呂經(jīng)緯，李春楠，李 光，張楠茜，張凱月，邊學(xué)峰，張 輝, ，孫佳明,

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)藥信息學(xué)院，吉林長春 130117）

隨著人口老齡化發(fā)展，骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）已成為世界上第七大常見疾病[1]，給醫(yī)療和社會造成嚴重的負擔(dān)[2]。研究表明骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展和飲食息息相關(guān)[3]，采用藥膳食療法改善骨質(zhì)疏松癥越來越受到認可。Tseng等報道異黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松等作用[4-5]，異黃酮可提高骨密度，提高血清骨形成指標(biāo)水平，促進骨質(zhì)疏松大鼠骨形成[6]。作為純天然的植物提取物，異黃酮具有活性好、安全性高、來源廣泛、毒性低等特點，在藥品、保健品、功能食品及化妝品行業(yè)具有重要的用途[7]。

雞血藤為豆科植物密花豆（Spatholobus suberectusDunn）的干燥莖藤，主要來源于廣東、廣西等省，被廣泛用作茶、酒和湯的食品添加劑[8]，具有行血補血、通經(jīng)活絡(luò)、強壯筋骨之功效[9]，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療骨質(zhì)疏松中有著悠久的歷史[10]。研究表明，雞血藤中含有大量的異黃酮[11]，具有促進成骨細胞合成和分泌堿性磷酸酶的作用[12]，其提取物對胎鼠尺骨和撓骨的生長有促進作用[13]。曹輝等[14]報道以雞血藤為君藥的藤黃健骨膠囊具有治療骨質(zhì)疏松的作用，能夠抑制骨質(zhì)吸收、促進成骨細胞形成和骨的重建。但雞血藤治療骨質(zhì)疏松癥的機制尚不明確，因此，研究雞血藤活性成分治療骨質(zhì)疏松的分子機制具有重要意義。以往的研究表明，植物來源有效成分中大多數(shù)研究集中在單一成分與抗骨質(zhì)疏松活性的關(guān)系上，而揭示天然產(chǎn)物與細胞蛋白之間復(fù)雜的相互作用以及對人體功能的影響未見報道。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)模型，并應(yīng)用分子對接驗證分析，篩選出雞血藤抗骨質(zhì)疏松的有效成分與關(guān)鍵靶點，為尋找植物來源的天然化合物抗骨質(zhì)疏松的保健食品開發(fā)提供快速、高效篩選的方法參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備

從TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫和文獻[15-20]中收集雞血藤14個有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，包括黃酮類和酚酸類（見表1），所有化合物均從NCBI PubChem數(shù)據(jù)庫（http://www.NCBI.nlm.nih.gov/pccompound/）下載并保存為sdf格式文件，提交至PharmMapper數(shù)據(jù)庫，參數(shù)和最大生成構(gòu)象分別設(shè)置為ON和300，在高級選項中選擇“僅人類蛋白質(zhì)靶點（v2010，2241）”，其他選項設(shè)為默認值[21-24]，采用統(tǒng)計方法和反向?qū)蛹夹g(shù)來識別化合物的潛在靶點，最后選擇z’-score＞1[25]的匹配靶點進行綜合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。

1.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和拓撲分析

將PharmMapper數(shù)據(jù)庫篩選出的靶點去重后，通過使用檢索/ID映射（http://www.uniprot.org/uploadlists/）將靶點轉(zhuǎn)換為UniProtKB標(biāo)識符用于以下網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和拓撲分析。通過Cytoscape 3.7.2軟件[26]構(gòu)建14個化合物與PharmMapper靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，可視化分析之間存在的聯(lián)系，并對成分-靶點網(wǎng)絡(luò)進行GO生物學(xué)注釋和KEGG富集分析，以確定雞血藤抗骨質(zhì)疏松作用的關(guān)鍵通路。Clue GO插件用于分析生物網(wǎng)絡(luò)中注釋和功能組之間的相互關(guān)系，并對關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)進行深入的探索。在ClueGO操作界面中，刪除重復(fù)節(jié)點，將UniprotKB導(dǎo)入智人列表，Go-tree區(qū)間為5～10，kappa評分為0.4，P值為0.01，ClueGO結(jié)果僅顯示GO生物過程和KEGG信號通路。

為了篩選復(fù)雜富集網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點和通路，利用CytoNCA插件計算節(jié)點的中心性。CytoNCA提供了8種中心性（介數(shù)、接近中心性、自由度、特征向量中心性、平均最短路徑長度、網(wǎng)絡(luò)中心性、子網(wǎng)絡(luò)中心性和信息中心性），本研究分別選取介數(shù)、接近中心性和子網(wǎng)絡(luò)中心性的前10%的節(jié)點，通過三個中心性的重疊，生成具有關(guān)鍵靶點的子網(wǎng)絡(luò)。

