閆靈芝

（運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城 044000）

民以食為天，食以安為先，食品的安全與否直接關(guān)系人民群眾的身體健康?，F(xiàn)代食品工業(yè)技術(shù)的不斷發(fā)展以及不法商販為了追求最大程度的經(jīng)濟(jì)效益，生物性污染食品事件（細(xì)菌及細(xì)菌毒素、真菌及真菌毒素等）、化學(xué)性污染食品事件（農(nóng)藥、獸藥、重金屬、激素、多環(huán)芳烴類化合物、N-亞硝基化合物等）頻頻發(fā)生。對(duì)相關(guān)危害成分的檢測(cè)主要基于高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法以及酶聯(lián)免疫等儀器分析方法，這些方法雖然靈敏度高，但是操作繁瑣，費(fèi)時(shí)，需要專業(yè)的技術(shù)人員同時(shí)檢測(cè)價(jià)格比較昂貴。因此開發(fā)快速、高靈敏度以及廉價(jià)的檢測(cè)方法用以分析食品中的有害成分對(duì)于食品安全的監(jiān)督管理尤為重要。側(cè)流免疫層析技術(shù)（lateral flow immunoassay，LFIA）因其檢測(cè)快速、所需樣本量小、方便攜帶以及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)中。典型的LFIA以球狀納米金顆粒作為信號(hào)標(biāo)記材料，但是這種檢測(cè)方法的結(jié)果是定性（yes/no）或半定量的，無(wú)法滿足高靈敏的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需求[1]。

為了增強(qiáng)LFIA的檢測(cè)性能，突破傳統(tǒng)技術(shù)的缺陷，研究者嘗試從LFIA的信號(hào)標(biāo)記材料、信號(hào)增強(qiáng)方法、多元分析物同時(shí)檢測(cè)以及檢測(cè)信號(hào)的讀出方式等方面做改進(jìn)，這些方法一定程度上提高了檢測(cè)的靈敏度以及檢測(cè)效率。本論文主要對(duì)近年來(lái)LFIA的各種改進(jìn)方法進(jìn)行綜述，以期為免疫層析技術(shù)的進(jìn)一步開發(fā)利用提供借鑒。

1 側(cè)流免疫層析技術(shù)的檢測(cè)原理

常規(guī)的免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)主要由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜、吸水墊以及PVC襯板5部分組成，其相互覆蓋順序如圖1a所示。在硝酸纖維素膜上有用于判定檢測(cè)結(jié)果的檢測(cè)線（test line，T線）和用于判定檢測(cè)結(jié)果有效與否的質(zhì)控線（control line，C線）如圖1b所示。檢測(cè)原理主要基于免疫試劑抗原抗體的特異性結(jié)合，T線上包被捕獲抗原或者捕獲抗體，結(jié)合墊上結(jié)合有色納米材料標(biāo)記的抗體，將待檢測(cè)樣品滴加到樣品墊上后，層析作用的進(jìn)行使得免疫試劑相互結(jié)合，最終可根據(jù)T線區(qū)域信號(hào)顏色的有無(wú)以及信號(hào)的強(qiáng)度判定檢測(cè)結(jié)果[2]。

圖1 側(cè)流免疫層析技術(shù)的示意圖Fig.1 Schematic diagram of LFIA

2 側(cè)流免疫層析技術(shù)的發(fā)展方向

2.1 開發(fā)新型的信號(hào)標(biāo)記材料法

常規(guī)的LFIA通常采用20～30 nm的球狀金納米材料，但是該材料發(fā)光強(qiáng)度較弱，影響檢測(cè)的靈敏度[3]。與此同時(shí)其在制備以及存放的過(guò)程中一旦出現(xiàn)雜質(zhì)便非常容易聚集沉淀進(jìn)而影響納米金的使用。為了改進(jìn)LFIA的信號(hào)標(biāo)記材料，近年來(lái)越來(lái)越多的納米材料被應(yīng)用于免疫層析試紙條上，表1列出了近年來(lái)應(yīng)用于LFIA的納米材料。

表1 在側(cè)流免疫層析技術(shù)中應(yīng)用的信號(hào)標(biāo)記材料Table 1 Signal nanoparticles in LFIA

