趙 夢，李 歡，吉冰玉，徐 婷，高芹芹

許多成人疾病的發(fā)生，其病因往往可以追溯至兒童、嬰幼兒甚至胎兒期。近期大量研究[1-2]表明：孕期多種不良因素(母體、遺傳或環(huán)境)均不同程度影響宮內(nèi)胎兒發(fā)育，這為成年后患心血管等疾病埋下“病根”。在胎兒發(fā)育晚期，肺循環(huán)經(jīng)歷了一系列的結(jié)構(gòu)和功能變化，胎盤的氣體交換轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔚臍怏w交換，因此肺循環(huán)特別容易受到缺氧的影響。孕期宮內(nèi)缺氧是胎兒發(fā)育過程中最為常見的不良因素[3-4]。已有大量研究[5-9]表明，孕期缺氧可影響子代冠狀動(dòng)脈、腦動(dòng)脈、腎動(dòng)脈等血管的功能。而孕期缺氧對(duì)子代肺動(dòng)脈的影響及其機(jī)制知之甚少。該研究主要圍繞孕期缺氧對(duì)成年雄性子代大鼠肺動(dòng)脈血管功能的影響及機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Sprague-Dawley(SD)大鼠清潔級(jí)，雌性大鼠體質(zhì)量240～260 g，雄性大鼠體質(zhì)量280～300 g，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：XCYK 2002-2008，使用許可證號(hào)：SYXK 2002-0037。

1.2 主要試劑硝普鈉(sodium nitroprusside, SNP)、乙酰膽堿(acetyl choline, ACH)、苯腎上腺素(phenylephrine, PE)、2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯(2-aminoethyl diphenylborinate, 2APB)、硝苯地平(nifedipine, NIFE)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)購于美國Sigma公司。

1.3 主要儀器Chart 7 Powerlab購自澳大利亞AD Instruments公司；Myograph System購自美國Radnoti LLC公司；熒光PCR儀、NanoDrop購自上海賽默飛世爾科技有限公司；ML-IICB數(shù)字智能測氧儀購自北京航天鵬誠儀器儀表有限公司。

1.4 常用緩沖液HEPES緩沖液：氯化鈉16.58 g、氯化鉀0.7 g、HEPES 4.76 g、EDTA 0.38 g、葡萄糖1.98 g、磷酸二氫鉀0.32 g、七水硫酸鎂0.84 g、二水氯化鈣0.82 g，單蒸水定容到2 000 ml，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.35～7.45。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1動(dòng)物模型制備 將SD雌性和雄性大鼠飼養(yǎng)在同一房間里，室內(nèi)溫度設(shè)為22℃，每天各12 h光照和黑暗，并提供標(biāo)準(zhǔn)飼料和水。取3月齡雄性和雌性大鼠1 ∶1進(jìn)行交配。交配一晚后檢查雌性大鼠是否有陰道栓。如果有陰道栓，說明雌性大鼠成功受孕，記為妊娠的第1天。將受孕成功的雌性大鼠隨機(jī)分為兩組。其中一組在正常條件下飼養(yǎng)(21% O2)，直至分娩，作為對(duì)照組；另一組在妊娠第10天置于缺氧箱中飼養(yǎng)(10.5% O2和89.5% N2)，至妊娠第21天，作為缺氧組。缺氧箱每天打開1次用于替換墊料、食物和水，用鈉石灰來吸收呼吸作用產(chǎn)生的水和二氧化碳。缺氧組和對(duì)照組孕鼠生下胎鼠，待子代斷奶后，繼續(xù)將雄性后代養(yǎng)至4月齡進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.5.2血管實(shí)驗(yàn) 用4%水合氯醛將雄性子代大鼠麻醉后固定于托盤上，快速取出肺臟，立即浸泡在HEPES緩沖液中；在顯微鏡下輕柔地分離出肺動(dòng)脈，將肺動(dòng)脈剪成3 mm左右的血管環(huán)，置于冰上備用；在血管浴槽中加入5 ml 37℃ HEPES緩沖液，在顯微鏡下，用兩根鋼絲將肺動(dòng)脈血管環(huán)固定于血管浴槽中的螺絲上；將血管浴槽與Powerlab轉(zhuǎn)換器連接，向血管浴槽中持續(xù)通入適量的氧氣；在電腦上打開Chart 7軟件，將血管的張力調(diào)整至生理狀態(tài)，并讓血管環(huán)穩(wěn)定30 min。以60 mmol/L氯化鉀200 μl刺激血管，當(dāng)血管收縮強(qiáng)度達(dá)到最大時(shí)，用37℃ HEPES緩沖液沖洗3遍，待血管穩(wěn)定后再重復(fù)刺激2次。當(dāng)收縮反應(yīng)達(dá)到最大值后，記錄并計(jì)算血管的平均收縮強(qiáng)度。用37℃ HEPES緩沖液沖洗3遍，待血管張力穩(wěn)定至基線后，以50 μl 10-4mol/L的5-HT誘導(dǎo)血管收縮達(dá)到平臺(tái)后，立即加入累積濃度梯度的ACH(10-9～10-4mol/L)和SNP(10-9～10-4mol/L)；或用累積濃度梯度PE(10-9～10-4mol/L)刺激肺動(dòng)脈血管環(huán)；或孵育L-型鈣離子通道(L-type calcium channels，LTCCs)阻斷劑NIFE或三磷酸肌醇(Inositol-1，4，5-trisphosphate, IP3)受體阻滯劑2APB后，觀察離體肺動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)累積濃度梯度PE的收縮反應(yīng)。