1.3 分子對接

雖然通過各種生物過程和信號通路中的蛋白質(zhì)能夠篩選出一些藥物，但是化合物和蛋白質(zhì)的結(jié)合可能較弱。同樣，雞血藤中的一些化合物可能與關(guān)鍵蛋白質(zhì)結(jié)合較弱，為了剔除這些蛋白質(zhì)和化合物，故進行了基于分子對接的虛擬篩選。

利用AutoDock 4.2軟件進行分子對接，研究潛在靶點與化合物的結(jié)合能力。將表1中14個化合物的配體分別導(dǎo)入軟件中，與從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http://www.RCSB.org/pdb/home/home.do）下載KEGG通路中的靶蛋白進行對接，根據(jù)相關(guān)文獻報道[27-28]，參數(shù)設(shè)置為：Grid Box坐標(biāo)（4DMX：-6.875，2.256，10.836），盒子大小為40×40×40個網(wǎng)格點；（4MXO：11.896，-36.649，-6.446），盒子大小為60×40×40個網(wǎng)格點，運行次數(shù)為100，其他參數(shù)采用軟件的默認設(shè)置，采用拉馬克遺傳（Lamarckian genetic algorithm）算法評價配體與受體的結(jié)合能。采用Pymol、Ligplus軟件對分子對接結(jié)果進行分析與展示。

表1 雞血藤的14個有效成分Table 1 14 active ingredients of Spatholobi Caulis

2 結(jié)果與分析

2.1 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

文章整體架構(gòu)見圖1。雞血藤14個化合物從PharmMapper數(shù)據(jù)庫獲得601個靶點，篩重后通過檢索/ID映射（http://www.uniprot.org/uploadlists/）轉(zhuǎn)換為221個UniProt KB標(biāo)識符用于以下富集分析。應(yīng)用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，生成的網(wǎng)絡(luò)包含235個節(jié)點和601條邊，如圖2所示，化合物越大，表明結(jié)合的靶點越多，化合JXT-02、JXT-03、JXT-06、JXT-10、JXT-11和JXT-13在網(wǎng)絡(luò)中的degree值大于其他化合物，顯示出了更強的多重交互結(jié)合靶點作用，主要包括原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC，UniProtKB：P12931）、組織蛋白酶K（CTSK，UniProtKB：P43235），中性粒細胞膠原酶（MMP8，UniProt KB：P22894）和雌激素受體（分別為ESR1、ESR2、NCOA5，UniProt KB：P03372、Q92731、Q9HCD5），這些蛋白質(zhì)都參與骨質(zhì)疏松和代謝反應(yīng)，該網(wǎng)絡(luò)揭示了雞血藤的14個成分對骨質(zhì)疏松的蛋白質(zhì)靶點或生物途徑有聯(lián)合作用。

圖1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的整體框架Fig.1 Overall framework based on network pharmacology and molecular docking

圖2 14個化合物與601個靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.2 14 compounds and 601 target network

2.2 富集分析

將221個靶點導(dǎo)入ClueGo插件得到靶點生物過程網(wǎng)絡(luò)（456個節(jié)點和5723條邊）和KEGG信號通路網(wǎng)絡(luò)（124個節(jié)點和365條邊）（圖3a～3b），選用3個中心性度值篩選核心子網(wǎng)絡(luò)（圖3c～3d），在同一顏色組中包含了密切相關(guān)的靶點。

中草藥治療疾病的特點具有多成分相互配合、協(xié)同增效的作用。研究表明雞血藤不同成分以相互連接的生物網(wǎng)絡(luò)中不同節(jié)點為目標(biāo)，這些節(jié)點具有相似的功能，而針對這一個相互關(guān)聯(lián)的生物網(wǎng)絡(luò)為目標(biāo)的治療方式有利于避免旁路激活引起的耐藥性。

在GO生物過程子網(wǎng)絡(luò)（包含15個節(jié)點和47條邊）中，15個靶點注釋均與大量生物過程顯著相關(guān)，包括蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、核苷磷酸代謝過程、核苷酸代謝過程、MAPK級聯(lián)反應(yīng)的正調(diào)控、調(diào)節(jié)蛋白激酶活性、含核堿基的小分子代謝過程和有機磷酸酯的生物合成過程（表2，圖3c）；KEGG信號通路子網(wǎng)絡(luò)（包含10個節(jié)點和9條邊）包含流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、細胞色素P450對異生物的代謝、嘧啶代謝和藥物代謝等信號通路（表3，圖3d），此外，KEGG信號通路子網(wǎng)絡(luò)還揭示了與癌癥的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)，由于骨質(zhì)疏松反應(yīng)不可避免地伴隨著代謝反應(yīng)，因此絕大多數(shù)靶點本體注釋和KEGG信號通路都與機體代謝系統(tǒng)有關(guān)，因此，利用該子網(wǎng)絡(luò)來分析雞血藤抗骨質(zhì)疏松作用的機制是可行的。