續(xù)表 1

2.2 納米材料不標(biāo)記單克隆抗體法

在傳統(tǒng)的LFIA中，顯色納米標(biāo)記材料主要通過(guò)靜電吸附法和共價(jià)結(jié)合法標(biāo)記單克隆抗體（monoclonal antibody, mAb），但是靜電吸附法很容易受到抗體等電點(diǎn)、溫度和pH等因素的影響，而共價(jià)結(jié)合法不可避免地會(huì)阻塞mAb的部分抗原結(jié)合位點(diǎn)，最終均導(dǎo)致LFIA的檢測(cè)性能下降[34]。為了克服納米材料對(duì)抗體標(biāo)記過(guò)程中產(chǎn)生的不利影響，研究者開發(fā)出了將納米材料不標(biāo)記mAb的方法。研究者通過(guò)標(biāo)記抗原（antigens，ag）、羊抗鼠抗體（gold nanoparticles labeled goat anti-mouse antibodies，GNPs-GAMA）等物質(zhì)最大程度的暴露mAb的抗原結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)開發(fā)出抗體的替代探針（噬菌體、適配體）用于特異性識(shí)別食品中的有害物質(zhì)，替代探針以其成本低、易合成、穩(wěn)定性好以及保存時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)使得LFIA的檢測(cè)性能提高。表2總結(jié)了納米材料標(biāo)記其他物質(zhì)的檢測(cè)方法。

表2 納米材料不標(biāo)記單克隆抗體法Table 2 Method by nanomaterials unlabeled mAb

2.3 無(wú)納米標(biāo)記材料法

盡管納米材料在LFIA中的應(yīng)用非常廣泛，但是納米材料的合成過(guò)程相對(duì)復(fù)雜且比較費(fèi)時(shí)，其和抗體之間的偶聯(lián)會(huì)影響抗體的活性，不同批次合成的納米材料可能會(huì)存在一定的差異進(jìn)而影響LFIA的檢測(cè)性能，同時(shí)合成的納米探針在膠體作用力下很容易發(fā)生聚集沉淀，需要儲(chǔ)存在4 ℃條件下。因此近年來(lái)研究者探索無(wú)納米材料標(biāo)記的LFIA。

Xu等[45]利用蛋白質(zhì)染料考馬斯亮藍(lán)（coomassie brilliant blue，CBB）開發(fā)了一種新型的檢測(cè)試紙條，通過(guò)使用CBB對(duì)抗呋喃唑酮代謝物（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ）的mAb進(jìn)行染色，染色后的mAb即可作為一種顯色信號(hào)標(biāo)簽進(jìn)而可代替有色納米材料（圖2a），該種方法對(duì)AOZ的檢測(cè)限為2 ng/mL，同時(shí)試紙條的制作成本比其他方法低300倍。Dou等[46]根據(jù)結(jié)晶紫可以與蛋白質(zhì)非共價(jià)結(jié)合的特性，通過(guò)使用結(jié)晶紫對(duì)mAb進(jìn)行染色（圖2b），以AOZ為目標(biāo)分析物，對(duì)其的檢測(cè)限為1.53 ng/mL。Song等[47]通過(guò)采用異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）染色法使得大腸桿菌和大腸桿菌的單克隆抗體均攜帶上黃綠色的熒光（圖2c），這種方法對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)限可達(dá)1 CFU/mL，靈敏度是常規(guī)膠體金試紙的10倍。Bu等[48]利用經(jīng)典的革蘭氏染色法和直接免疫法對(duì)食品中的致病菌進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)使用結(jié)晶紫對(duì)革蘭氏陰性菌沙門氏菌和革蘭氏陽(yáng)性菌李斯特氏菌進(jìn)行染色，染色后的病原菌即可作為顯色信號(hào)（圖2d），該方法對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)限可達(dá)80 CFU/mL，對(duì)李斯特氏菌的檢測(cè)限為104CFU/mL。無(wú)納米標(biāo)記材料法節(jié)省了試紙條制備過(guò)程中復(fù)雜的材料合成過(guò)程以及繁瑣的標(biāo)記過(guò)程，僅僅通過(guò)染色的方法即可獲得檢測(cè)所需的有色信號(hào)，節(jié)省了時(shí)間，同時(shí)操作簡(jiǎn)單、靈敏度較高，是一種基于染色的新型免疫層析技術(shù)。

圖2 無(wú)納米標(biāo)記材料的側(cè)流免疫層析技術(shù)[45-48]Fig.2 Signal nanoparticles-free LFIA[45-48]

