果欖仁葉綠體基因組進(jìn)行測序、組裝和注釋，分析了千果欖仁葉綠體編碼蛋白基因的密碼子使用特點(diǎn)，千果欖仁葉綠體基因組為典型的雙鏈環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)。通過構(gòu)建基因的高表達(dá)優(yōu)越密碼子和高頻密碼子，篩選得到了CUU、UCC、ACA、UAG、AAU、GAU、AGA、GGA為最優(yōu)密碼子，其中有3個(gè)以A結(jié)尾，3個(gè)以U結(jié)尾，1個(gè)以C結(jié)尾，1個(gè)以G結(jié)尾，說明千果欖仁葉綠體蛋白編碼基因組偏愛以A、U結(jié)尾的密碼子。分析發(fā)現(xiàn)，千果欖仁密碼子的偏好性受到自然選擇壓力的影響較大。本研究發(fā)現(xiàn)千果欖仁葉綠體基因組和其密碼子使用模式以及最佳密碼子，這可能對(duì)后續(xù)的密碼子優(yōu)化、葉綠體基因組改造、探索物種進(jìn)化和增加外源基因表達(dá)具有重要意義。