表2 生物過程子網(wǎng)絡(luò)Table 2 Biological process sub-network

表3 KEGG信號通路子網(wǎng)絡(luò)Table 3 KEGG signal path sub-network

在靶點生物過程和KEGG信號通路富集分析的結(jié)果中，大量的必需靶點與代謝信號通路或生物過程相關(guān)（圖3c～3d），表明雞血藤抗骨質(zhì)疏松可能與代謝異常有關(guān)。

骨質(zhì)疏松代謝相關(guān)的生物過程包含多條信號通路[29]，而流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、細胞色素P450對異生物的代謝等信號通路中的SRC、CTSK等靶點在調(diào)控骨質(zhì)疏松中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[30-31]。關(guān)于骨代謝，SRC在破骨細胞中表達的水平比其他細胞高5～200倍[32]，SRC激酶已被證明可以通過細胞信號傳導(dǎo)和生化調(diào)節(jié)促進破骨細胞的分化和激活，從而導(dǎo)致骨吸收增加[33]，因此SRC蛋白激酶抑制劑是治療骨質(zhì)疏松癥的藥物靶點。另外，與破骨細胞相關(guān)的CTSK表達上調(diào)引起關(guān)節(jié)周圍骨量下降，尤其是股骨末梢干骺端的骨質(zhì)流失[34]，因此，抑制組織蛋白酶K表達可以降低骨質(zhì)流失。以上研究與本網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的KEGG信號通路富集網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果一致（圖3d中橙色和紫色）。

圖3 雞血藤預(yù)測靶點的生物過程網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Biological process network of the predicted target of Spatholobi Caulis

圖3d中的藍色是葉酸生物合成代謝通路，葉酸在體內(nèi)存于腸壁、肝、骨髓等組織中，被葉酸還原酶還原成具有生理活性的四氫葉酸并參與嘧啶的合成，對正常紅細胞的形成有促進作用。這與中醫(yī)對雞血藤活血作用的描述一致。

在KEGG子網(wǎng)絡(luò)中，流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、細胞色素P450對異生物的代謝信號通路進一步劃分并置于同一組中（圖3d）。在KEGG信號通路分析的結(jié)果中，關(guān)鍵靶點SRC是通過流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化信號通路直接參與骨代謝發(fā)揮的作用（條目：hsa:05418，圖3d中淺紫色），同時，調(diào)節(jié)蛋白激酶活性生物過程（條目：GO:0045859，圖3c中淺藍色）也出現(xiàn)在靶點富集分析中協(xié)同發(fā)揮作用。此外，在KEGG富集分析中，細胞色素P450對異生物的代謝信號通路（條目：hsa:00980，圖3d中橙色）也被認為是必不可少的通路，因為該通路中的CTSK對于調(diào)節(jié)骨吸收至關(guān)重要?？梢酝茰y雞血藤通過影響上述信號通路調(diào)節(jié)了骨代謝反應(yīng)并治療骨質(zhì)疏松。

綜上所述，抑制破骨細胞的生物過程在骨質(zhì)疏松和代謝調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用，而流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、細胞色素P450對異生物的代謝信號通路是生物過程的關(guān)鍵。將KEGG子網(wǎng)絡(luò)靶點篩重后，選擇PharmMapper數(shù)據(jù)庫篩選出的、并富集在上述信號通路中的2個蛋白作為進一步對接研究的靶點：SRC（PDBID：4MXO）和CTSK（PDBID：4DMX）。故提示雞血藤14個化合物通過靶向影響破骨細胞分化成熟的關(guān)鍵靶點調(diào)控流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、細胞色素P450對異生物的代謝信號通路，進而表現(xiàn)出抗骨質(zhì)疏松作用。

2.3 分子對接

雞血藤14個化合物的對接結(jié)果見表4，兩個關(guān)鍵靶點（4MXO和4DMX）的平均對接得分為-6.32和-5.47，提示與原配體具有相似的結(jié)合能力（-7.67和-6.87）。結(jié)果表明，雞血藤14個化合物通過2條KEGG信號通路（流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、細胞色素P450對異生物的代謝信號通路）中的2個關(guān)鍵靶點協(xié)同發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。

