肺癌是惡性程度極高的腫瘤，也是癌癥死亡的主要原因。因此，迫切需要提出一種有效的肺癌治療方法。然而，腫瘤的復(fù)發(fā)、多藥耐藥和轉(zhuǎn)移嚴(yán)重阻礙了肺癌的治療效果。腫瘤干細(xì)胞（CSCs）是指具有干細(xì)胞性質(zhì)的癌細(xì)胞，是肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因。CD133抗原是實(shí)體瘤（包括肺癌）CSCs的標(biāo)記物，研究顯示，清除CD133肺癌干細(xì)胞可以顯著提高肺癌治療效果，miR-122過(guò)表達(dá)降低了CD133肺癌干細(xì)胞的干性（Hedgehog、Notch和Wnt/β-catenin通路），提高了肺癌治療效果。

高校團(tuán)委作為高校最大的一個(gè)組織，無(wú)論在哪一方面的資源獲取都具有非常大的優(yōu)勢(shì)，在這種情況下，只有高校團(tuán)委合理的配置各類信息資源，教師專家資源，校外資本引入，才能在一定程度上發(fā)揮其在學(xué)生創(chuàng)業(yè)體系建構(gòu)上的主導(dǎo)者地位。高校團(tuán)委在構(gòu)建創(chuàng)業(yè)體系的同時(shí)，應(yīng)該將創(chuàng)業(yè)實(shí)踐活動(dòng)趨向更加系統(tǒng)化和專門化的發(fā)展方向。所謂專門化，便是擁有更加專業(yè)的指導(dǎo)隊(duì)伍，更加專業(yè)的學(xué)生創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)，更好的創(chuàng)業(yè)實(shí)踐環(huán)境以及學(xué)校支撐，將創(chuàng)業(yè)理論體系深入課堂、深入實(shí)踐，使其成為一種專門化的學(xué)校教育體系之一；系統(tǒng)性，對(duì)創(chuàng)業(yè)理論體系、創(chuàng)業(yè)實(shí)踐能力等，要進(jìn)行系統(tǒng)化的劃分，合理的學(xué)習(xí)、落實(shí)和安排，理論與實(shí)際相結(jié)合，高效的系統(tǒng)學(xué)習(xí)，拒絕假大空和表面化。

偶聯(lián)靶向性配體（如核酸適體或抗體）的靶向納米載體可以提高化療藥物的靶向效果。研究顯示，采用生物素-親和素吸附、共價(jià)鏈接和生物素-親和素的連接方式，可以將抗體偶聯(lián)在納米載體上制備成為靶向納米載體，該靶向納米載體能顯示出對(duì)腫瘤細(xì)胞很強(qiáng)的靶向性和內(nèi)吞活性。盡管抗體廣泛應(yīng)用于靶向納米載體，但它們面臨分子量大、免疫原性強(qiáng)等缺點(diǎn)。核酸適體指的是經(jīng)體外篩選技術(shù)SELEX（指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化）篩選出的、能特異結(jié)合蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)的寡聚核苷酸片段，具有低免疫原性、低分子量和易于生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。研究證實(shí)，核酸適體A15 可以靶向CD133細(xì)胞，納米載體通過(guò)A15核酸適體導(dǎo)向性，可以靶向和殺傷CD133細(xì)胞。鑒于CD133是肺癌干細(xì)胞的標(biāo)記物，因此，核酸適體A15預(yù)期可將藥物有效地遞送至CD133肺癌干細(xì)胞。