2.4 多元分析物同時(shí)檢測(cè)法

傳統(tǒng)的LFIA只能用來(lái)檢測(cè)一種目標(biāo)分析物，檢測(cè)效率較低，不能滿足多種目標(biāo)分析物的同時(shí)檢測(cè)需求。為了提升試紙條的檢測(cè)性能，近年來(lái)研究者開發(fā)了能夠同時(shí)檢測(cè)多元目標(biāo)物的試紙條。

2.4.1 單通道多條T線多元檢測(cè)法 Han等[49]利用金納米顆粒標(biāo)記八種不同待檢物質(zhì)的mAb/受體，同時(shí)在試紙條NC膜上建立八個(gè)檢測(cè)區(qū)域以分別固定八種不同物質(zhì)的捕獲抗原（圖3a），該種方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)喹諾酮（quinolone，QN）、黃曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）、三聚氰胺（melamine，MEL）、四環(huán)素（tetracycline，TC）、β-內(nèi)酰胺類抗生素（β-lactams，BL）、氯霉素（chloramphenicol，CAP）、磺胺類藥物（sulfonamide，SA）和鏈霉素（streptomycin，STR）的同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間少于20 min[49]。這種方法雖然檢測(cè)效率高，但是每條檢測(cè)區(qū)域的顏色相同，因此在檢測(cè)過(guò)程中很容易混淆檢測(cè)目標(biāo)物。為了克服這一缺點(diǎn)，Zhang等[50]開發(fā)出一種T線和C線顏色均不同的免疫層析試紙條用于檢測(cè)魚類中的兩種海藻毒素，該方法將紅色和綠色的熒光微球分別標(biāo)記抗微囊藻毒素和岡田酸的mAb，T線區(qū)域分別固定兩種毒素的ag，樣品的加入和層析作用的進(jìn)行即可在檢測(cè)線區(qū)域觀察到紅色和綠色的條帶，C線區(qū)域則是兩條T線顏色的混合色（圖3b）。檢測(cè)過(guò)程在20 min可以完成，對(duì)微囊藻毒素和岡田酸的檢測(cè)限分別為0.074和2.42 μg/kg。該方法可通過(guò)信號(hào)顏色的不同來(lái)區(qū)分不同的檢測(cè)目標(biāo)物，使得結(jié)果更加容易辨別分析。

圖3 單通道多條檢測(cè)線的側(cè)流免疫層析技術(shù)[49-50]Fig.3 Single channel with multiple T line LFIA[49-50]

2.4.2 單通道單條T線多元檢測(cè)法 Shu等[51]采用混合雜交細(xì)胞技術(shù)制備了一種具有兩個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)的雙功能抗體可用于同時(shí)識(shí)別甲基對(duì)硫磷和吡蟲啉，將此抗體固定于試紙條的一條檢測(cè)線上，結(jié)合時(shí)間分辨化學(xué)發(fā)光技術(shù)即可實(shí)現(xiàn)在一條T線上可完成對(duì)兩種物質(zhì)的檢測(cè)（圖4a），在2.5和300 s時(shí)即可分別采集到甲基對(duì)硫磷和吡蟲啉的檢測(cè)信號(hào)結(jié)果。Fabio等[52]采用紅色和藍(lán)色的金納米材料分別標(biāo)記抗AFB1和伏馬毒素（fumonisins B，F(xiàn)MB）的mAb，將兩種分析物的抗原混合固定于一條T線上，最終T線的顏色取決于分析物的種類、數(shù)量。檢測(cè)原理基于待檢物質(zhì)和固定于T線處的相應(yīng)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合相對(duì)應(yīng)的金納米材料標(biāo)記的mAb，樣品中存在待檢物質(zhì)時(shí)，待檢物質(zhì)優(yōu)先和mAb結(jié)合，進(jìn)而不與T線處的相應(yīng)抗原結(jié)合，即T線處不出現(xiàn)該類物質(zhì)對(duì)應(yīng)的標(biāo)記色。而樣品中不存在待檢物質(zhì)時(shí)，納米材料標(biāo)記的抗體即可與T線處的相應(yīng)抗原結(jié)合出現(xiàn)相應(yīng)的顏色，分析結(jié)果如圖4b所示。該方法對(duì)黃曲霉毒素和伏馬毒素的檢測(cè)限分別為1和50 ng/mL[52]。該方法和單通道多條T線檢測(cè)法相比，在試紙條的制備過(guò)程中節(jié)約了多條T線的制作所需要的劃線時(shí)間，操作比較簡(jiǎn)單，但是此法在檢測(cè)目標(biāo)物過(guò)多時(shí)，會(huì)使結(jié)果的觀察不直觀。

