章諾貝，黃神安，沈 浩，陳 新

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上與癌癥相關(guān)死亡的主要疾病之一。根據(jù)2018年《全球癌癥統(tǒng)計》，全球已診斷出約841 000例新的肝癌病例，并且全球已有782 000人死于肝癌[1]。目前，肝癌外科手術(shù)治療僅在這種疾病的初期有效。然而，大多數(shù)患者的肝癌在診斷明確時已發(fā)展到晚期，放療和化療療效有限。因此，有必要進(jìn)一步了解肝癌進(jìn)展的分子機制，并研發(fā)出針對肝癌更有效的靶向療法[2]。

近年來，越來越多的證據(jù)[3]表明LncRNAs作為癌癥患者診斷和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，為癌癥治療提供了新的治療靶點。有研究[4]表明LncRNA的異常表達(dá)在肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用，如MALAT1與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，并可預(yù)測肝移植術(shù)后的復(fù)發(fā)[5]。此外，LncRNA-LET可抑制肝癌的侵襲和腹腔轉(zhuǎn)移[6]。FGD5反義RNA 1(FGD5 antisense RNA 1，F(xiàn)GD5-AS1)是一位于染色體3p25.1的新近被確認(rèn)的LncRNA。最近，LncRNA FGD5-AS1初步被確定為肝癌的潛在治療靶標(biāo)[7]；然而，LncRNA FGD5-AS1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用仍不得而知。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本從在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院接受手術(shù)的60例肝癌患者中，獲得腫瘤組織和鄰近配對正常組織。收集所有組織樣本并在液氮中冷凍，然后在-80 ℃下保存以備后用。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)從中科院上海細(xì)胞庫購買了4種肝癌細(xì)胞系，分別為HepG2、HuH-7、Li-7、SNU-387，以及正常人肝細(xì)胞系L02。將細(xì)胞系放在補充有10%胎牛血清(Invitrogen，美國加利福尼亞州卡爾斯巴德公司)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen，美國加利福尼亞州卡爾斯巴德公司)中，并在37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染分別用由上海GenePharma公司合成的FGD5-AS1過表達(dá)載體、FGD5-AS1shRNA(sh-FGD5-AS1)、NC shRNA(sh-NC)和GTPBP4 shRNA(sh-GTPBP4)、NC mimic、miR-873-5p mimic對HepG2和HuH-7細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染。sh-FGD5-AS1:5′-GAA CTCAGCGTTGACTATTCT-3′；sh-GTPBP4: GGATGTGCACAGTGATCAAGA；si-NC: 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。根據(jù)制造商說明使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國加利福尼亞州卡爾斯巴德公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用RT-qPCR和綠色熒光顯微鏡評估轉(zhuǎn)染效率。

1.4 CCK-8和EdU分析通過CCK-8和EdU測定法檢測細(xì)胞增殖。根據(jù)制造商說明(上海Beyotime公司)，采用CCK-8分析，并在450 nm處測量吸光度(optical density,OD)值。同時按照制造商說明，使用EdU Apollo DNA體外試劑盒(廣州RIBOBIO公司)，通過EdU分析確定細(xì)胞增殖，并在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞劃痕實驗肝癌細(xì)胞種植到12孔板中，培養(yǎng)達(dá)到70%左右的融合度。接下來，利用一個50 μl小管的管尖部分造成劃痕。通過1×PBS除去沒有附壁的細(xì)胞。再次將細(xì)胞放入含有10% FBS的DMEM中分別培養(yǎng)0、48、72 h。每孔隨機選擇3個觀察范圍。

1.6 Transwell 實驗上室涂有基質(zhì)膠，用于侵襲分析或未涂覆基質(zhì)膠進(jìn)行遷移分析。上室每孔有1 000個/孔濃度的細(xì)胞以及無血清培養(yǎng)基，底部腔室為含有10%FBS的DMEM。48 h后，通過使用4%甲醇固定細(xì)胞，然后用0.1%結(jié)晶紫(美國Sigma-Aldrich公司)染色。在5個不同的視野(放大100倍)中，分別對遷移和侵襲的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.7 雙熒光素酶報告實驗使用GTPBP4野生型(wt)或突變型(mut)啟動子報告子與FGD5-AS1或miR-873-5p進(jìn)行重組后轉(zhuǎn)染HepG2和HuH-7細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)(美國威斯康星州Promega公司)檢測熒光素酶活性。