納米載體是一種納米級(jí)別的藥物遞送載體，能改善藥物的溶解度和降低藥物毒性。紫杉醇是一種常用的化療藥物，溶解度不好，可以通過(guò)納米載體顯著提高紫杉醇的溶解度。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）是由兩種單體—乳酸和羥基乙酸隨機(jī)聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，具有良好的生物相容性、無(wú)毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域。PLGA納米載體因其良好的人體安全性而被廣泛應(yīng)用。另外，PLGA納米載體通過(guò)聚乙二醇（PEG）修飾后，其體內(nèi)循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)腫瘤的被動(dòng)靶向性顯著提高。目前尚無(wú)研究構(gòu)建CD133 靶向性的紫杉醇納米載體實(shí)現(xiàn)對(duì)CSCs 的靶向性清除。本研究擬構(gòu)建載紫杉醇的PLGA-PEG納米載體，該納米載體與CD133核酸適體偶聯(lián)后制備成為靶向納米載體（N-Pac-CD133），預(yù)期可以高效靶向清除CD133肺癌干細(xì)胞。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 聚（丙交酯-共乙交酯）-b-聚（乙二醇）-COOH端（～17000，3400）（PLGA-PEG-COOH）（Polyscience）。藻紅蛋白標(biāo)記的CD133 抗體和CD133 微珠試劑盒（Miltenyi Biotec）。紫杉醇（大連美侖生物科技有限公司）。A15 核酸適體（序列為5'-SH-CCCUCCUAAGG G-3'）（廣州瑞博股份有限公司）。N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-乙基-3-3-二甲氨基丙基碳二亞胺（EDC）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、1-乙基-3-3-二甲氨基丙基碳二亞胺（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、紫杉醇和香豆素6（Sigma-Aldrich）。StemPro?Accutase?細(xì)胞分離試劑、逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒、TRIzol?試劑、B27和胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒（ITS）（賽默飛世爾科技有限公司）。所有有機(jī)試劑（分析級(jí)）均由國(guó)藥集團(tuán)（中國(guó)上海）提供。

1.2 方法

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)納米載體的體外細(xì)胞攝取 將肺癌細(xì)胞（5×10/孔）接種于12孔板中過(guò)夜。然后將細(xì)胞與6-香豆素，C6-N-Pac或C6-N-CD133（香豆素-6濃度：0.5 μg/mL）孵育4 h。最后，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。

唯識(shí)學(xué)既是世間現(xiàn)象的深刻說(shuō)明，也是唯識(shí)宗道行學(xué)的理論支撐,世間現(xiàn)象既然是“唯識(shí)無(wú)境”，唯識(shí)學(xué)認(rèn)為成就佛的智慧根本在于轉(zhuǎn)“識(shí)”，轉(zhuǎn)識(shí)成智是通達(dá)佛智的最根本法門。中國(guó)書法是一門高度抽象的藝術(shù)，充滿深刻的東方哲學(xué)思想。無(wú)論書法審美鑒賞還是創(chuàng)作，語(yǔ)言難以直接表達(dá)書法的玄妙，需要妙悟通達(dá)心靈的直覺體驗(yàn)?！稗D(zhuǎn)識(shí)成智”和書法審美直覺或妙悟二者目標(biāo)歸趣之間存在差異，以唯識(shí)觀統(tǒng)攝書法、以無(wú)漏智的心清凈種子借助書法弘揚(yáng)佛理，二者才有可能存在一定相融和性。

應(yīng)當(dāng)看到，高校教材編寫對(duì)推動(dòng)科研發(fā)展也起著重要的作用，因?yàn)樗鼘W(xué)科發(fā)展的寶貴史料、思想與理論精萃、最新科研成果不斷選編、整合為學(xué)科的概念與原理的知識(shí)體系，還力求反映學(xué)科的前沿?zé)狳c(diǎn)與動(dòng)態(tài)。這將為相關(guān)科學(xué)研究起著整理資源、提高基礎(chǔ)、繼往開來(lái)的鋪墊作用，尤其有助于激發(fā)和培養(yǎng)學(xué)生的科研興趣與創(chuàng)新能力，以至直接影響他們參與科學(xué)研究。因此，我們要高度評(píng)價(jià)編好教材的重大意義。在教材編寫的過(guò)程中，我們也深深感到教材編寫是一個(gè)在正確思想指導(dǎo)下廣泛學(xué)習(xí)，不斷深入研究，反復(fù)修改與提高的過(guò)程。

1.2.2 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）采用RT-PCR 檢測(cè)肺癌細(xì)胞中CSCs相關(guān)基因的表達(dá)。在用TRIzol?試劑提取腫瘤細(xì)胞RNA后，用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒反轉(zhuǎn)錄第一條鏈互補(bǔ)DNA，最后用A Roche Light Cycler 進(jìn)行了RT-PCR，用2的方法檢測(cè)mRNA表達(dá)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析CD133表達(dá) 收集的細(xì)胞與PECD133抗體（1 μg/mL）在4 ℃下孵育30 min，并使用流式細(xì)胞術(shù)（Becton Dickinson，加利福尼亞州圣何塞）分析細(xì)胞的CD133表達(dá)。

