郭 忠 馬建秀 馬艷慶 宋 雷 汪晨凈 郭 淼 夏 溪 趙 晉

（西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)教研室 西北民族大學(xué)西北民族地區(qū)環(huán)境生態(tài)與人群健康實驗室 蘭州 730030）

盡管放射性診斷和治療技術(shù)得到了廣泛提高，但正常組織仍會受到不同程度的損傷，因此提高診斷和治療技術(shù)的同時，做好電離輻射導(dǎo)致的機體損傷防護是提高放療患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵。輻射防護劑是一類能夠清除輻射產(chǎn)生的活性氧、防止基因突變、對機體具有保護作用的物質(zhì)。在接觸放射性物質(zhì)前后使用，均能預(yù)防、減輕放射病的臨床癥狀，促進患者早期康復(fù)。多糖（Polysaccharide）在自然界中分布廣泛，具有多種重要功能。近年來，學(xué)者們在對多糖的免疫增強作用、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血脂、抗病毒等功能研究的同時，發(fā)現(xiàn)多糖在輻射防護方面也具有很重要的作用［1-3］。百合多糖（Lily polysaccharide，LP）具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化的藥理作用，以及具有抗腫瘤、抗疲勞、清除自由基和延緩肺組織纖維化等藥理作用［4］。本實驗通過研究蘭州百合多糖片段（LLP）對X射線輻射導(dǎo)致急性放射性損傷小鼠的防護效果，以期為臨床運用百合多糖作為輻射防護劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蘭州百合購自蘭州市黃河藥材市場；碘化丙啶（Propidium iodide，PI）（美國lsbio 公司）；鼠抗γH2AX 單克隆抗體（美國Upstate Technology 公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。Olympus AX70熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；FACSCalibur 流式細胞分析儀（美國Becton Dickinson 公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）。

X 射線輻照裝置為美國RX-650 Cabinet XRadiator System：能量100 kVp（Kilovolt peak，峰值電壓），電流5 mA，吸收劑量率1.38 Gy/min，照射野20 cm×20 cm。

1.2 蘭州百合多糖片段的制備

1.2.1粗多糖提取純化

百合粗多糖提取自蘭州百合干燥鱗莖粉末中。采用超聲輔助熱水法，上清液濃縮至原體積的1/4后，在濃縮液中加入80%的無水乙醇，4 ℃保存12 h 即得粗多糖。粗多糖用Sevage 法（V氯仿∶V正丁醇=5∶1）純化去除蛋白質(zhì)［5］。

1.2.2LLP的制備

使用DEAE-52-纖維素柱（80 mm×610 mm，北京索拉里奧科技有限公司）從粗多糖中分離LLP片段。用超純水、0.04 mol/L NaCl 和0.1 mol/L NaCl分別洗脫，洗脫液采用苯酚硫酸-紫外分光光度法（UV-1800PC，上海美帕達儀器有限公司）檢測，根據(jù)洗脫模式收集主要餾分，然后在水浴中氮氣流保護下用0.1 mol/L HCl 水解主要餾分。水解后，在水解液中加入20%NaOH，調(diào)節(jié)pH為7.0后透析濃縮，無水乙醇沉淀。干樣品用Sephadex G-50 柱（50 mm×600 mm，Sigma Chemical Co.，USA）分離，用3 L 超純水洗脫，Sephadex G-100柱（3.5 mm×600 mm，Sigma Chemical Co.，USA）純化，并用1.8 L超純水洗脫，得到LLP［6］。平均分子量為8 629.8 Da。