圖4 單通道單條檢測(cè)線的側(cè)流免疫層析技術(shù)[51-52]Fig.4 Single channel with one T line LFIA[51-52]

2.4.3 多通道多元檢測(cè) 近年來(lái)，為了實(shí)現(xiàn)LFIA的高通量檢測(cè)，不同的試紙條結(jié)構(gòu)被設(shè)計(jì)（圖5），比如三通道120度交叉[53]、樹枝狀、花狀、圓盤形、四通道垂直交叉、通道一端平行排列、通道兩端平行排列等[54]。

圖5 多元檢測(cè)方法的檢測(cè)通道結(jié)構(gòu)[53-54]Fig.5 Channel structure of multiple detection method[53-54]

Cheng等[29]開發(fā)了一種雙通道的LFIA以同時(shí)檢測(cè)兩種不同的目標(biāo)分析物，同時(shí)可以消除兩個(gè)目標(biāo)物之間的潛在交叉反應(yīng)，該方法設(shè)置一個(gè)樣品墊，左右兩條通路分別各設(shè)置一個(gè)結(jié)合墊，一條T線和C線（圖6a），對(duì)乙草胺、甲氰菊酯的檢測(cè)限分別為0.63和0.24 ng/mL。Zhao等[55]開發(fā)了一種具有10通道的檢測(cè)試紙盤用以同時(shí)檢測(cè)10種食源性致病菌（圖6b），整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在20 min內(nèi)可完成，對(duì)菌體的檢測(cè)限可達(dá)到10 CFU/0.6 mg。Rong等[56]設(shè)計(jì)了一種可以同時(shí)檢測(cè)四種目標(biāo)分析物的多通道測(cè)試筒，測(cè)試桶的頂部提供了樣品進(jìn)樣通道，四個(gè)流體輸送通道由底盒密封，在420 r/min時(shí)產(chǎn)生的離心力可以將裝載的樣品溶液以1 mm/s的最大流速送入四個(gè)反應(yīng)室（圖6c）。整個(gè)分析工作流程只包括以下幾部分：將樣品加入測(cè)試桶入口，快速旋轉(zhuǎn)以啟動(dòng)免疫反應(yīng)的自動(dòng)送樣，最后將測(cè)試桶裝入讀條器進(jìn)行旋轉(zhuǎn)和光信號(hào)掃描。該測(cè)試桶操作簡(jiǎn)單，特別適合食品安全有害物質(zhì)分析過(guò)程的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。

圖6 多通道多條檢測(cè)線的側(cè)流免疫層析技術(shù)[29,55-56]Fig.6 Multiple channel with multiplex T line LFIA[29,55-56]

2.5 多種信號(hào)的讀出方式

傳統(tǒng)的LFIA檢測(cè)結(jié)果主要分析出現(xiàn)在試紙條上條帶的顏色信號(hào)，通過(guò)比色的方法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。但是該方法在試紙顏色差異不明顯或者樣本背景顏色較深時(shí)會(huì)導(dǎo)致讀出結(jié)果不準(zhǔn)確，近年來(lái)，為了提高試紙條結(jié)果的準(zhǔn)確性，研究者開始探索其他的信號(hào)讀出方式。