1.2.4 磁細(xì)胞分選 用CD133微珠試劑盒從肺癌細(xì)胞中分離出CD133細(xì)胞。簡(jiǎn)要地說(shuō)，將CD133微球添加到收集的細(xì)胞中，將CD133 微球與細(xì)胞在4 ℃混合15 min 后丟棄未結(jié)合的微球。然后用50 μL PBE（含5 mmol/L EDTA 和0.5%BSA 的PBS）重新懸浮顆粒，并使用磁分離柱分離，洗滌后收集CD133細(xì)胞。最后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的CD133表達(dá)。

1.2.7 納米載體的表征 使用Zetasizer Nano S（英國(guó)馬爾文儀器公司）分析納米載體的尺寸、尺寸分布和zeta電位。使用日立H-600透射電子顯微鏡（TEM，200 kV加速電壓）檢測(cè)納米載體的形態(tài)。納米載體的紫杉醇包封率和載藥量測(cè)定如下：將1毫升的納米載體真空干燥后，然后加入0.2 mL的混合溶液（二甲基亞砜：二甲基亞砜（v/v=3∶1））溶解，超聲5 min再加入0.5 mL的甲醇提取紫杉醇，超聲5 min，15 000 r/min離心5 min后取上清收集于5 mL 容量瓶，然后再利用高效液相色譜（HPLC）來(lái)測(cè)定紫杉醇的含量，方法如下：將納米載體真空干燥后，將1 mL納米載體溶液完全溶解在1mL甲醇中，用于配備反相C-18 柱（Diamonsil，5 μm，250 mm×4.5 mm）的HPLC（L-2000，日本日立）分析。色譜條件：色譜柱：C18 反相色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈：水=50∶50（v/v）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.6 N-Pac-CD133 的制備和表征 N-Pac-CD133 是通過(guò)如下方法制備。首先，利用乳液/溶劑蒸發(fā)方法制備N-Pac。將PLGA-PEG-COOH（30 mg）和紫杉醇（5 mg）溶解在二氯甲烷（2 mL）中以形成藥物溶液，將其加入膽酸鈉水溶液（1%，4 mL）中。使用探針超聲儀（45 s，150 W）進(jìn)行超聲處理后，將形成的乳液加入膽酸鈉溶液（0.5%，20 mL）中。蒸發(fā)后，從乳液中除去二氯甲烷。通過(guò)去離子水中超濾除去未包封的紫杉醇。按照上述方法制備空白納米載體。如上所述添加0.1%（w/w）香豆素-6制備負(fù)載香豆素-6的納米載體。接下來(lái)，N-Pac-CD133 通過(guò)CD133 核酸適體和N-Pac 化學(xué)偶聯(lián)形成的。首先，用50 mmol/L NHS和100 mmol/L EDC對(duì)N-Pac（2.5 mg/mL）進(jìn)行活化60 min，將洗滌后的N-Pac與CD133適體（1 mL，0.05 mg/mL）孵育6 h以產(chǎn)生N-Pac-CD133，4 ℃儲(chǔ)存。

1.2.5 腫瘤球形成率試驗(yàn) 腫瘤球形成率計(jì)算方法如前所示。肺癌細(xì)胞以3000/孔的密度在超低粘附性6孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，將細(xì)胞懸浮在由DMEM/F12，1×B27，1×ITS，20 ng/mL EGF和20 ng/mL bFGF組成的干細(xì)胞培養(yǎng)基中，7 d后計(jì)數(shù)對(duì)形成腫瘤球數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。腫瘤球形成率=實(shí)驗(yàn)組腫瘤球形成個(gè)數(shù)/對(duì)照組腫瘤球形成個(gè)數(shù)。