1.3 動物模型的制備、分組及給藥

選用清潔級昆明小鼠，體重為(22±2) g，4～5周齡，雌雄各半，購自蘭州大學(xué)動物實驗中心(合格證號:No.62000800000374)，飼養(yǎng)于蘭州大學(xué)實驗動物中心(許可證號:SCXK[甘]2018-0002)。動物分組及處理：依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，用基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后將無不良反應(yīng)，進食、飲水和活動正常者納入實驗。50只小鼠隨機平均分成5組，每組10 只，雌雄各半。實驗分5 組：(1)正常對照組，不照射，以蒸餾水代替藥物；(2)單純照射組，X射線照射，以蒸餾水代替藥物；(3)低劑量LLP+照射組，X 射線照射，每天灌胃給藥(50 mg/(kg·d))；(4)中劑量LLP+照射組，X射線照射，每天灌胃給藥(100 mg/(kg·d))；(5)高劑量LLP+照射組，X 射線照射，每天灌胃給藥(200 mg/(kg·d))。連續(xù)給藥7 d，末次給藥后以X 射線對第(2)～(5)組小鼠進行一次性全身照射，吸收劑量率為1.38 Gy/min，總劑量為4.0 Gy，建立急性放射性損傷小鼠模型。照射24 h后進行實驗。

1.4 BMNCs收集、含量分析及嗜多染紅細胞微核檢測

取小鼠的雙側(cè)股骨，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（含0.1%肝素鈉）收集股骨BMNCs。用紅細胞裂解液常溫下裂解10 min，離心去上清，PBS洗滌，獲得BMNCs后進行計數(shù)。上面實驗取出的骨髓液置于玻片上制成涂片，待涂片自然風(fēng)干后甲醇固定5～10 min，放入吉姆薩緩沖液中染色15～20 min，立即用蒸餾水沖洗晾干，鏡檢。每只小鼠計數(shù)1 000個嗜多染紅細胞中的微核細胞數(shù)。通過吉姆薩染色法來測定電離輻射誘導(dǎo)小鼠骨髓微核率的發(fā)生［7］。

1.5 BMNCs DNA損傷檢測

1.5.1彗星試驗

消化并調(diào)整細胞濃度為4×107L-1；將50 μL 1%的低熔點瓊脂糖凝膠（Agarose type Ⅶ）均勻鋪開于毛玻片上，室溫下放置備用。將400 μL 的上述細胞和1.2 mL 1%低熔點瓊脂糖凝膠40 ℃下預(yù)熱，混勻后迅速鋪到第一層凝膠上（約1.4 mL），室溫固化3 min。將載玻片浸沒于新配制的預(yù)冷裂解液中（含0.4～0.5 mg/mL 蛋白酶K，使用前加入），4 ℃裂解l h，小心移入37 ℃孵箱孵育18～20 h；Tris-硼酸鹽緩沖液（45 mmol/L Tris-硼酸；1 mmol/L EDTA，pH=8.5）漂洗載玻片3 次，每次30 min。將載玻片靜置于電泳槽中30 min。注意液面高于載玻片2 mm，避光；調(diào)整緩沖液液面高度，使電壓為16～18 V，電流約7 mA，電泳25 min。1%H2O2固定玻片10 min，雙蒸水充分洗滌。PI（5 g/mL）染色30 min，置于密閉濕盒中，4 ℃保存（在24 h 內(nèi)觀察，以防止熒光淬滅）。在熒光顯微鏡（10×40倍）紫外光（UV）的激發(fā)下，DNA圖像呈橘紅色。每個載玻片拍攝至少50個細胞，每個藥物劑量3張片子。本實驗重復(fù)3次。圖片用CASP 軟件分析。計算彗星尾長、頭部DNA百分含量、尾部DNA 百分含量、尾矩（Tail moment，TM）和 Olive 尾 矩（Olive tail moment，OTM）等指標。TM 定義為遷移的平均距離與彗尾部DNA 的分數(shù)的乘積。OTM 計算方法：尾部光密度重心與頭光密度重心之間的距離×尾部DNA百分含量［8］。

