呂正陽，許鈺瀅，吳鳳娟，劉 娟，汪銀平，邵登科，翁志強，王榮波，魯國東1,，葉文雨1,*

(1.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.植物與微生物相互作用福建省高校重點實驗室，福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學植物保護學院，福建 福州 350002；4.福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點實驗室，福建 福州 350013)

巨菌草(PennisetumgiganteumJUJUNCAO)是一種由福建農(nóng)林大學林占熺教授從非洲引進選育的一種草本植物。巨菌草具有飼養(yǎng)畜禽、栽培食用菌、防風固沙、發(fā)展生物能源、造紙等用途[1-6]。

PGPR(plant growth promoting rhizobacteria)指的是能夠促進植物生長的根際細菌。眾多研究結(jié)果表明，根際范圍內(nèi)是微生物群落中的微生物種類和數(shù)目遠遠大于非根際土壤微生物[7-9]。促生細菌有著促進植物生長、增加作物產(chǎn)量等作用。PGPR按作用機理可分為兩大類，一類是直接作用，如解磷固氮產(chǎn)生鐵載體等[10-12]；另一類是間接作用，如對病原菌有抑制作用，從而提高作物的抗病性。本試驗由土壤微生物中篩選一株對稻瘟病菌、禾谷鐮刀菌、香蕉枯萎病菌1號、香蕉枯萎病菌4號均有作用的菌株，并研究其生理生化特性和促生能力。

磷元素是植物正常生長發(fā)育所必需的微量元素之一，具有解磷能力的微生物可以將土壤中難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為可溶態(tài)磷，幫助植物更好吸收土壤中磷元素，是最常見的限制作物生長的礦質(zhì)元素之一，具有促生作用[11，13]。固氮微生物可將氮氣轉(zhuǎn)化為生物可利用活性氮，可減少氮肥使用，促進植物生長[12]。能夠產(chǎn)鐵載體的細菌對植物具有促生作用，因為土壤中的鐵以三價鐵離子和不溶性氧化態(tài)為主，可溶性的二價鐵離子含量很少，而鐵是植物的生長發(fā)育過程中的一個重要微量元素[10]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

供試菌株：該菌株由福建省平潭市長江澳菌草防風治沙基地巨菌草根系土壤中分離出。

供試病原菌：分別為稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、尖孢鐮刀菌古巴專化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense，F(xiàn)oc)引起的香蕉枯萎病中，‘熱帶1號’生理小種(Foctropical race 1，F(xiàn)ocTR1)以下簡稱香蕉枯萎病菌1號；‘熱帶4號’生理小種(Foctropical race 4，F(xiàn)ocTR4)以下簡稱香蕉枯萎病菌4號，均保存在植物與微生物相互作用福建省高校重點實驗室。

1.1.2 主要試劑、儀器

有機磷細菌培養(yǎng)基、無機磷培養(yǎng)基、血液瓊脂基礎(chǔ)、CAS檢測培養(yǎng)基、硅酸鹽細菌培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)；生化培養(yǎng)箱(寧波海螺賽福實驗儀器廠)；UNIQUE-R20 純水機(銳思捷科學儀器有限公司)；超凈工作臺ZHJH-C1214B(廈門德維科技有限公司)等。

1.1.3 培養(yǎng)基配方

LB固體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，pH6.8-7.2)，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml)，血液瓊脂培養(yǎng)基(現(xiàn)配血液瓊脂基礎(chǔ)，胰蛋白胨15.0g，大豆蛋白胨5.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂13g，蒸餾水1000ml，pH 7.2-7.4，高壓滅菌后，冷卻至50-55℃時無菌操作加入5%-10%預溫至37℃的無菌脫纖維羊血，混勻)，淀粉水解培養(yǎng)基(可溶性淀粉20g，蛋白胨10g，牛肉粉5g，NaCl 5g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml)，明膠培養(yǎng)基(蛋白胨5g，明膠150g，蒸餾水1000ml，pH 7.2-7.4)，脫脂奶粉培養(yǎng)基(脫脂奶粉20g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml)，有機磷細菌培養(yǎng)基(葡萄糖10.0g，硫酸銨0.5g，酵母浸粉0.5g，氯化鈉0.3g，氯化鉀0.3g，硫酸鎂0.3g，硫酸亞鐵0.03g，硫酸錳0.03g，卵磷脂0.2g，碳酸鈣1.0g，瓊脂15.0g，pH 7.0-7.5)，無機磷培養(yǎng)基(葡萄糖10.0g，硫酸銨0.5g，酵母浸粉0.5g，氯化鈉0.3g，氯化鉀0.3g，硫酸鎂0.3g，硫酸亞鐵0.03g，硫酸錳0.03g，磷酸三鈣5.0g，pH 7.0-7.5)，Ashby培養(yǎng)基(甘露醇10.0g，磷酸二氫鉀0.2g，七水合硫酸鎂0.2g，氯化鈉0.2g，二水合硫酸鈣0.1g，碳酸鈣5.0g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，pH 7)，CAS檢測培養(yǎng)基(CAS檢測培養(yǎng)基10.87g，加熱煮沸完全溶解于1000ml水中，高壓滅菌后，冷卻至50-55℃時無菌操作每100ml加入3ml無菌水解酪蛋白溶液和1ml無菌 20%葡萄糖)，硅酸鹽細菌培養(yǎng)基(蔗糖5.0g，硫酸鎂0.5g，硫酸鈣0.1g，磷酸氫二鈉2.0g，氯化鐵0.005g，玻璃粉1.0g，瓊脂15.0g，pH 6.8-7.2)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與純化