1.8 RNA下拉實驗將PierceTM磁性RNA-蛋白質(zhì)下拉試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)用于RNA下拉實驗。首先將RNA結(jié)合到磁珠上，以接收用于蛋白質(zhì)結(jié)合的RNA。此后，在添加蛋白質(zhì)裂解物之前，RNA結(jié)合珠在蛋白質(zhì)-RNA結(jié)合緩沖液中被平衡。通過添加適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌珠子，在磁力架上渦旋后分離。最后，通過RT-qPCR分析測定沉淀物中RNA的特異性。

1.9 RT-qPCR使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)從組織樣品和細(xì)胞中提取總RNA。根據(jù)制造商協(xié)議，使用PrimeScriptTMRT試劑盒(日本Takara公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。通過FastStart Universal SYBR Green Master(德國Roche公司)對PCR定量擴(kuò)增產(chǎn)物，并標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH和U6。引物：FGD5-AS1，(F)5′-GTCACTGTTCGGTG GTCTGC-3′，(R)5′-CAGTCAGGTGTTGTCGTGGAG-3′；miR-873-5p，(F)5′-GCAGGAACTTGTGAGTCTCC-3′，(R)5′-CTTGAACACTCAGAGGAAGG-3′； GTPBP4，(F)5′-GTTGCTAAAGATTATGTGCGACTG-3′，(R)5′-CAAACGGGATAAATGCTGACG-3′；GAPDH,(F)5′-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3′，(R)5′-TGTA TCCAAACTCATTGTCATAC-3′。

1.10 Western blot檢測使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液(美國Sigma-Aldrich公司)提取總蛋白。根據(jù)制造商說明，使用BCA蛋白分析試劑盒(上海)測定蛋白質(zhì)濃度。通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜(美國Millipore公司)，然后與一抗在4 ℃孵育過夜，其后與HRP偶聯(lián)的二抗(1 ∶5 000稀釋)孵育。用ECL Western blot檢測試劑(美國Millipore公司)對蛋白質(zhì)進(jìn)行可視化。免疫反應(yīng)帶使用Image J(美國NIH公司)進(jìn)行定量。

2 結(jié)果

2.1 FGD5-AS1在肝癌組織和細(xì)胞中表達(dá)情況首先通過RT-qPCR檢測FGD5-AS1在腫瘤組織和相應(yīng)癌旁非癌組織中的表達(dá)。與癌旁正常肝組織相比，HCC組織中FGD5-AS1的RNA表達(dá)水平增加(圖1A)；與正常肝細(xì)胞L02相比，4種HCC細(xì)胞系(HepG2、HuH-7、Li-7和SNU-387)中FGD5-AS1的RNA表達(dá)水平也均有升高(圖1B)。RT-qPCR分析FGD5-AS1在HepG2和HuH-7細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明FGD5-AS1主要位于細(xì)胞質(zhì)中(圖1C)。

圖1 FGD5-AS1在HCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 下調(diào)FGD5-AS1對HCC細(xì)胞增殖及凋亡的影響用sh-FGD5-AS1轉(zhuǎn)染后，F(xiàn)GD5-AS1在HepG2細(xì)胞系中的表達(dá)水平降低了70%，在HuH-7細(xì)胞系中的表達(dá)水平降低了65%(圖2A、B)。CCK-8和EdU檢測表明，下調(diào)FGD5-AS1可抑制HepG2和HuH-7細(xì)胞系的增殖能力(圖2C、D)。Western blot實驗表明，下調(diào)FGD5-AS1可使增殖相關(guān)標(biāo)志物PCNA和CyclinD1表達(dá)蛋白水平降低(圖2E)。流式細(xì)胞儀檢測FGD5-AS1對細(xì)胞凋亡，F(xiàn)GD5-AS1的下調(diào)使膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)陽性細(xì)胞的百分比在HepG2細(xì)胞中從8%增至24%，在HuH-7細(xì)胞中從7%增至20%(圖2F)。為了進(jìn)一步證實FGD5-AS1對肝癌細(xì)胞凋亡的影響，采用Western blot檢測了4種凋亡標(biāo)志物(Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9)的蛋白水平。如圖2G所示，在HepG2和HuH-7細(xì)胞系中，F(xiàn)GD5-AS1的表達(dá)沉默降低了Bcl-2的表達(dá)水平，而同時增加了Bax、cleaved caspase-3(abcam、ab2302)和cleaved caspase-9 (abcam、ab2324)的表達(dá)水平。