1.5.2流式細胞儀分析γH2AX熒光強度

將BMNCs（照射后不同組別）用-20 ℃預(yù)冷的75%乙醇固定，并置于-20 ℃條件下48 h以上。將固定好的細胞離心除去乙醇，并用含有3%BSA和0.05%Tween-20 的PBS 洗滌細胞，加入γH2AX（Ser139）一抗，4 ℃過夜。細胞離心棄上清并用PBS 洗滌3 次，加入熒光二抗室溫避光孵育1 h 。收集細胞并用PBS 洗滌1 次，再加入200 μL PBS懸浮細胞，用流式儀收集數(shù)據(jù)。最終結(jié)果以γH2AX（Ser139）熒光強度變化表示［9］。

1.6 BMNCs凋亡和周期分布檢測

取分離的（照射后不同組別）約1×105個BMNCs，凋亡檢測試劑盒染色后采用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。用-20 ℃預(yù)冷的75%乙醇固定BMNCs，并置于-20 ℃條件下48 h 以上。將固定好的細胞離心除去乙醇，PBS 洗滌后碘化丙啶(PI)染色進行流式分析[10]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LLP對小鼠BMNCs數(shù)量和微核率的影響

LLP對輻照小鼠骨髓有核細胞數(shù)量和微核率的影響見表1。由表1 可知，未受輻照小鼠BMNCs數(shù)量為（8.77±0.73）×105mL-1。小鼠接受4 Gy 劑量24 h 后，BMNCs 數(shù)量明顯下降。其中單純對照組BMNCs 數(shù)量降至（4.83±0.39）×105mL-1（p＜0.01），說明急性放射性損傷模型成立；相對于照射組，LLP的50 mg/（kg·d）劑量組BMNCs數(shù)量可升高至（5.43±0.45）×105mL-1，100 mg/（kg·d）和200 mg/（kg·d）劑量組BMNCs 數(shù)量分別為（7.03±0.51）×105mL-1（p＜0.01）和（7.20±0.42）×105mL-1（p＜0.01），表明LLP 可顯著緩解輻照后BMNCs 數(shù)量的減少，并呈現(xiàn)出劑量依賴性。

表1 LLP對X射線誘導(dǎo)小鼠BMNCs數(shù)量和微核率的影響Table 1 Effects of LLP on the number of BMNCs and micronucleus rate in mice induced by X-ray (± s)

表1 LLP對X射線誘導(dǎo)小鼠BMNCs數(shù)量和微核率的影響Table 1 Effects of LLP on the number of BMNCs and micronucleus rate in mice induced by X-ray (± s)

注：n=10；*p＜0.05,**p＜0.01；a與對照組比較；b與單純照射組比較。Note:n=10;*p＜0.05,**p＜0.01;a,compared with the control group;b,compared with the simple irradiation group.

吉姆薩染色法測定電離輻射誘導(dǎo)小鼠BMNCs微核率的結(jié)果顯示，小鼠接受4 Gy 劑量24 h 后，BMNCs 微核率明顯升高。不同劑量的LLP 均可使微核率降低，改善了染色體的損傷情況，并呈現(xiàn)出劑量依賴性。與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01）。

2.2 LLP 對X 射線誘導(dǎo)小鼠BMNCs DSB 的影響

中性彗星電泳檢測結(jié)果顯示，X 射線照射后24 h，小鼠BMNCs 呈現(xiàn)出彗星細胞指標的典型改變。對照組TM、OTM明顯升高，不同劑量的LLP干預(yù)后均有所下降，100 mg/（kg·d）和200 mg/（kg·d）劑量組與對照組比較有顯著性差異（p＜0.01）（表2）。結(jié)果表明，LLP對急性放射性損傷引起的小鼠BMNCs DNA雙鏈斷裂有保護作用。

表2 LLP對X射線誘導(dǎo)小鼠BMNCs DSB的影響Table 2 Effects of LLP on DSB of mouse BMNCs induced by X-rays （± s）

表2 LLP對X射線誘導(dǎo)小鼠BMNCs DSB的影響Table 2 Effects of LLP on DSB of mouse BMNCs induced by X-rays （± s）

注：n=10；*p＜0.05,**p＜0.01；a與對照組比較；b與單純照射組比較。Note:n=10;*p＜0.05,**p＜0.01;a,compared with the control group;b,compared with the simple irradiation group.