稱取10g新鮮巨菌草根際土壤，加入盛有100mL，0.85%NaCl生理鹽水的無菌三角瓶中，搖床180rpm，振蕩30min，取出后冰浴靜置2min，取上清液用0.85% NaCl溶液梯度稀釋，分別取稀釋100倍、1000倍、10000倍三種梯度稀釋液100ul涂于LB平板上。挑取單菌落純化3次后保菌備用。

1.2.2 拮抗菌株的篩選

本文采用平板對峙法分別進行拮抗菌株的篩選，將稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌1號、香蕉枯萎病菌4號、禾谷鐮刀菌四種病原菌各打成直徑5mm的菌餅，接種于90mmPDA培養(yǎng)基平板中間。在兩側(cè)用細菌畫一條線，待對照組菌株快長滿時，用十字交叉法測量病原菌菌落直徑。其抑菌率(%)=(對照病原菌菌落直徑-平板對峙病原菌菌落直徑)/對照病原菌菌落直徑×100%[14-15]。

1.2.3 形態(tài)鑒定

將菌株在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24h后，觀察其菌落特征。

1.2.4 分子鑒定

活化菌株，以菌液為模板，用細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′)，1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC TTCA CCCC-3′)進行16S-rRNA基因序列進行PCR擴增。25ul反應(yīng)體系包括Reaction Mix(購于TIANGEN公司)12.5ul，27F，1492R各1ul，模板1ul，并用ddH2O補齊至25ul。PCR 擴增條件:94℃預變性3min；94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸90sec，共設(shè)30個循環(huán)；最后 72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，將所得序列在NCBI 網(wǎng)站上進行BLAST序列對比，使用MegaX軟件采用最大似然(Maximum Likelihood)法，并通過自舉分析(boostrap)進行置信度檢測，自舉數(shù)據(jù)集為1000次，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 生理生化特性鑒定

溶血試驗：將細菌接種于血瓊脂培養(yǎng)基中間，37℃，培養(yǎng)24h，若菌落邊緣產(chǎn)生透明圈，則為β型溶血，若菌落邊緣培養(yǎng)基變綠，則為α型溶血，若無，則為γ型溶血[16]。

淀粉水解酶試驗：將細菌接種于淀粉水解培養(yǎng)基中間，28℃，暗箱培養(yǎng)3d后，均勻滴加碘液至平板上，觀察菌落邊緣出現(xiàn)水解圈則為陽性，若無則為陰性。

明膠液化試驗：在2.0ml EP管中加入1.5ml明膠培養(yǎng)基，并穿刺接種細菌。28℃，暗箱培養(yǎng)5d后，將EP管置于4℃冰箱，1h后觀察拍照，若培養(yǎng)基液化則為陽性反應(yīng)，若培養(yǎng)基無液化則為陰性反應(yīng)。

蛋白酶試驗：將細菌接種于脫脂奶粉培養(yǎng)基中間，28℃，暗箱培養(yǎng)3d，若菌落邊緣產(chǎn)生透明圈，則為陽性，若無透明圈產(chǎn)生，則為陰性[17]。

1.2.6 促生潛力研究

溶磷能力鑒定：分別在有機磷、無機磷培養(yǎng)基上滴加菌液，28℃暗箱培養(yǎng)8d后，觀察菌落周圍是否有透明圈[18]。

固氮能力鑒定：活化菌液，以1∶50比例加入Ashby液體培養(yǎng)基中，28℃，靜置培養(yǎng)7d，若液體渾濁則認為有固氮活性。挑取固氮活性菌株在Ashby固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代3次后，若仍然有固氮活性則視為菌株具有穩(wěn)定固氮活性。

合成鐵載體能力鑒定:將菌株接種于 CAS 檢測培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)5d，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)黃色暈圈，若出現(xiàn)黃色暈圈，表明細菌能夠產(chǎn)生鐵載體，如未出現(xiàn)，則表明細菌不能產(chǎn)生鐵載體[19-20]。