2.3 FGD5-AS1下調(diào)對HCC細(xì)胞的遷移和侵襲的影響細(xì)胞劃痕和Transwell實驗表明下調(diào)FGD5-AS1可以抑制HCC細(xì)胞遷移和侵襲(圖3A～C)。 在分子水平上檢測遷移/侵襲相關(guān)的蛋白Cox-2、MMP2和MMP9的表達(dá)水平變化，結(jié)果表明sh-FGD5-AS1組Cox-2、MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)水平低于sh-NC組(圖3D)。以上實驗結(jié)果顯示，下調(diào)FGD5-AS1可抑制HCC細(xì)胞的遷移和侵襲。

2.4 FGD5-AS1在HCC細(xì)胞中靶向miR-873-5p情況通過搜索在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫來預(yù)測miR-873-5p是FGD5-AS1的潛在下游靶標(biāo)(圖4A)。使用miR-873-5p mimic實現(xiàn)miR-873-5p過表達(dá)，并且通過RT-qPCR分析驗證了轉(zhuǎn)染效率(圖4B)?；蚍治霰砻?，將miR-873-5p mimic轉(zhuǎn)染到HCC細(xì)胞中可抑制帶有miR-873-5p結(jié)合位點的FGD5-AS1序列的螢光素酶報告基因的活性。在FGD5-AS1中的miR-873-5p的預(yù)測結(jié)合位點發(fā)生突變后，熒光素酶活性的變化被消除(圖4C)。此外，RNA下拉試驗進(jìn)一步證實FGD5-AS1確實與HCC細(xì)胞中的miR-873-5p結(jié)合(圖4D)。此外， RT-qPCR分析顯示，HepG2和HuH-7細(xì)胞中的FGD5-AS1沉默后，miR-873-5p的表達(dá)水平升高(圖4E)。與非腫瘤組織和正常人肝細(xì)胞系L02相比，在腫瘤組織和HCC細(xì)胞系中，miR-873-5p表達(dá)水平顯著降低(圖4F、4G)。Pearson的相關(guān)性分析表明，miR-873-5p與FGD5-AS1呈負(fù)相關(guān)(圖4H)。這些數(shù)據(jù)為FGD5-AS1可海綿化miR-873-5p提供了證據(jù)。

圖2 下調(diào)FGD5-AS1對HCC細(xì)胞增殖及凋亡的影響

圖3 下調(diào)FGD5-AS1對HCC細(xì)胞的遷移和侵襲的影響

圖4 FGD5-AS1在HCC細(xì)胞中靶向miR-873-5p情況

2.5 FGD5-AS1通過與miR-873-5p競爭性結(jié)合對GTPBP4的影響使用Starbase v2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)分析表明GTPBP4是miR-873-5p的下游靶基因，存在潛在的結(jié)合序列(圖5A)。雙熒光素酶報告實驗表明，miR-873-5p可抑制野生型GTPBP4-WT的熒光素酶活性(圖5B)。RNA下拉實驗同樣表明，GTPBP4僅被Bio-miR-873-5p-wt下拉，進(jìn)一步驗證了GTPBP4與miR-873-5p的相互作用(圖5C)。通過RT-qPCR和Western blot分析表明：miR-873-5p過表達(dá)可導(dǎo)致GTPBP4 mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯下降，證實了GTPBP4是miR-873-5p的靶標(biāo)(圖5D、E)；miR-873-5p對GTPBP4熒光素酶活性的抑制作用可被GTPBP4的過表達(dá)所部分抵消(圖5F)；FGD5-AS1的表達(dá)下調(diào)可降低GTPBP4的mRNA和蛋白表達(dá)水平(圖5G、H)。