2.5.1 化學(xué)信號(hào) 酶催化反應(yīng)的高效性以及出現(xiàn)的相關(guān)顏色反應(yīng)可被儀器設(shè)備所采集，進(jìn)而使得試紙條的讀數(shù)方式不僅僅限于讀取條帶的顏色信號(hào)，通過(guò)采集酶催化反應(yīng)出現(xiàn)的化學(xué)信號(hào)來(lái)提高試紙條讀數(shù)的準(zhǔn)確性。Wang等[40]利用普魯士藍(lán)納米顆粒具有過(guò)氧化物酶活性，將層析之后的T線區(qū)域剪下來(lái)放入3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB）溶液中，T線結(jié)合的普魯氏藍(lán)納米顆粒即可催化TMB產(chǎn)生藍(lán)色的化學(xué)信號(hào)。Hui等[57-58]使用魯米諾還原氯金酸制備魯米諾還原的金納米粒子（Luminol-reduced gold nanoparticles，LuReGNPs），同樣在免疫層析結(jié)束后將T線區(qū)域剪下來(lái)，在過(guò)氧化氫和辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）存在的條件下即可收集到化學(xué)發(fā)光信號(hào)。然而上述方法均需要剪T線區(qū)域，為了提升檢測(cè)試紙條的使用便捷性，Deng等[59]開發(fā)了一個(gè)小型檢測(cè)設(shè)備，所有需要的檢測(cè)試劑均預(yù)先儲(chǔ)存于該設(shè)備中。該設(shè)備由三部分組成：傳統(tǒng)的試紙條、化學(xué)發(fā)光試劑墊和聚碳酸酯殼（polycarbonate holder，PCH），試紙條的金納米顆粒同時(shí)標(biāo)記HRP和檢測(cè)抗體，化學(xué)發(fā)光試劑墊中儲(chǔ)存有提前凍干的氧化劑過(guò)硼酸鈉和魯米諾。傳統(tǒng)的試紙條經(jīng)過(guò)反應(yīng)和肉眼定性分析后，用水溶解化學(xué)發(fā)光試劑墊上的試劑，接著將試劑墊覆蓋于試紙條上，試劑在HRP的催化下反應(yīng)，生成化學(xué)發(fā)光信號(hào)用于定量檢測(cè)。

2.5.2 光熱信號(hào) 光熱材料在近紅外光的照射下可被加熱，溫度變化的信號(hào)可被溫度計(jì)或者紅外照相機(jī)采集。大多數(shù)研究表明通過(guò)讀取該溫度信號(hào)可提高LFIA的檢測(cè)靈敏度[60-62]。Zhang等[33]合成納米金功能化的花狀二氧化錳納米復(fù)合材料，該納米材料可做為光熱信號(hào)的標(biāo)簽，在808 nm激光下輻照T線3 min，通過(guò)使用紅外照相機(jī)即可記錄溫度的變化。該方法對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測(cè)限為0.013 ng/mL，靈敏度是傳統(tǒng)膠體金試紙條的58倍。Li等[63]將金納米顆粒負(fù)載到二維黑磷納米片上（Au nanoparticleloaded two-dimensional black phosphorus，BP-Au），其具有較好的光熱轉(zhuǎn)換性能，通過(guò)結(jié)合抗體制成免疫層析試紙條的探針進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）的檢測(cè)，該方法對(duì)ENR的檢測(cè)限為0.023 μg/L。Su等[64]也利用MnO2-Au納米復(fù)合材料的光熱特性檢測(cè)AOZ，該方法對(duì)其檢測(cè)限為0.43 ng/mL。光熱信號(hào)讀出模式的應(yīng)用提供了更為準(zhǔn)確的結(jié)果，同時(shí)具有強(qiáng)大的抗干擾能力，大大提升了試紙條的檢測(cè)性能。

2.5.3 拉曼信號(hào) 近年來(lái)，在LFIA中使用拉曼信號(hào)標(biāo)記免疫探針的方法已經(jīng)成為提高靈敏度的有效方法，該類信號(hào)穩(wěn)定性較好，同時(shí)可以通過(guò)合理設(shè)計(jì)拉曼信號(hào)分子的結(jié)構(gòu)，大大提高信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)而提升檢測(cè)性能。Li等[65]將具有拉曼信號(hào)的5,5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）標(biāo)記金納米顆粒，通過(guò)在LFIA中采集該探針的拉曼信號(hào)以實(shí)現(xiàn)對(duì)生鮮奶中的粘菌素的檢測(cè)。該方法對(duì)粘菌素的檢測(cè)限為0.10 ng/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于用ELISA方法獲得的報(bào)告值和歐盟規(guī)定的最大殘留限量值。Su等[66]開發(fā)了以金納米顆粒為核，金納米星為殼，DTNB位于兩種材料中間，以最后形成的夾心結(jié)構(gòu)作為拉曼信號(hào)的標(biāo)簽，用該方法檢測(cè)食品中的克倫特羅，對(duì)其檢測(cè)限為0.05 ng/mL，檢測(cè)限比傳統(tǒng)的膠體金試紙條低200倍。同時(shí)金納米星形成的殼結(jié)構(gòu)阻止DTNB被解吸，進(jìn)而使得信號(hào)更加穩(wěn)定。Sheng等[67]合成銀核金殼納米材料并將拉曼信號(hào)分子4-硝基噻吩（4-nitrothiophenol，4-NTP）封裝在核殼材料中間，最終形成的Ag4-NTP@Au作為拉曼信號(hào)標(biāo)簽用以檢測(cè)百菌清（Chlorothalonil，CHL）、吡蟲啉（imidacloprid，IMI）和乙氧氟草醚（oxyfluorfen，OXY）。