1.5.3RT-PCR檢測肺組織中mRNA水平 使用TRIzol試劑提取肺動(dòng)脈RNA，并使用NanoDrop分光光度計(jì)定量。用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)得到cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，使用SYBR Green Supermix Taq試劑盒，RT-PCR檢測成年子代雄性大鼠肺動(dòng)脈腎上腺素能α1A受體(ADRA1A)、腎上腺素能α1D受體(ADRA1D)、腎上腺素能α2B受體(ADRA2B)、腎上腺素能α2C受體(ADRA2C)、腎上腺素能β1受體(ADRB1)、腎上腺素能β2受體(ADRB2)、腎上腺素能β3受體(ADRB3)、Cav1.2、T型鈣離子通道(Cav3.2)的mRNA水平。以GADPH為內(nèi)參，基因表達(dá)的相對(duì)定量采用2-△△Ct法計(jì)算得出。

1.5.4Western blot檢測 取30 mg肺動(dòng)脈血管組織研磨成粉末，將粉末轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中，加入RIPA裂解液，置于冰上，反復(fù)靜置斡旋數(shù)十次；待管內(nèi)無明顯沉淀，置95 ℃水浴鍋中加熱15 min。配制濃縮膠和分離膠，取上清液進(jìn)行SDS PAGE凝膠電泳。以β-actin作為內(nèi)參，檢測灰度值，對(duì)Cav1.2蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 ACH和SNP介導(dǎo)的肺動(dòng)脈舒張反應(yīng)缺氧組成年子代雄性大鼠的肺動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)ACH介導(dǎo)的舒張效應(yīng)與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.220 8)(圖1A)；缺氧組肺動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)SNP介導(dǎo)的舒張效應(yīng)與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.502 5)(圖1B)。

圖1 ACH和SNP介導(dǎo)兩組子代肺動(dòng)脈的舒張反應(yīng)A：累積濃度ACH誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)；B：累積濃度SNP介導(dǎo)的舒張反應(yīng)

2.2 PE介導(dǎo)的肺動(dòng)脈收縮反應(yīng)肺動(dòng)脈對(duì)苯腎上腺素均有劑量依賴性收縮反應(yīng)，缺氧組PE引起的肺動(dòng)脈收縮強(qiáng)度低于對(duì)照組(F=4.077,P<0.001)(圖2A)，對(duì)PE介導(dǎo)的最大收縮反應(yīng)低于對(duì)照組(P<0.001)(圖2B)；兩組肺動(dòng)脈最大收縮強(qiáng)度分別達(dá)到KCL引起的收縮強(qiáng)度的(14.28±2.572)%和(6.320±0.712)%(t=4.212)(表1)。

圖2 PE介導(dǎo)兩組子代肺動(dòng)脈的收縮反應(yīng)

表1 肺動(dòng)脈對(duì)不同累積濃度PE反應(yīng)的比較

2.3 PE介導(dǎo)的肺動(dòng)脈收縮反應(yīng)與LTCCs有關(guān)用NIFE阻斷LTCCs后，肺動(dòng)脈對(duì)PE引起的收縮反應(yīng)均減弱，且敷藥后兩組之間的收縮強(qiáng)度沒有差異(圖3A)；孵育NIFE后，缺氧組PE引起的肺動(dòng)脈最大收縮效應(yīng)與對(duì)照組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)；兩組肺動(dòng)脈最大收縮強(qiáng)度分別達(dá)到KCL引起的收縮強(qiáng)度的(2.77±0.608)%和(1.96±0.234)%(表2)。用2APB阻斷IP3受體后，PE引起的肺動(dòng)脈的收縮反應(yīng)均減弱，且敷藥后兩組比較，缺氧組仍低于對(duì)照組(F=2.342,P<0.05)(圖3C)；孵育2APB后，缺氧組PE引起的肺動(dòng)脈最大收縮效應(yīng)仍低于對(duì)照組(P<0.05)(圖3D)；兩組肺動(dòng)脈最大收縮強(qiáng)度分別達(dá)到KCL引起的收縮強(qiáng)度的(8.96±0.980)%和(3.23±0.362)%(表2)。