1.2.8 納米載體的紫杉醇體外釋放 在磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）或含有10%人血漿的PBS中檢測(cè)納米載體的紫杉醇體外釋放。簡(jiǎn)要地說(shuō)，向Spectrum/Por?透析膜（MWCO 1000）中添加5 mL納米載體溶液，將透析膜加入到含有100 mL的PBS（添加0.1%Tween-20）的燒杯中，在37 ℃（100 r/min）的溫和攪拌下在水浴中培養(yǎng)。在不同的時(shí)間點(diǎn)吸取1 mL的透析液通過(guò)HPLC測(cè)量紫杉醇含量。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和HCC827由中科院上海細(xì)胞所提供。細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基（添加10%胎牛血清，0.1 mmol/L MEM非必需氨基酸的L-谷氨酰胺）中培養(yǎng)，細(xì)胞在含95%空氣/5%CO的37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)按照如下步驟進(jìn)行。在第0天時(shí)，在BALB/c裸鼠（雄性，4～6周，～20 g）皮下注射5×10A549細(xì)胞，接種后第10天腫瘤體積達(dá)到50 mm。小鼠尾靜脈注射各種納米載體和游離紫杉醇（按照5 mg/kg紫杉醇的濃度），分別于第10、15和20天進(jìn)行注射。腫瘤體積按公式：腫瘤體積=（寬×長(zhǎng)）/2進(jìn)行監(jiān)測(cè)，在第40天時(shí)，處死小鼠后，對(duì)腫瘤進(jìn)行摘除并稱重。同時(shí)測(cè)量小鼠的體質(zhì)量。

1.2.11 用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖試驗(yàn) 用CCK8法檢測(cè)納米載體的細(xì)胞毒性作用。細(xì)胞（1×10/孔）在96孔板中接種過(guò)夜。然后用不同濃度的藥物（0.15～3000 μg/mL）處理細(xì)胞48 h，最后根據(jù)試劑盒的方案檢測(cè)細(xì)胞增殖。

在A549 CD133細(xì)胞中，C6-N-CD133 處理組的平均熒光強(qiáng)度顯著高于C6-N（=0.02）和C6處理組（<0.001，圖3A～C）。在A549 CD133細(xì)胞中，C6-N-CD133和C6-N處理組的平均熒光強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。對(duì)于HCC827細(xì)胞，獲得了類似的結(jié)果（圖3B、C）。接下來(lái)，我們檢測(cè)了肺癌細(xì)胞內(nèi)吞紫杉醇的濃度（圖3D、E）。在A549 CD133細(xì)胞中，N-Pac-CD133治療組的紫杉醇濃度顯著高于N-Pac（=0.01）和紫杉醇治療組（<0.001），而在A549 CD133細(xì)胞中，N-Pac-CD133和N-Pac處理組的紫杉醇濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。在HCC827 細(xì)胞的情況下，獲得了類似的結(jié)果（圖3D）。

(2)智慧城市發(fā)展水平對(duì)智慧城市感知質(zhì)量的假設(shè)(H3)、對(duì)智慧城市預(yù)期的假設(shè)(H4)均得到驗(yàn)證，都呈現(xiàn)正相關(guān)且在0.001水平下是顯著的。這說(shuō)明隨著城市基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)、技術(shù)發(fā)展以及人才建設(shè)的不斷完善，提高了智慧城市的建設(shè)發(fā)展水平，使安居、教育、交通等多個(gè)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了智慧化的迅速發(fā)展，增強(qiáng)了市民對(duì)智慧城市的感知質(zhì)量，使市民的滿足需要性預(yù)期得到相應(yīng)的滿足。

最后，從人才培養(yǎng)目標(biāo)來(lái)看，數(shù)學(xué)素養(yǎng)目標(biāo)與學(xué)習(xí)目的缺乏有機(jī)統(tǒng)一。這種認(rèn)識(shí)導(dǎo)致學(xué)生只能掌握一定數(shù)學(xué)知識(shí)來(lái)解決簡(jiǎn)單問(wèn)題，難以對(duì)數(shù)學(xué)有更深體驗(yàn)，也不能把數(shù)學(xué)學(xué)習(xí)與個(gè)人成長(zhǎng)、發(fā)展有機(jī)聯(lián)系起來(lái)，使得數(shù)學(xué)失去了文化蘊(yùn)意，教學(xué)內(nèi)容較為空洞，學(xué)生學(xué)習(xí)時(shí)感到枯燥乏味，難以了解數(shù)學(xué)思想方法和精神。

