吳科帆，張愛寧，季燁龍，張 藝，江 夢，夏中元

心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)是治療心肌梗死的主要方法，同時也是加重心肌損傷的機(jī)制之一。雖然它可以提供心肌有氧代謝所必需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，但血流的重建和恢復(fù)可以對心肌產(chǎn)生更嚴(yán)重的打擊，稱為缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)[1]。研究[2]表明IRI可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)離子堆積、線粒體膜損傷、活性氧形成、一氧化氮代謝紊亂、內(nèi)皮功能障礙、血小板聚集、免疫激活、細(xì)胞凋亡和自噬等多種病理生理過程。大腦作為人體生命中樞器官，雖有血腦屏障的保護(hù)，仍易由于體內(nèi)血液再分布而遭受侵襲，導(dǎo)致IRI后的繼發(fā)性腦損傷[3]。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)是一種高選擇性的α2-腎上腺素能受體激動劑，對心臟、腎臟等器官的缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。已有研究[4-6]證實(shí)Dex可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等途徑減輕糖尿病大鼠腦損傷。該研究擬觀察右美托咪定預(yù)處理對心肌缺血再灌注所致腦損傷的影響，并探究其與全身炎癥反應(yīng)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器SD大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司。右美托咪定購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(批號：14030332)。CCAAT-增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT-enhancer-bindingproteinhomologousprotein，Chop)、免疫球蛋白結(jié)合蛋白(bindingimmunoglobulinprotein，Bip)一抗購自美國Abcam公司，磷酸化真核生物起始因子2(phosphorylated-αsubunit of eukaryotic initiation factor 2，p-eif-2α)、磷酸化蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(phosphorylated proteinkinase RNA-likeendoplasmicreticulumkinase，p-perk)一抗購自美國CST公司，熒光二抗購自美國LI-COR公司。DW-2000型小動物呼吸機(jī)購自上海嘉鵬科技有限公司，BX50型光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司，ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所，Odyssey雙色紅外激光掃描顯影儀購自美國LI-COR公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理SPF級健康雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量200～220 g，6～8周齡，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組8只：假手術(shù)組(S組)、心肌缺血再灌注組(IR組)、心肌缺血再灌注+右美托咪定組(IR+Dex組)。于標(biāo)準(zhǔn)SPF級環(huán)境進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，術(shù)前禁食12 h。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉并固定，同時進(jìn)行心電監(jiān)測。S組只穿線，不結(jié)扎LAD。IR+DEX組于再灌注開始時給予IR+Dex組靜脈注射右美托咪定25 μg/kg，S組和IR組靜脈注射等容量0.9%氯化鈉溶液。將大鼠氣管切開行氣管插管術(shù)，連接小動物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣。開胸暴露大鼠心臟，用7-0帶線縫針結(jié)扎冠狀動脈左前降支(LAD)30 min，肉眼觀察心尖部變白，室壁運(yùn)動減弱，同時心電監(jiān)測出現(xiàn)明顯ST段背向上抬高，認(rèn)為心肌缺血再灌注模型造模成功。松開線結(jié)可見心電圖ST段回落，心尖部恢復(fù)紅潤，表明再灌注成功，再灌注120 min后即刻經(jīng)頸動脈采集血樣，斷頭處死大鼠取腦組織。

1.3 觀察指標(biāo)以及檢測方法

1.3.1HE染色觀察大鼠腦組織病理結(jié)果 再灌注120 min后取腦組織，石蠟包埋后于切片機(jī)切片，置于4%多聚甲醛液固定24 h，HE染色后于光鏡下觀察病理結(jié)果。

1.3.2ELISA法檢測血清炎性因子IL-6、IL-8、IL-10 再灌注120 min后即刻經(jīng)頸動脈采集血樣，于4 ℃下2 000 r/min離心15 min，離心半徑8.6 cm，取上清液，使用ELISA試劑盒測定血清IL-6、IL-8和IL-10水平，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.3.3Western blot法測定大鼠海馬組織中Chop、Bip、p-eif-2α和p-perk的表達(dá)水平 取大鼠海馬組織，置于冰上加入RIPA裂解液裂解30 min，冰浴電動勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心20 min，離心半徑8.6 cm，取上清液于-20 ℃凍存。采用BCA法測定蛋白濃度。加入5×上樣緩沖液并混勻煮沸10 min，行PAGE凝膠電泳，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入Chop一抗(稀釋度1 ∶1 000)、Bip一抗(稀釋度1 ∶1 000)、p-eif-2α一抗(稀釋度1 ∶1 000)和p-perk一抗(稀釋度1 ∶1 000)，4 ℃下?lián)u床孵育過夜。TBST洗滌3次， 10 min/次，加入熒光二抗(稀釋度1 ∶10 000)室溫孵育1 h。TBST洗滌3次，10 min/次。紅外成像顯影儀掃描分析熒光蛋白條帶，測定各目的蛋白條帶灰度值。用GAPDH作為內(nèi)參，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 心肌缺血再灌注后腦組織病理切片觀察光鏡下，S組可見神經(jīng)元清晰排列，胞質(zhì)豐富，核圓形，堿染呈藍(lán)色，結(jié)構(gòu)較為清晰，未見明顯異常。IR組神經(jīng)元病理損傷較重，形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)分布不均，有空泡，核固縮、溶解或消失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，核染色不均勻，呈淡紅色。IR+Dex組中，神經(jīng)元損傷減輕，大多數(shù)胞膜完整，核仁清晰可見。見圖1。