2.4 肺動(dòng)脈中PE受體、Cav1.2和Cav3.2的mRNA水平與對(duì)照組相比，缺氧組肺動(dòng)脈血管PE的A型受體[ADRA1A(t=0.873 8)、ADRA1D(t=0.402 7)、ADRA2B(t=1.165)和ADRA2C(t=0.609 4)]和B型受體[ADRB1(t=0.268 2)、ADRB2(t=0.4053)和ADRB3(t=0.656 9)]的mRNA水平?jīng)]有變化(圖4)；缺氧組肺動(dòng)脈血管Cav1.2的mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.001，t=4.859)，而Cav3.2的mRNA表達(dá)在兩組之間沒有差異(t=0.1624)(圖4)。

圖3 PE介導(dǎo)兩組子代肺動(dòng)脈血管收縮與LTCC和2APB的關(guān)系

圖4 肺動(dòng)脈血管PE和LTCCs相關(guān)受體mRNA的表達(dá)情況與對(duì)照組比較：***P<0.001

表2 肺動(dòng)脈對(duì)孵育NIFE或2APB后不同累積濃度PE反應(yīng)的比較

2.5 肺動(dòng)脈血管中Cav1.2的蛋白水平與對(duì)照組比較，缺氧組肺動(dòng)脈血管中Cav1.2的蛋白水平降低(P<0.01,t=5.313)(圖5)。

圖5 肺動(dòng)脈血管Cav1.2的蛋白表達(dá)情況與對(duì)照組比較：**P<0.01

3 討論

本研究表明孕期缺氧可導(dǎo)致成年雄性子代大鼠肺動(dòng)脈血管對(duì)苯腎上腺素引起的收縮反應(yīng)減弱，且此收縮反應(yīng)減弱主要與Cav1.2表達(dá)下調(diào)有關(guān)，而與胞內(nèi)鈣釋放通路和苯腎上腺素受體的表達(dá)無關(guān)。孕期缺氧并不影響成年雄性子代大鼠肺動(dòng)脈血管的舒張功能。

腎上腺素能受體廣泛分布于外周血管參與血管張力的調(diào)節(jié)。本研究顯示孕期缺氧成年子代肺動(dòng)脈對(duì)苯腎上腺素介導(dǎo)的收縮減弱與其受體無關(guān)，可能由平滑肌細(xì)胞內(nèi)的其他收縮機(jī)制引起的。血管平滑肌細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度，在血管收縮中起著關(guān)鍵作用[10]。在阻力血管中，胞內(nèi)Ca2+濃度升高主要有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放和外Ca2+內(nèi)流介導(dǎo)完成。IP3Rs是一種廣泛表達(dá)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ca2+釋放通道，本研究顯示通過抑制血管環(huán)IP3Rs后，缺氧子代肺血管環(huán)對(duì)苯腎上腺素的收縮反應(yīng)仍明顯減弱，這說明孕期缺氧導(dǎo)致子代肺血管收縮功能減弱與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP3Rs介導(dǎo)內(nèi)Ca2+釋放無關(guān)。細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)主要通過電壓門控Ca2+通道，其中LTCCs家族中Cav1.2通道對(duì)調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞Ca2+濃度至關(guān)重要[10]。本研究表明通過抑制血管環(huán)LTCCs后，缺氧子代肺血管環(huán)對(duì)苯腎上腺素的收縮反應(yīng)與對(duì)照組間無明顯差異，這說明孕期缺氧導(dǎo)致子代肺血管收縮功能減弱與細(xì)胞膜LTCCs介導(dǎo)外Ca2+內(nèi)流有關(guān)。

肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的破壞被認(rèn)為是肺動(dòng)脈高壓發(fā)病的一個(gè)重要觸發(fā)因素[11-12]。在以往的研究[12]中缺氧可導(dǎo)致子代肺動(dòng)脈血管LTCCs表達(dá)上調(diào)。本研究顯示孕期缺氧下調(diào)子代大鼠肺動(dòng)脈中Cav1.2的表達(dá)。肺循環(huán)作為一個(gè)高流量和低壓力的系統(tǒng)，旨在優(yōu)化氣體交換過程，因此這一差異可能是機(jī)體的保護(hù)效應(yīng)：Cav1.2下調(diào)極有可能是對(duì)缺氧誘導(dǎo)的高收縮的代償性保護(hù)，從而提高肺循環(huán)血流量。

本研究表明孕期缺氧降低成年雄性子代大鼠肺動(dòng)脈血管的收縮能力。這與以往提出的急性缺氧引起肺動(dòng)脈高壓、肺動(dòng)脈收縮增強(qiáng)截然不同[12]。此外，以往的研究[5-8]發(fā)現(xiàn)，孕期缺氧可導(dǎo)致成年子代腸系膜、腎動(dòng)脈及大腦中動(dòng)脈的收縮功能增加，而本研究顯示孕期缺氧導(dǎo)致子代肺血管收縮降低，這說明孕期缺氧對(duì)子代血管功能的影響因血管類型的不同而不同。本研究創(chuàng)新性的從離子通道水平揭示孕期缺氧導(dǎo)致子代肺血管功能障礙的機(jī)制；研究結(jié)果提示應(yīng)加強(qiáng)孕期發(fā)生缺氧胎兒出生后的隨訪，也為產(chǎn)前孕期缺氧子代心血管疾病的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)支持。