1.3 體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

1.2.10 HPLC評(píng)價(jià)紫杉醇的體外細(xì)胞攝取 用HPLC測(cè)定細(xì)胞內(nèi)紫杉醇的攝取量方法如下。肺癌細(xì)胞（5×10/孔）在12孔板中接種過(guò)夜。然后用紫杉醇、N-Pac或N-Pac-CD133（20 μg/mL紫杉醇）處理細(xì)胞4 h。然后用PBS洗滌細(xì)胞3次，并通過(guò)添加0.4 mL甲醇收集細(xì)胞。細(xì)胞超聲處理1 min 后，離心細(xì)胞裂解液（10 000×，10 min），收集上清液。HPLC測(cè)定上清液中紫杉醇的含量。用BCA法測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)濃度。細(xì)胞內(nèi)紫杉醇攝取量利用紫杉醇濃度/蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 9統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。兩組之間的直接比較是Student's非配對(duì)檢驗(yàn)進(jìn)行的。用單因素方差分析進(jìn)行3組以上的比較，之后的兩兩檢驗(yàn)采用Dunnett或Newman-Keuls。<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納米載體的表征

所有納米載體都很?。ā?00 nm），多分散性?。≒DI<0.2）。具有高負(fù)zeta電位（約-20 mV），預(yù)示了其在循環(huán)中的高穩(wěn)定性。納米載體的包封率為8%～9%，載藥效率>80%，這些數(shù)據(jù)表明納米載體具有合適的尺寸、zeta電位和載藥能力（表1）。

兩種納米載體均呈球形，分散性良好（圖1A、B）。紫杉醇從N-Pac和N-Pac-CD133中的體外釋放（圖1C、D）。與PBS 相比，兩種納米載體在含有10%人血清（10%Plasma）的PBS中的釋放速度更快（N-Pac 24 h，=0.02；N-Pac-CD133，24 h，=0.002）。納米載體在最初12 h中，可以快速釋放約～50%的紫杉醇。在接下來(lái)的36 h的紫杉醇累積釋放量為80%。因此，兩種納米載體在48 h內(nèi)都顯示出持續(xù)的藥物釋放。

2.2 肺癌細(xì)胞的CD133+細(xì)胞群體表現(xiàn)出肺癌干細(xì)胞的特征

CD133細(xì)胞形成肺癌的體積顯著大于CD133細(xì)胞（圖2A、B）。A549在第30天以后，CD133細(xì)胞的平均腫瘤體積明顯大于CD133細(xì)胞（0.001，圖2A）。在HCC827 細(xì)胞中，獲得了類似的結(jié)果（=0.01，圖2B）。CD133A549 細(xì)胞比CD133A549 細(xì)胞生成更多的第一代（<0.001，圖2C、D）和第二代腫瘤球（<0.001，圖2C）。HCC827細(xì)胞獲得了類似的結(jié)果（圖2D）。接下來(lái)，我們檢測(cè)在A549和HCC827的CSCs基因表達(dá)。與A549 CD133細(xì)胞相比，A549 CD133細(xì)胞中OV6（<0.001）、CD133（=0.001）、OCT3/4（=0.002）、EpCAM（=0.04）、NANOG（=0.005）和CD44（=0.02）的mRNA 水平也顯著高于A549CD133細(xì)胞（圖2E）。對(duì)于HCC827 細(xì)胞，也獲得了類似的結(jié)果（圖2F）。CD133肺癌細(xì)胞顯示出肺癌干細(xì)胞的特征。

因此，建議在模擬英國(guó)議會(huì)制辯論教學(xué)過(guò)程中強(qiáng)化中國(guó)學(xué)生對(duì)上述論辯要素敏感性?？吹睫q題，特別是政策性辯題后，辯手們首先要考慮辯題擬解決的主要問(wèn)題并迅速確定己方立場(chǎng)。然后針對(duì)問(wèn)題的起因確定解決方案。在考慮解決方案時(shí)既要想到其優(yōu)勢(shì)，也要考慮其弱勢(shì)。最后考慮論證己方立場(chǎng)的論點(diǎn)，包括己方動(dòng)議的合理性、有效性和后果等等。

2.3 體外靶向性實(shí)驗(yàn)

