于銀萍，李 林*，張 婷，劉歡歡，王 敏，陸兔林，葉明磊，劉明貴，徐蔥蘢

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210046；2. 江西景德中藥股份有限公司，江西 景德鎮(zhèn) 333302)

豬心血丹參為孟河醫(yī)派臨方特色炮制品，臨床上主要用于治療心神不寧、心悸怔忡及痰迷心竅等證，歷代醫(yī)家認(rèn)為豬心血為養(yǎng)心藥之向?qū)В茉鰪?qiáng)丹參入腦補(bǔ)血安神之功[1]。最早臨床應(yīng)用豬心血的是華佗，其思想影響著大批孟河醫(yī)家，為增強(qiáng)丹參入腦補(bǔ)血安神之功，孟河醫(yī)家創(chuàng)新使用豬心血炮制丹參。孟河醫(yī)家巢崇山寫(xiě)到：“治療素體血虧，肝脾不調(diào)，經(jīng)水色黑而少，納減形瘦，心中空洞，時(shí)有不能自主之狀，夜不能寐，方中用豬心血拌炒丹參”[2]。清代凌奐編撰的《本草害利》[3]中記載：“豬心血拌補(bǔ)心藥丹參之類，用作補(bǔ)心藥之向?qū)?，蓋取以心歸心，以血導(dǎo)血之意”。隨著孟河鎮(zhèn)從醫(yī)者越來(lái)越多，部分醫(yī)家到上海行醫(yī)，影響了上海的炮制技術(shù)[4]，自1959 年第一版《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》起到2018 年第七版均收錄豬心血丹參的炮制方法。

2018 年版《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》[5]收載豬心血丹參，其炮制工藝為：“取丹參用鮮豬心血、黃酒混合液拌勻，使之吸盡，干燥。每100 g 丹參，用鮮豬心3 只取血，加黃酒30 g，混勻”，但炮制工藝并不明晰，3 只鮮豬心血量不穩(wěn)定，干燥方式及時(shí)間等均未具體說(shuō)明，這些原因限制了豬心血丹參工業(yè)化生產(chǎn)。為使豬心血丹參更好地傳承、發(fā)展，故開(kāi)展豬心血丹參炮制工藝與色澤鑒別標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)研究，通過(guò)規(guī)范其炮制工藝，建立生產(chǎn)工藝技術(shù)與操作規(guī)程，為后續(xù)深入研究豬心血丹參炮制機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

島津LC-20AD 型高效液相色譜儀（ 日本SHIMADZU 公司）；MS-105D 型十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AR124CN 型萬(wàn)分之一電子天平［（奧豪斯儀器（上海）有限公司）］；KQ-500B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；H1650-W 型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；CM-5 型分光測(cè)色儀（日本柯尼卡美能達(dá)有限公司）。

丹酚酸B（ 批號(hào)：SBJ-10266，純度≥98%，南京森貝伽生物科技有限公司）；丹參酮 ⅡA（ 批號(hào)：T817771，純度≥98%，北京華威銳科化工有限公司）；甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；磷酸［色譜純，阿拉丁試劑（上海）有限公司］；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；乙醇（分析純，南京晚晴化玻儀器有限公司）。

丹參飲片購(gòu)于上海上藥華宇藥業(yè)有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根莖的加工品；黃酒購(gòu)于紹興市紹一缸酒業(yè)有限公司（批號(hào)：GB/T13662）；豬心血為南京大廠欣樂(lè)肉類食品中心定點(diǎn)屠宰場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)提供。

2 方法

2.1 豬心血丹參的制備

結(jié)合前期單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)豬心血量、黃酒量、烘干溫度、烘干時(shí)間進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。取凈丹參100 g，按L9（34）正交試驗(yàn)表分別加入不同量豬心血和黃酒拌勻，悶潤(rùn)至液體吸盡，在設(shè)定溫度下烘干（水分＜13%），到達(dá)規(guī)定時(shí)間后取出晾涼，即得。炮制工藝因素水平見(jiàn)表1。評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇丹酚酸B 含量、丹參酮 ⅡA 含量、水溶性浸出物、醇溶性浸出物進(jìn)行分析。