2.3 LLP 對X 射線誘導(dǎo)BMNCs γH2AX 熒光強度的影響

流式細胞儀分析結(jié)果顯示，X 射線誘導(dǎo)的BMNCs γH2AX 熒光強度從190.33±11.93 上升到523.33±18.77（p＜0.01）。與對照組比較，低、中、高劑量組可降低至420.33±10.97、278.00±11.16 和204.00±12.53（p＜0.01），有顯著性差異（表3）。結(jié)果也表明，LLP 對急性放射性損傷引起的小鼠BMNCs DNA雙鏈斷裂有保護作用，并呈現(xiàn)出劑量依賴性。

表3 LLP對小鼠BMNCs γH2AX熒光強度、凋亡率和周期分布的影響Table 3 Effects of LLP on γH2AX fluorescence intensity,apoptosis rate,and cycle distribution of mouse BMNCs（± s）

表3 LLP對小鼠BMNCs γH2AX熒光強度、凋亡率和周期分布的影響Table 3 Effects of LLP on γH2AX fluorescence intensity,apoptosis rate,and cycle distribution of mouse BMNCs（± s）

注：n=10；*p＜0.05,**p＜0.01；a，與對照組比較；b，與單純照射組比較。Note:n=10;*p＜0.05,**p＜0.01;a,compared with the control group;b,compared with the simple irradiation group.

2.4 LLP對X射線誘導(dǎo)BMNCs凋亡和周期分布的影響

流式細胞儀分析結(jié)果顯示，X 射線誘導(dǎo)的BMNCs 凋亡率從（4.27±0.29）%上升到（19.17±0.26）%。50 mg/（kg·d）劑量組可降低至（10.79±0.21）%；100 mg/（kg·d）和200 mg/（kg·d）劑量組分別為（10.45±0.21）%和（8.71±0.25）%，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01）（表3）。

流式細胞儀分析結(jié)果顯示，各組小鼠BMNCs細胞周期大多處于G0/G1 期，4 Gy 的X 射線照射后24 h細胞周期呈現(xiàn)重新分布，G0/G1期細胞比例明顯增加，S 期和G2/M 期比例明顯減少。不同劑量組的細胞周期比例均有不同程度的影響，50 mg/（kg·d）劑量組引起S 期比例有所上升（p＜0.05）；100 mg/（kg·d）和200 mg/（kg·d）劑量組引起S期比例明顯上升（p＜0.01）；100 mg/（kg·d）和200 mg/（kg·d）劑量組引起G0/G1 期比例明顯降低（p＜0.01）；200 mg/（kg·d）劑量組引起G2/M 期比例明顯上升（p＜0.01）（表3）。結(jié)果表明：LLP對急性放射性損傷小鼠BMNCs細胞周期改變有一定的影響，并減輕骨髓細胞凋亡速度。

3 討論

從天然來源提取的多糖數(shù)量眾多且毒性低。體內(nèi)外實驗表明，多糖通過抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保護造血系統(tǒng)和防止DNA 損傷等作用具有抗輻射活性［11］。本文研究了蘭州百合多糖片段是否對輻射誘導(dǎo)的小鼠BMNCs損傷具有保護作用。

造血系統(tǒng)對電離輻射十分敏感，大于1 Gy 的劑量即可引起造血系統(tǒng)損傷，因此造血系統(tǒng)損傷是一種比較常見的輻射引起的機體損傷。骨髓對輻射具有高敏感性。骨髓DNA 含量和有核細胞數(shù)可以反映機體造血功能狀態(tài)，骨髓有核細胞減少是射線對骨髓不良反應(yīng)的直接表現(xiàn)［12］。本研究對小鼠骨髓有核細胞的數(shù)量和微核率進行觀察，證明LLP保護DNA 損傷可能是通過增加骨髓有核細胞數(shù)量以及降低微核率發(fā)揮作用（表1）。