2.6 增強(qiáng)顯色信號(hào)法

2.6.1 金屬染色增強(qiáng)法 為了提升試紙條的顯色信號(hào)，研究者試圖通過(guò)銀增強(qiáng)、金增強(qiáng)、銅增強(qiáng)及鉑增強(qiáng)方法提升信號(hào)的強(qiáng)度。銀增強(qiáng)法采用對(duì)苯二酚和銀鹽溶液（硝酸銀或乳酸銀）作為增強(qiáng)試劑，銀離子在金納米顆粒上被還原，顆粒尺寸因還原銀層的形成而增大，同時(shí)形成的銀層是黑色的，在NC膜的白色背景上更為明顯[68]。金增強(qiáng)法采用氯金酸（HAuCl4）和鹽酸羥胺（NH2OH·HCl）通過(guò)金納米顆粒催化HAuCl4和NH2OH·HCl形成更大的金納米顆粒進(jìn)而使得信號(hào)顏色更強(qiáng)[69-70]。銅增強(qiáng)法則利用抗壞血酸（ascorbic acid，AA）和硫酸銅（CuSO4），利用還原劑抗壞血酸可以將Cu2+還原為Cu+，然后在金納米顆粒存在的情況下Cu+轉(zhuǎn)化為銅，銅沉積于檢測(cè)線上也使得信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)[71]。鉑增強(qiáng)法先使用硝酸銀、對(duì)苯二酚使得在試紙條上形成金核銀殼納米材料（Au@AgNPs），緊接著將氯鉑酸（H2PtCl6）和AA加入反應(yīng)體系，進(jìn)而形成Au@AgPtNPs實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的目的。但是上述方法操作繁瑣，延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間[72]。為了解決上述方法的弊端，Yosita等[73]通過(guò)噴蠟打印法在試紙條上設(shè)置延遲通道和非延遲通道（圖7），免疫試劑置于非延遲通道，增強(qiáng)試劑（KAuCl4和NH2OH·HCl）置于設(shè)置有蠟障礙的延遲通道，層析過(guò)程中增強(qiáng)試劑的流動(dòng)速度慢于免疫試劑的流速，試紙條可通過(guò)金增強(qiáng)方法的原理一步實(shí)現(xiàn)信號(hào)增強(qiáng)的目的。

圖7 帶有非延遲通道和延遲通道的側(cè)流免疫層析技術(shù)[73]Fig.7 LFIA with non-delay channel and delay channel[73]

2.6.2 酶催化染色增強(qiáng)法 生物酶具有高效的底物催化活性，進(jìn)而會(huì)產(chǎn)生明顯的肉眼可見的顯色。利用這一特性，研究者試圖在試紙條的納米材料上同時(shí)標(biāo)記單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物，在常規(guī)讀取結(jié)果完成后，把試紙條放入含有底物的溶液中，酶催化底物產(chǎn)生更深的顯色信號(hào)，該方法使得檢測(cè)靈敏度提高一個(gè)數(shù)量級(jí)[74]。而近年來(lái)納米模擬酶由于其較高的穩(wěn)定性，較好的底物催化活性也越來(lái)越引起研究者的關(guān)注。Liu等[25]采用磁性普魯士藍(lán)納米模擬酶作為試紙條的標(biāo)記材料，同時(shí)其可催化顯色底物TMB顯色使得信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，進(jìn)而提升試紙條的檢測(cè)靈敏度，該方法使得檢測(cè)范圍提高兩倍。