表1 豬心血丹參炮制工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab. 1 Orthogonal experimental design of Porcine Cardiac Blood of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma processing process

2.2 水溶性浸出物測(cè)定 依據(jù)2020 年版《中國(guó)藥典》水溶性浸出物測(cè)定法（通則2201）項(xiàng)下的冷浸法測(cè)定[6]。

2.3 醇溶性浸出物測(cè)定 依據(jù)2020 年版《中國(guó)藥典》醇溶性浸出物測(cè)定法（通則2201）項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定[6]，用乙醇作溶劑。

2.4 丹參酮 ⅡA、丹酚酸B 含量測(cè)定

2.4.1 丹參酮 ⅡA 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流 動(dòng) 相A 為 乙 腈，B 為0.02%的磷酸溶液；柱溫：20 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；梯度洗脫程序（0 ～ 6 min，61%A；6 ～ 20 min，61%→90%A；20 ～ 20.5 min，90%→61%A；20.5 ～ 25 min，61%A）[6]。丹酚酸B 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%的磷酸溶液（22 ∶78）為流動(dòng)相；柱溫：20 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm；流速：1.2 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL[7]。HPLC 圖見(jiàn)圖1。

圖1 各成分HPLC 圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituent

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹參酮 ⅡA 對(duì)照品適量，置棕色容量瓶中，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為20 μg/mL 的溶液，即得丹參酮 ⅡA 對(duì)照品溶液。精密稱取丹酚酸B 對(duì)照品適量，加甲醇-水（8 ∶2）混合溶液配制成質(zhì)量濃度為0.11 mg/mL 的溶液，即得丹酚酸B 對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 精密稱取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩） 0.3 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得丹參酮 ⅡA 供試品溶液。精密稱取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）0.15 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-水（8 ∶2）混合溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲30 min，放冷，用甲醇-水（8 ∶2）混合溶液補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 mL，移至10 mL 容量瓶中，加甲醇-水（8 ∶2）混合溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得丹酚酸B供試品溶液。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取丹參酮 ⅡA 對(duì)照品適量，置棕色容量瓶中，加甲醇分別配制成質(zhì)量濃度為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL 的溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y= 54 813X，r=0.999 0，在2.5 ～ 80.0 μg/mL 范圍呈良好的線性關(guān)系。精密稱取丹酚酸B 對(duì)照品適量，加甲醇-水（8 ∶2）混合溶液分別配制成質(zhì)量濃度為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μg/mL 的溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，Y= 9 974.7X，r= 0.999 9，在12.5 ～ 400.0 μg/mL 范圍呈良好的線性關(guān)系。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.4.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，丹參酮 ⅡA、丹酚酸B的RSD分別為0.12%、0.24%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性考察 精密稱取同一樣品6 份，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備。按“2.4.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，丹參酮 ⅡA、丹酚酸B 的RSD 分別為0.18%、0.70%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液在 0、2、4、8、12、18、24 h 分別測(cè)定色譜峰面積，丹參酮 ⅡA、丹酚酸B 的RSD 為0.30%、0.82%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量測(cè)定的同一豬心血丹參（丹參酮 ⅡA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.154 6%） 粉末6 份，每份約0.3 g ，精密稱定。加入丹參酮 ⅡA對(duì)照品約0.463 8 mg，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。取已知含量測(cè)定同一豬心血丹參（丹酚酸B 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.600%） 粉末6 份，每份約0.15 g，精密稱定。加入丹酚酸B 對(duì)照品約8.400 0 mg，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。丹參酮 ⅡA、丹酚酸B 的回收率分別為97.55%、100.02%，RSD 分別為0.45%、0.39%，見(jiàn)表2，說(shuō)明該方法有較好的準(zhǔn)確性。