1.2.12 納米載體對(duì)肺癌細(xì)胞中肺癌干細(xì)胞比例的影響 通過(guò)腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)納米載體對(duì)肺癌細(xì)胞中肺癌干細(xì)胞的影響。簡(jiǎn)言之，肺癌細(xì)胞（5×10/孔）在12 孔板中接種過(guò)夜。然后用納米載體或游離紫杉醇（5 μg/mL紫杉醇）處理細(xì)胞。24 h后棄去藥物，將細(xì)胞與新鮮培養(yǎng)基孵育72 h。然后，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化后加入到超低吸附板中進(jìn)行腫瘤球培養(yǎng)。腫瘤球形成率計(jì)算公式：實(shí)驗(yàn)組腫瘤球形成個(gè)數(shù)/對(duì)照組腫瘤形成個(gè)數(shù)。

2.4 CCK-8細(xì)胞毒性分析

N-CD133（偶聯(lián)CD133核酸適體的空PLGA-PEG納米載體）沒(méi)任何的細(xì)胞毒性。相反，紫杉醇、N-Pac和N-Pac-CD133 對(duì)CD133和CD133肺癌細(xì)胞顯示出劑量依賴性細(xì)胞毒性。我們使用半數(shù)抑制濃度（IC）來(lái)定量測(cè)量體外細(xì)胞毒性（表2）。在A549 CD133細(xì)胞中，NPac-CD133 的IC值（7.4 μg/mL）顯著低于N-Pac（35.2 μg/mL）（=0.01）和紫杉醇（74.3 μg/mL）（=0.003）。相反，在A549 CD133細(xì)胞中，N-Pac-CD133 的IC值（14.3 μg/mL）與N-Pac（21.5 μg/mL）相比無(wú)顯著差異（>0.05，圖4）。因此，在A549 CD133細(xì)胞中，N-Pac-CD133的作用是N-Pac的10倍。在HCC827 CD133和CD133細(xì)胞中也獲得了類似的結(jié)果，其中N-Pac-CD133在HCC827 CD133細(xì)胞中的效果分別是N-Pac的8倍。

1.2.13 體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 由海軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）小鼠（20 g，6～8周）在無(wú)特定病原體（SPF）條件下繁殖。所有程序均獲海軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照海軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的指導(dǎo)方針執(zhí)行。如下所述，在SCID小鼠中進(jìn)行體內(nèi)致瘤性試驗(yàn)，將肺癌細(xì)胞（2×10）與BD-Matrigel混合?，并將其植入SCID 小鼠皮下。將CD133和CD133肺癌細(xì)胞接種于同一小鼠的兩側(cè)。接種后監(jiān)測(cè)腫瘤形成。腫瘤體積=（寬度×長(zhǎng)度）/2。

2.5 納米載體對(duì)肺癌細(xì)胞中比例的影響

我們利用通過(guò)腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證納米載體對(duì)肺癌干細(xì)胞影響（圖5）。在A549 細(xì)胞中，紫杉醇（=0.01）治療顯著增加了腫瘤球形成率（圖5A、C）。值得注意的是，與未經(jīng)治療的對(duì)照組相比，N-Pac-CD133治療后，A549腫瘤球數(shù)量減少1倍。在A549細(xì)胞中，NPac-CD133治療后腫瘤球的數(shù)量小于紫杉醇（<0.001）和N-Pac（<0.001）。類似地，與未經(jīng)治療的對(duì)照組相比，N-Pac-CD133 誘導(dǎo)HCC827 腫瘤球數(shù)量減少1 倍（圖5B、C）。N-Pac-CD133治療后腫瘤球的數(shù)量較紫杉醇數(shù)量顯著減少（<0.001）。

2.6 納米載體的體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)

圖6顯示納米載體的體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)。生理鹽水和N-CD133無(wú)任何抗腫瘤活性，生理鹽水和N-CD133治療組的腫瘤積極進(jìn)展迅速（圖6A）。而紫杉醇、N-Pac和N-Pac-CD133 則表現(xiàn)出不同程度的抗腫瘤活性。NPac-CD133導(dǎo)致腫瘤體積減少92%，達(dá)到最佳的治療效果。N-Pac 和紫杉醇分別達(dá)到中等（腫瘤體積減少72%）和輕微（腫瘤體積減少33%）的治療效果。在治療終點(diǎn)時(shí)，我們?nèi)⌒∈竽[瘤并對(duì)腫瘤體質(zhì)量進(jìn)行稱量，NPac-CD133治療組和其他治療組相比，腫瘤體質(zhì)量顯著減?。?0.001，圖6B）。我們同時(shí)稱量了小鼠的體質(zhì)量，所有處理組小鼠的體質(zhì)量均逐漸增加，相反，紫杉醇治療組的體質(zhì)量逐漸下降（圖6C）。