研究發(fā)現(xiàn)，中性單細胞凝膠電泳檢測的DSB的初始損傷多不能反映細胞的放射敏感性，而多以經(jīng)過一定時間修復(fù)后殘留損傷或初始損傷與殘留損傷的比值作為觀察指標［13］。本研究選取輻照后24 h 的小鼠骨髓有核細胞進行中性彗星實驗。TM 為彗星遷移的平均距離與彗尾部DNA 分數(shù)的乘積值。OTM為尾部與頭部的光密度重心間距×尾部DNA 百分含量。實驗結(jié)果顯示，LLP 對急性放射性損傷引起的小鼠骨髓有核細胞DSB 具有明顯的防護效應(yīng)。輻射損傷早期即可誘發(fā)DNA 遷移各項指標變化，其變化幅度具有特征性劑量-效應(yīng)關(guān)系［14］。蘭州百合多糖有助于恢復(fù)輻射損傷修復(fù)，呈現(xiàn)出劑量依賴性（表2）。

γH2AX 抗體標記是探測DSB 存在的金標準。細胞在DNA損傷后，H2AX 迅速地發(fā)生了磷酸化，并在DSB 位點凝集成焦點。免疫組化法、Western blot 和流式細胞計數(shù)法是最常用的鑒別γH2AX 陽性表達的方法。其中，流式細胞術(shù)即可通過γH2AX 熒光強度大小判斷損傷程度，也可以用來評估DNA 損傷與細胞周期之間的關(guān)系［15］。不同劑量的蘭州百合多糖均可降低γH2AX 陽性表達，表現(xiàn)出輻射損傷防護效應(yīng)（表3）。

流式細胞儀分析結(jié)果顯示，LLP可以減少X射線引起的骨髓有核細胞凋亡和G0/G1 期阻滯（表3）。電離輻射誘導(dǎo)的細胞周期阻滯是機體的一種保護性反應(yīng)，一方面啟動損傷的細胞進行自我修復(fù)，另一方面誘導(dǎo)不能修復(fù)的損傷細胞凋亡，以降低基因組的不穩(wěn)定性，減少細胞癌變幾率。雖然射線誘導(dǎo)的細胞周期阻滯大多為G2/M 期阻滯，但也不乏存在G0/G1 期阻滯的報道。馬淑梅等［16］研究了不同劑量X 射線全身照射對小鼠骨髓細胞周期進程的影響，結(jié)果顯示，0.5～6.0 Gy X射線全身照射后小鼠骨髓造血細胞出現(xiàn)明顯的G1、G2 阻滯，S 期合成能力降低。謝漪課題組［17］研究了低劑量連續(xù)輻照引起的小鼠免疫系統(tǒng)的變化，實驗結(jié)果表明，小鼠胸腺細胞的周期在照射后24 h 被阻滯在G2/M 期；外周血淋巴和胸腺細胞周期48 h被阻滯在G0/G1 期；脾臟淋巴細胞周期24 h 被阻滯在G0/G1期，48 h 被阻滯在S期。本次實驗只做了4 Gy 的X 射線全身照射后24 h 對小鼠骨髓細胞的周期進程影響，將來的實驗可以檢測不同劑量的X 射線在照射后不同時間點對周期阻滯的影響是否有其他變化。

4 結(jié)論

研究結(jié)果顯示，蘭州百合多糖片段對放射性急性損傷小鼠骨髓有核細胞具有一定的保護作用，且有明顯的劑量依賴性。主要是減少骨髓有核細胞損傷，降低微核率，以及降低輻射引起的DSB，還對輻射引起的細胞凋亡有保護作用。這對將蘭州百合多糖作為輻射防護劑具有一定的參考價值。

作者貢獻說明所有作者都對研究的構(gòu)思和設(shè)計做出了貢獻。材料準備、數(shù)據(jù)收集和分析由郭忠，馬建秀，馬艷慶，宋雷，汪晨凈，郭淼和夏溪進行。手稿的初稿由郭忠，趙晉撰寫，趙晉對手稿的最終版本進行了修改。所有作者閱讀并認可了終稿。