表2 加樣回收率試驗(yàn)（n = 6）Tab. 2 Result of recovery test（n = 6）

2.5 熵權(quán)法-層次分析法計(jì)算綜合評(píng)分

2.5.1 熵權(quán)法確定各指標(biāo)權(quán)重 熵權(quán)法即在綜合考慮各個(gè)因素所提供信息上，根據(jù)各項(xiàng)指標(biāo)所提供的信息來(lái)確定權(quán)重。信息量越大，所得熵越小，對(duì)評(píng)價(jià)的貢獻(xiàn)度越大，權(quán)重就越大[8]。指標(biāo)權(quán)重（Wj）[9]按下式進(jìn)行計(jì)算：指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化值（Yij） =（實(shí)測(cè)值-最小值） /（最大值-最小值）

2.5.2 層次分析法確定各指標(biāo)權(quán)重 ①建立層次結(jié)構(gòu)模型：結(jié)合影響豬心血丹參炮制工藝的指標(biāo)等因素，建立了三個(gè)層次的結(jié)構(gòu)模型。第一層為目標(biāo)層，即優(yōu)選豬心血丹參炮制工藝；第二層為指標(biāo)層，即影響豬心血丹參炮制工藝的指標(biāo)；第三層為方案層，即正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選豬心血丹參炮制工藝。②構(gòu)造成對(duì)比矩陣。③計(jì)算權(quán)向量并做一致性檢驗(yàn)。④計(jì)算組合權(quán)向量并做組合一致性檢驗(yàn)。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)各指標(biāo)按照不同的重要程度進(jìn)行排序。

注：i , j 即第 j 項(xiàng)指標(biāo)在第i 個(gè)方案中占該指標(biāo)的比重；Pij 即該指標(biāo)的變異大?。籗j 為一組數(shù)據(jù)的信息熵；Pij = 0 時(shí)，定義Si = 0; k 為指數(shù)個(gè)數(shù)。

2.5.3 熵權(quán)法-層次分析法計(jì)算復(fù)合評(píng)分 按下式計(jì)算熵權(quán)法-層次分析法綜合權(quán)重（Hj）[10]，wj、rj為熵權(quán)法、層次分析法所得權(quán)重系數(shù)。

2.6 色度值與指標(biāo)性成分相關(guān)性研究

采用分光測(cè)色儀對(duì)不同炮制程度的豬心血丹參進(jìn)行測(cè)色，以期為豬心血丹參生產(chǎn)在線檢測(cè)提供參考。

按正交試驗(yàn)優(yōu)選的最佳工藝進(jìn)行炮制，但烘干時(shí)間從1 ～ 8 h，設(shè)置8 個(gè)點(diǎn)。對(duì)其顏色進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取平均值，飲片粉碎過(guò)三號(hào)篩，使用CM5 分光測(cè)色儀觀察脈沖下氙弧燈（D65ф3 毫米）的視角設(shè)置為10 點(diǎn)。校準(zhǔn)后，選擇SCE 模式。

2.6.1 精密度試驗(yàn) 取烘干時(shí)間4 h 的豬心血丹參飲片粉末適量，按上述條件進(jìn)行顏色測(cè)定，連續(xù)測(cè)定6 次。L*，a*，b*的RSD 分別為0.01%、0.03%、0.02%，表明該儀器精密度較好。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取烘干時(shí)間4 h 的豬心血丹參飲片6 份粉末適量，按上述條件進(jìn)行顏色測(cè)定，L*，a*，b*的RSD 分別為0.20%、0.40%、0.29% ，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取烘干時(shí)間4 h 的豬心血丹參飲片粉末適量，按上述條件進(jìn)行顏色測(cè)定，于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)行測(cè)定，L*，a*，b*的RSD分別為0.46%、1.61%、1.81%，表明該方法在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)果