2.6.3 雙標(biāo)記增強(qiáng)信號(hào)法 為了提升試紙條的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度，研究者通過(guò)雙標(biāo)記方法使得納米材料聚集在一起進(jìn)而使得顯色信號(hào)增強(qiáng)。Fang等[75]利用生物素-鏈酶親和素（streptavidin, Sa）之間的高親和性，將金納米顆粒標(biāo)記生物素化的抗體和Sa，通過(guò)生物素-Sa系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)金納米顆粒的聚集，用該方法檢測(cè)吡蟲林，檢測(cè)靈敏度比傳統(tǒng)試紙條提高160倍。Zhong等[76]通過(guò)將納米金標(biāo)記抗三聚氰胺的抗體以及抗牛血清白蛋白抗體，由于在試紙條的制備過(guò)程中會(huì)用到牛血清白蛋白封閉非特異性的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而通過(guò)牛血清白蛋白抗原抗體系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)納米顆粒的聚集。該方法使得檢測(cè)靈敏度提高10～25倍。Dou等[77]將納米金標(biāo)記mAb和GAMA，通過(guò)抗體和二抗結(jié)合系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)納米標(biāo)記材料的聚集，進(jìn)而起到增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)的目的，該方法和傳統(tǒng)的試紙條相比檢測(cè)限提高了5倍。

2.6.4 增加通道障礙增強(qiáng)信號(hào)法 影響LFIA檢測(cè)限和靈敏度的一個(gè)關(guān)鍵因素是樣品、免疫試劑和預(yù)先固定在T線的捕獲抗體/抗原之間的反應(yīng)時(shí)間。近年來(lái)研究者通過(guò)降低液體在試紙條上的流動(dòng)速率以增加該反應(yīng)時(shí)間[78-79]。Ioannis等[80]采用激光直寫技術(shù)（laser-direct write，LDW）在NC膜的特定區(qū)域固定液態(tài)的光聚合物，在光聚合作用下其可于NC膜內(nèi)形成一個(gè)較窄的流體通道（圖8a），液體流動(dòng)通道空間收縮使得液體流速變慢，檢測(cè)區(qū)域變小，最終使得檢測(cè)靈敏度提高62倍。Amadeo等[81]在T線位置后的1 mm處設(shè)置可溶性蠟障礙，使得液體溶液短暫停留12 min（圖8b），進(jìn)而延長(zhǎng)了免疫試劑在試紙條上的反應(yīng)時(shí)間，最終使得檢測(cè)靈敏度提高了51.7倍。

圖8 帶有通道障礙的側(cè)流免疫層析技術(shù)[80-81]Fig.8 LFIA with channel barrier[80-81]

3 結(jié)語(yǔ)

LFIA經(jīng)過(guò)多年的不斷完善和發(fā)展，為食品安全檢測(cè)提供了一個(gè)方便、快捷和靈敏的技術(shù)平臺(tái)。該技術(shù)已經(jīng)相對(duì)比較成熟，對(duì)部分分析物的檢測(cè)已實(shí)現(xiàn)商品化應(yīng)用。目前面臨的主要挑戰(zhàn)及發(fā)展趨勢(shì)簡(jiǎn)述如下：基于納米標(biāo)記材料的檢測(cè)試紙存在材料合成步驟繁瑣、條件較為嚴(yán)苛、耗時(shí)耗能、穩(wěn)定性及單分散性較差的缺陷，開發(fā)性能優(yōu)良的信號(hào)標(biāo)記材料仍然是未來(lái)發(fā)展的一大方向；近年來(lái)大部分試紙仍然利用mAb來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的特異性識(shí)別，但是mAb制備過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，需要耗費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力，同時(shí)不同批次間存在差異。開發(fā)可替代mAb的特異性識(shí)別探針諸如核酸適配體、噬菌體及其細(xì)胞內(nèi)溶素等對(duì)LFIA的發(fā)展具有重要的意義；檢測(cè)靈敏度必然是考查試紙條性能優(yōu)良與否的重要參數(shù)，傳統(tǒng)的信號(hào)增強(qiáng)方法依賴額外的操作步驟進(jìn)而使得試紙條的檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)，開發(fā)便捷、省時(shí)的一步信號(hào)增強(qiáng)方法對(duì)提高試紙條的檢測(cè)性能具有重要的意義；對(duì)多元目標(biāo)物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)雖然提高了檢測(cè)的效率，但是存在互相干擾的問(wèn)題使得檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，因此也依賴于高特異性識(shí)別探針技術(shù)的發(fā)展。