2.6 FGD5-AS1/miR-873-5p/GTPBP4軸在HCC中的作用為了進(jìn)一步研究FGD5-AS1/miR-873-5p/GTPBP4軸對HCC的影響，課題組首先通過RT-qPCR證實了HepG2細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率(圖6A)。CCK-8和EdU實驗顯示miR-873-5p抑制劑可使FGD5-AS1沉默引起的HepG2細(xì)胞增殖減少的效應(yīng)增強，而此效應(yīng)又可由GTPBP4的敲低所阻遏(圖6B、C)。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡顯示miR-873-5p抑制劑可消除FGD5-AS1下調(diào)對細(xì)胞凋亡的影響，且當(dāng)GTPBP4沉默后，細(xì)胞凋亡得以恢復(fù)(圖6D)。細(xì)胞劃痕和Transwell實驗分析表明，miR-873-5p抑制劑可增強FGD5-AS1下調(diào)對細(xì)胞的遷移和侵襲的抑制效應(yīng)，而此效應(yīng)又可通過抑制GTPBP4表達(dá)來恢復(fù)(圖6E、F、G)。上述結(jié)果表明FGD5-AS1可通過miR-873-5p/GTPBP4軸影響HCC細(xì)胞的生物學(xué)行為。

3 討論

本研究表明lncRNA FGD5-AS1在HCC組織和細(xì)胞中高表達(dá)，lncRNA FGD5-AS1競爭性地抑制miR-873-5p的表達(dá)，從而增強了HCC細(xì)胞中GTPBP4的表達(dá)水平。以上研究結(jié)果提示，lncRNA FGD5-AS1在促進(jìn)HCC進(jìn)程中發(fā)揮了推進(jìn)作用，其可能作為HCC的一種新的治療靶標(biāo)。

lncRNA FGD5-AS1已被確定為包括肝癌在內(nèi)的多種癌癥的潛在致癌基因[8-12]。本研究顯示，lncRNA FGD5-AS1在HCC組織中的表達(dá)明顯高于相應(yīng)的非腫瘤組織，lncRNA FGD5-AS1的表達(dá)下調(diào)可抑制HCC細(xì)胞的惡性表型，包括增殖、遷移和侵襲，結(jié)果表明lncRNA FGD5-AS1在HCC的發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的促進(jìn)作用。

圖5 FGD5-AS1與miR-873-5p競爭性結(jié)合對GTPBP4的影響

圖6 FGD5-AS1/miR-873-5p/GTPBP4軸在HCC中的作用

該研究表明lncRNA FGD5-AS1主要在HCC細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，生物信息學(xué)分析顯示miR-873-5p具有與lncRNA FGD5-AS1互補的序列。根據(jù)先前的研究報道,miR-873-5p在多種癌癥中均具有抑癌作用[13]。因此，可推測lncRNA FGD5-AS1可通過與miR-873-5p相互作用從而發(fā)揮其致癌作用。本研究結(jié)果表明，lncRNA FGD5-AS1可負(fù)性調(diào)控miR-873-5p。此外，生物信息學(xué)分析表明，GTPBP4可能是miR-873-5p的下游靶標(biāo)。在最近的研究中，GTPBP4已被報道可促進(jìn)包括HCC在內(nèi)的多種癌癥的進(jìn)展[14-15]。然而，在HCC中miR-873-5p和GTPBP4的關(guān)系尚不清楚。在本研究中，通過熒光素酶報告實驗和RNA下拉實驗，證實了GTPBP4是miR-873-5p的直接靶標(biāo)。此外，拯救分析結(jié)果表明，lncRNA FGD5-AS1可通過miR-873-5p/GTPBP4軸促進(jìn)HCC的發(fā)展，但是，需要更多的體內(nèi)實驗來進(jìn)一步證實研究結(jié)果。

該研究為lncRNA FGD5-AS1在HCC進(jìn)展中發(fā)揮重要作用提供了理論依據(jù)。此外，lncRNA FGD5-AS1/miR-873-5p/GTPBP4軸為肝癌的分子基礎(chǔ)研究預(yù)示了新視角，并為開發(fā)新的HCC診斷和治療策略提供了新的前景。