3.1 熵權(quán)法-層次分析法計(jì)算復(fù)合評(píng)分

將得到的結(jié)果先采用熵權(quán)法，計(jì)算權(quán)重，丹酚酸B、丹參酮 ⅡA、水溶性浸出物、醇溶性浸出物的權(quán)重分別為0.49、0.14、0.20、0.17。再采用層次分析法對(duì)各指標(biāo)按照重要程度進(jìn)行排序。排列結(jié)果為丹酚酸B =丹參酮 ⅡA ＞水溶性浸出物=醇溶性浸出物，然后采用和積法并進(jìn)行歸一化，得到結(jié)果為丹酚酸B、丹參酮 ⅡA、水溶性浸出物、醇溶性浸出物的權(quán)重0.33、0.33、0.17、0.17。并進(jìn)行一致性比值（CR）計(jì)算，CR = 0（ ＜0.1）說(shuō)明矩陣合理有效，權(quán)重系數(shù)可靠[11]。CR 越大，矩陣一致性越差；CR 為0 說(shuō)明矩陣具有完全一致性。最后使用AHP-熵權(quán)法復(fù)合評(píng)分計(jì)算，丹酚酸B、丹參酮ⅡA、水溶性浸出物、醇溶性浸出物的綜合權(quán)重分別為0.60、0.18、0.12、0.10。綜合權(quán)重計(jì)算綜合評(píng)分：Z = 0.60×100×（ 丹酚酸B 含量/丹酚酸B 含量最大值）+ 0.18×100×（丹參酮Ⅱ A 含量/丹參酮 ⅡA 含量最大值）+ 0.12×100×（水溶性浸出物/水溶性浸出物最大值）+ 0.10×100×（醇溶性浸出物/醇溶性浸出物最大值） 。最后進(jìn)行方差分析，得出炮制豬心血丹參最佳工藝，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果分析Tab. 3 Analysis of L9（34） orthogonal test results

表4 方差分析結(jié)果Tab. 4 The results of the analysis of variance

結(jié)果顯示，豬心血丹參炮制工藝僅因素A 對(duì)AHP 綜合評(píng)分存在顯著影響（P＜0.05），熵權(quán)法所得各因素對(duì)綜合評(píng)分無(wú)顯著影響（P＞0.05）。各因素對(duì)AHP-熵權(quán)法綜合評(píng)分影響順序?yàn)锳＞C＞D＞B，最佳工藝為A1B2C1D1，即豬心血量20 g/100 g，黃酒量30 g/100 g，烘干溫度50 ℃，烘干時(shí)間4 h。

3.2 豬心血丹參最佳炮制工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取丹參飲片100 g，按上述最佳炮制工藝炮制3 批豬心血丹參，按“2.2”“2.3”“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。由結(jié)果可知，優(yōu)選所得炮制工藝制備豬心血丹參飲片穩(wěn)定、可行。故該工藝可作為生產(chǎn)時(shí)炮制豬心血丹參條件。

表5 豬心血丹參最佳炮制工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（%，n = 3）Tab. 5 The best process verification results of Porcine Cardiac Blood of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma（%，n = 3）

3.3 豬心血丹參樣品顏色測(cè)定

對(duì)不同炮制程度豬心血丹參飲片進(jìn)行顏色測(cè)定，見(jiàn)表6、圖2。

圖2 豬心血丹參不同炮制程度色度值變化趨勢(shì)圖Fig. 2 Trend chart of color values of different degrees of preparation of Porcine Cardiac Blood of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma

表6 豬心血丹參飲片含量測(cè)定及色度值結(jié)果（n = 3）Tab. 6 Determination of the content and color value of Porcine Cardiac Blood of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma（n = 3）

3.4 色度測(cè)定結(jié)果分析

3.4.1 炮制時(shí)間與色澤相關(guān)性分析 將所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，Pearson 相關(guān)系數(shù)顯示，L*與炮制時(shí)間（2 ～ 8 h）呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.944（P＜0.01）；a*與炮制時(shí)間（2 ～ 8 h）呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.931（P＜0.01）；b*與炮制時(shí)間（2 ～ 8 h）呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.79（3P＜0.05）。