圖1 三組大鼠海馬組織病理學(xué)結(jié)果 HE ×40

2.2 ELISA檢測心肌缺血再灌注后血清炎性因子與S組比較，IR組和IR+Dex組血清炎性因子IL-6、IL-8表達(dá)均增加(P<0.05)，IL-10的表達(dá)減少(P<0.05)。與IR組比較，IR+Dex組IL-6、IL-8表達(dá)有所下調(diào)(P<0.05)，而IL-10的表達(dá)增加(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠血清炎性因子IL-6、IL-8和IL-10水平的比較

2.3 心肌缺血再灌注后大鼠海馬組織中Chop、Bip、p-eif-2α和p-perk的表達(dá)與S組比較，IR組和IR+Dex組大鼠海馬組織中Chop、Bip、p-eif-2α和p-perk蛋白表達(dá)水平均上調(diào)(P<0.05)。與IR組比較，進(jìn)行了右美托咪定預(yù)處理后的心肌缺血再灌注后的大鼠海馬組織中Chop、Bip、p-eif-2α和p-perk的表達(dá)有所下調(diào)(P<0.05)。見表2、圖2。

3 討論

該研究參照文獻(xiàn)[7]制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，即于氣管插管后結(jié)扎LAD 30 min，解除結(jié)扎后再灌注120 min。結(jié)果顯示，與S組比較，IR組大鼠腦組織中神經(jīng)元出現(xiàn)病理損傷，細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，提示心肌缺血再灌注誘發(fā)了大鼠腦損傷。該研究參照文獻(xiàn)[8]于再灌注開始時給予IR+Dex組25 μg/kg右美托咪定,S組和IR組注射等容量0.9%氧化鈉溶液。結(jié)果顯示，與IR組比較，IR+Dex組腦組織病理學(xué)損傷減輕，細(xì)胞鏡下無明顯損傷，提示右美托咪定預(yù)處理減輕了心肌缺血再灌注所致的大鼠腦損傷。

圖2 3組大鼠海馬組織Chop、Bip、p-eif-2α和p-perk的Western blot表達(dá)條帶

表2 3組大鼠海馬組織中Chop、Bip、p-eif-2α和p-perk/GADPH表達(dá)的比較

再灌注引發(fā)的炎癥反應(yīng)是心肌再灌注缺血損傷的重要環(huán)節(jié)。在炎癥應(yīng)答機(jī)制中，許多細(xì)胞因子如IL-6、IL-8等被釋放[9]，而抗炎因子IL-10被大量消耗[10]。ELISA結(jié)果顯示，與S組比較，IR組和IR+Dex組IL-6、IL-8表達(dá)增加，IL-10表達(dá)減少；與IR組比較，IR+Dex組IL-6、IL-8表達(dá)下調(diào)，而IL-10表達(dá)增加。提示心肌缺血再灌注引發(fā)的炎癥反應(yīng)使血液中炎性介質(zhì)通過機(jī)體內(nèi)的血液再分布進(jìn)入腦組織并導(dǎo)致相應(yīng)損傷，而右美托咪定預(yù)處理可通過抑制全身炎癥反應(yīng)減輕腦組織損傷。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致細(xì)胞生理功能發(fā)生改變的一種病理反應(yīng)，是由于各種病理和生理事件導(dǎo)致未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)的積累加速的狀態(tài)[11]。蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶PERK是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種I型跨膜蛋白，屬于真核生物起始因子2上游激酶家族中的一種。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期，通過Bip免疫球蛋白結(jié)合蛋白Bip在上游激活PERK信號通路抑制蛋白質(zhì)的合成，對細(xì)胞起保護(hù)作用、促進(jìn)細(xì)胞生存。隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時間的延長，PERK通過誘導(dǎo)Chop的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。PERK信號途徑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、缺血再灌注損傷及代謝異常等病理過程中發(fā)揮著重要的作用[12-13]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作為介導(dǎo)腦缺血眾多反應(yīng)的復(fù)雜機(jī)制，與缺血后神經(jīng)元細(xì)胞死亡有關(guān)[14]。心肌發(fā)生缺血再灌注時，心肌的缺血低氧繼發(fā)了腦組織的缺血低氧，神經(jīng)元出現(xiàn)能量代謝障礙誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，再灌注后腦組織血流恢復(fù)，血液中產(chǎn)生的各種離子、介質(zhì)加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[15]。Western blot結(jié)果顯示，與S組比較，IR組和IR+Dex組大鼠海馬組織中Chop、Bip、p-eif-2α和p-perk蛋白表達(dá)上調(diào)；與IR組比較，IR+Dex組海馬組織中Chop、Bip、p-eif-2α和p-perk的表達(dá)下調(diào)，提示右美托咪定預(yù)處理可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕大鼠心肌缺血再灌注所致腦損傷。

綜上所述，右美托咪定預(yù)處理可減輕心肌缺血再灌注所致的腦損傷，其機(jī)制可能與減輕全身炎癥反應(yīng)、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。