解硅酸鹽能力鑒定：將菌液涂布于硅酸鹽培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4d后，若細菌能在培養(yǎng)基上生長，則表明該細菌有解硅酸鹽能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

菌株P(guān)T-140拮抗四種病原真菌的試驗結(jié)果表明，該菌對稻瘟病菌、禾谷鐮刀菌、香蕉枯萎病菌1號和香蕉枯萎病菌4號四種病原真菌均具有一定程度的抑菌作用(圖1)，抑菌率在11.67%-34.56%之間(圖2)。

圖1 PDA平板上PT-140對不同病原菌的拮抗作用

注：Guy11:稻瘟病菌；PH-1：禾谷鐮刀菌；Foc1:香蕉枯萎病菌1號；Foc4:香蕉枯萎病菌4號。圖2 菌株對不同病原真菌的抑制率

2.2 菌株的形態(tài)學鑒定

菌株P(guān)T-140菌落形態(tài)特征為菌落邊緣整齊，淡黃色，表面光滑，小凸起(圖3)。

圖3 菌株P(guān)T-140的菌落形態(tài)特征

2.3 菌株的分子鑒定

基于16S rDNA基因序列，利用MegaX軟件采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。(圖4)結(jié)果顯示,菌株P(guān)T-140與產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes，KF928775.1)聚在同一分支且16SrDNA序列同源性> 99%，親源關(guān)系最近?？沙醪脚袛嘣揚T-140菌株為產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)。

圖4 基于16S rRNA序列構(gòu)建PT-140的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 菌株的生理生化特性

從圖5A可以看出，將PT-140菌株點種于溶血平板上培養(yǎng)，菌落周圍培養(yǎng)基基質(zhì)變綠色，表明PT-140菌株為α型溶血，具有條件致病性；從圖5B可以看出，將PT-140菌株接種于淀粉水解培養(yǎng)基上培養(yǎng)，沒有產(chǎn)生水解圈，表明PT-140菌株不具備溶解淀粉的能力，在淀粉水解酶試驗中為陰性。從圖5C可以看出，將PT-140菌株穿刺接種于明膠培養(yǎng)基中，結(jié)果為陰性，說明該菌不具有明膠酶。從圖5D可以看出，菌株P(guān)T-140在蛋白酶試驗中結(jié)果為陰性，說明該菌不能夠產(chǎn)生蛋白合成酶。

圖5 菌株P(guān)T-140的生理生化特性

2.5 菌株的促生能力鑒定

如圖6A、6B所示，菌株P(guān)T-140在有機磷培養(yǎng)基、無機磷培養(yǎng)基中有明顯透明圈產(chǎn)生，說明菌株P(guān)T-140具有溶解磷的能力。同時，菌株P(guān)T-140在Ashby液體培養(yǎng)基(圖6C)中靜置培養(yǎng)7d后無明顯渾濁，說明菌株固氮能力不強；菌株在CAS培養(yǎng)基(圖6D)上培養(yǎng)后，有透明圈產(chǎn)生，說明菌株P(guān)T-140具有鐵載體的生產(chǎn)潛力；菌株P(guān)T-140在硅酸鹽培養(yǎng)基中生長緩慢(圖6E)，可能具有較弱的解硅酸鹽能力。

圖6 菌株P(guān)T-140的促生潛力研究

3 討論

菌草是可培養(yǎng)食用菌和藥用菌的草本植物。菌草根系發(fā)達，具有抗干旱、防風固沙、耐鹽堿等能力。前期研究表明，菌草根際土壤微生物具有多樣性。PGPR是環(huán)境友好型微生物，綠色環(huán)保，越來越受到人們關(guān)注。本試驗從巨菌草根際土壤中分離了一株根際細菌PT-140，鑒定為產(chǎn)氣大腸桿菌(Enterobacteraerogenes)。

平板對峙實驗結(jié)果表明，PT-140對稻瘟病菌、禾谷鐮刀菌、香蕉枯萎病菌1號和香蕉枯萎病菌4號四種病原真菌均有一定的抑菌能力，對稻瘟病菌的抑菌率最大為34.56%，對香蕉枯萎病菌4號的抑菌率最小為11.67%。生理生化的試驗結(jié)果表明，溶血試驗α型、淀粉水解試驗、明膠液化試驗、蛋白酶試驗均為陰性。該菌株具有較強的溶磷和產(chǎn)鐵載體能力，而固氮、解硅酸鹽能力相對較弱。

綜上表明：產(chǎn)氣大腸桿菌PT-140具有一定促進植物生長和防治病原真菌的潛能，對多種作物促生和病害也具有很好的防治前景，因此有望開發(fā)為微生物制劑。后續(xù)應(yīng)對產(chǎn)氣大腸桿菌PT-140進行進一步的深入探索，了解其促生和抗菌機制，優(yōu)化其發(fā)酵條件，得到較高活性的促生和生防菌劑，應(yīng)用于大田試驗。