3.4.2 色澤與含量相關(guān)性分析 將所得含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果輸入SPSS 26.0 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，Pearson 相關(guān)分析見(jiàn)表7。

表7 豬心血丹參色澤與含量的相關(guān)性分析結(jié)果Tab. 7 Results of correlation analysis between the color of Porcine Cardiac Blood of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma and the time and content of preparation

3.4.3 建立色度值參考范圍 將最佳炮制工藝所得豬心血丹參飲片的色度值作為基準(zhǔn)上下浮動(dòng)20%得到L*，a*，b*值范圍為50.19 ～ 75.29、8.82 ～ 13.22、16.10 ～ 24.14。只有L*值和b*值范圍可以較好的區(qū)分豬心血丹參炮制不及和炮制適中的樣品，所以選擇L*值和b*值范圍確定豬心血丹參色度值參考范圍。以此來(lái)確定豬心血丹參飲片在炮制過(guò)程中是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。

4 討論

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)丹參炮制成豬心血丹參后，其水溶性成分與豬心血的肽類結(jié)合可以提高入血入腦的濃度[12]。脂溶性成分可以與其中的氨基酸或短肽形成鹽類，增加溶解度，從而使其功效增加[13]。這些復(fù)合物目前無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確的含量測(cè)定，故在丹酚酸B、丹參酮 ⅡA含量的基礎(chǔ)上增加水溶性浸出物和醇溶性浸出物作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。層次分析法（AHP）為主觀賦值法，熵權(quán)法為客觀賦值法，兩者進(jìn)行綜合評(píng)分，所得結(jié)果更加合理。豬心血丹參在炮制過(guò)程中，溫度要適宜，溫度太低、烘干時(shí)間太短，水分無(wú)法達(dá)到要求，則會(huì)使豬心血丹參霉變速度加快；溫度太高、烘干時(shí)間太長(zhǎng)，則會(huì)破壞豬心血丹參中有效成分，丹酚酸B 降解速度隨溫度升高而增大[14]。

由于飲片生產(chǎn)企業(yè)工業(yè)化生產(chǎn)烘干設(shè)備溫度控制誤差較大，設(shè)備不同部位溫度區(qū)別明顯，導(dǎo)致小試生產(chǎn)工藝無(wú)法順利移至工業(yè)化生產(chǎn)，為了使企業(yè)批量生產(chǎn)時(shí)得到質(zhì)量合格的飲片，采用分光測(cè)色儀對(duì)豬心血丹參不同炮制程度飲片進(jìn)行顏色測(cè)定，研究豬心血丹參飲片顏色、含量與炮制時(shí)間的關(guān)系。以期在批量生產(chǎn)時(shí)通過(guò)顏色來(lái)判斷豬心血丹參飲片炮制程度。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)豬心血丹參炮制程度不同，其顏色也不同，對(duì)其含量和顏色進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示炮制時(shí)間與顏色顯著相關(guān)，即隨著炮制時(shí)間延長(zhǎng)，L*升高，a*和b*降低。L*值范圍和b*值范圍可以較好的區(qū)分豬心血丹參炮制不及和炮制適中的飲片，故選擇L*值范圍和b*值范圍來(lái)衡量其是否合格。

5 結(jié)論

本研究通過(guò)AHP-熵權(quán)法和色差原理建立豬心血丹參的炮制工藝，經(jīng)驗(yàn)證該炮制工藝條件穩(wěn)定可行，可為規(guī)范化生產(chǎn)豬心血丹參奠定基礎(chǔ)。但針對(duì)豬心血丹參飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善的問(wèn)題，有待進(jìn)一步研究，以期為豬心血丹參的臨床應(yīng)用提供科學(xué)參考。