采用AutoDock 4.2進行分子對接，根據(jù)蛋白質(zhì)與配體之間相互作用的結(jié)合能選擇評分函數(shù)，分別得到每個化合物和受體的對接得分，得分越低，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定[35]，結(jié)果見表4。為了篩選出能夠與關(guān)鍵靶點具有較好結(jié)合能力的化合物，對14個化合物與2個靶點的結(jié)合能進行了研究。在抗骨質(zhì)疏松級聯(lián)反應(yīng)中，按照對接分數(shù)降序排列，篩選出化合物-靶點復(fù)合物。最后，從表4中挑選出與初始配體結(jié)合能相近的前2名對接結(jié)果，其中櫻黃素（JXT-13）和甘草素（JXT-06）與靶位點SRC和CTSK的結(jié)合能力強。研究表明，櫻黃素（JXT-13）可以通過抑制破骨細胞增殖來對骨質(zhì)疏松小鼠起保護作用[36]；甘草素（JXT-06）能抑制破骨細胞形成和骨吸收活性緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞[37]，說明上述化合物對抗骨質(zhì)疏松有效。SRC作為流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化信號通路中的下游成員，SRC激酶刺激破骨細胞生成并激活，從而導(dǎo)致骨吸收增加，引發(fā)骨質(zhì)疏松形成。因此，選擇復(fù)合物JXT-13/4MXO和JXT-06/4DMX（分別為-7.63和-6.31）進行進一步的對接分析研究，以分析抑制劑的結(jié)合能力。

表4 雞血藤14個成分與SRC和CTSK靶點結(jié)合打分排序表Table 4 Molecular docking results of 14 compounds from Spatholobi Caulis with SRC and CTSK

復(fù)合物JXT-13/4MXO和JXT-06/4DMX的配體相互作用分別見圖4b、4d，圖5b、5d。在圖4a、4c中，內(nèi)置配體是SRC的抑制劑，通過3個氫鍵與處于活化狀態(tài)的Abl蛋白的活化環(huán)結(jié)合，其中兩個氫鍵位于ATP結(jié)合位點的鉸鏈區(qū)，另一個將內(nèi)置配體氨基的氮原子與蛋白的Met341氨基酸上羥基的氧原子相連接，從而抑制酪氨酸激酶的活性[27]。在圖4b中可以看到化合物JXT-13的酚基和Glu310、Thr338、Phe405、Glu339和Met341之間存在相互作用的氫鍵。Met341與作為主鏈?zhǔn)荏w的內(nèi)置配體嘧啶形成氫原子，與復(fù)合物JXT-13/4MXO中的羥基具有相似的相互作用。此外，兩個配體周圍的氨基酸（Met341、Thr338、Tyr340、Ala293、Leu393、Leu273、

圖4 活性成分與SRC的對接模式Fig.4 Molecular docking pattern of bioactive compounds with SRC main protease

圖5 活性成分與CTSK的對接模式Fig.5 Molecular docking pattern of bioactive compounds with CTSK main protease

Clu310和Clu339）幾乎相同，表明化合物JXT-13和內(nèi)置配體對SRC具有相似的抑制作用。在圖5中，組織蛋白酶K抑制劑和化合物JXT-06在活性口袋中與周圍的氨基酸形成了相似的相互作用，這些抑制劑對酶活性抑制的作用機制都是利用抑制劑小分子的突觸基團直接與酶分子中Cys25位的巰基形成共價健，并依靠其它位點所形成的多個氫鍵和疏水鍵相互作用進一步穩(wěn)固它們之間的這種結(jié)合，從而使酶失去活性。同時，兩個配體周圍的氨基酸（Asn161、Cly66、Leu209、Leu60、Cly64、Trp26和Gly65）幾乎相同，化合物JXT-06可能通過這些周圍氨基酸與組織蛋白酶K抑制劑表現(xiàn)出相同的作用?；衔颙XT-13的結(jié)果與化合物JXT-06相似，其酚羥基與4MXO、4DMX形成新的相互作用氫鍵，表明這兩個化合物對靶點SRC和CTSK具有較強的結(jié)合能力。

3 結(jié)論

綜上所述，SRC和CTSK可能為雞血藤治療骨質(zhì)疏松癥的核心靶點，分別與櫻黃素、甘草素等有效成分以氫鍵、疏水作用力等連接發(fā)揮治療作用。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)模型，并應(yīng)用分子對接驗證分析，具有快速、高效篩選成分、靶點的作用。同時，該方法對雞血藤治療骨質(zhì)疏松癥的作用機制進行了多維度、多層次分析，并對雞血藤的臨床應(yīng)用具有積極意義，可為揭示中醫(yī)思維的科學(xué)價值提供理論支撐。此外，本實驗室將依據(jù)實驗結(jié)果開展體內(nèi)、外生物學(xué)實驗，進一步為雞血藤治療骨質(zhì)疏松癥提供實驗依據(jù)。