3 討論

本研究利用CD133 核酸適體和CD133 的相互作用，制備了靶向CD133 的紫杉醇納米載體N-Pac-CD133，證實(shí)N-Pac-CD133具有消除CD133肺癌干細(xì)胞的潛力。

紫杉醇是治療肺癌的有效藥物。單純紫杉醇治療會(huì)增加肺癌干細(xì)胞的比例。在本文中，與之前的研究一致，紫杉醇在CD133肺癌干細(xì)胞中治療效果并不好，增加了腫瘤球的形成和CD133肺癌干細(xì)胞的比例，表明肺癌干細(xì)胞對(duì)紫杉醇具有耐藥性。我們的研究證實(shí)：N-Pac-CD133 對(duì)CD133肺癌細(xì)胞的毒性比對(duì)CD133肺癌細(xì)胞的毒性大得多，表明N-Pac-CD133實(shí)現(xiàn)了對(duì)肺癌干細(xì)胞的靶向性遞藥，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了紫杉醇對(duì)肺癌干細(xì)胞的靶向性清除。我們?cè)谇捌诘难芯匡@示，納米載體是一種有望靶向清除CSCs的手段，由于納米載體具有改善藥物的性質(zhì)、靶向遞送和克服CSCs外排泵的特點(diǎn)。

“上海市腦卒中預(yù)防與救治服務(wù)體系”建設(shè)在推進(jìn)過(guò)程中，也遇到了很多問(wèn)題。馬昕說(shuō)，比如存在醫(yī)療機(jī)構(gòu)之間發(fā)展水平和救治能力的差距、市中心和遠(yuǎn)郊的區(qū)域醫(yī)療資源配備不均衡等問(wèn)題。他表示，對(duì)于這些問(wèn)題，將在體系后期建設(shè)中研究解決。

盡管紫杉醇對(duì)肺癌具有很強(qiáng)的活性，但其在水中的溶解度很低。納米載體有望改善化療藥物的水溶性。Abraxane就是一個(gè)例子，它可以顯著增加癌癥中的藥物濃度。我們的研究使用由美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的商用聚乳酸聚合物制成的納米載體作為藥物遞送系統(tǒng)，以增加紫杉醇的溶解度及其對(duì)肺癌干細(xì)胞的靶向性。此外，CD133核酸適體在保證NPac-CD133對(duì)CD133肺癌細(xì)胞的靶向性方面起著關(guān)鍵作用。首先，我們使用流式細(xì)胞術(shù)和HPLC證明N-Pac-CD133能夠有效結(jié)合CD133肺癌干細(xì)胞。在細(xì)胞結(jié)合后，與非靶向N-Pac和紫杉醇相比，N-Pac-CD133在CD133肺癌細(xì)胞中具有增強(qiáng)的細(xì)胞毒性，但在CD133肺癌細(xì)胞中沒(méi)有。我們觀察到，與N-Pac和紫杉醇相比，N-Pac-CD133 能更有效地減少腫瘤球數(shù)量和CD133肺癌干細(xì)胞的百分比，這表明N-Pac-CD133能更好地消除CD133肺癌干細(xì)胞。我們的結(jié)果和前期結(jié)果一致：靶向CSCs的納米載體能顯著減少腫瘤干細(xì)胞的數(shù)量。相反，N-Pac和紫杉醇增加了腫瘤球的數(shù)量和CD133肺癌干細(xì)胞的百分比。綜上所述，數(shù)據(jù)表明N-Pac-CD133 對(duì)CD133肺癌細(xì)胞的選擇性毒性。據(jù)我們所知，這是我們首次利用CD133靶向納米載體實(shí)現(xiàn)對(duì)紫杉醇靶向遞送，實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌干細(xì)胞的靶向殺傷。

民辦非營(yíng)利性醫(yī)療機(jī)構(gòu)聘用的會(huì)計(jì)人員由機(jī)構(gòu)自主設(shè)定門檻，大部分財(cái)務(wù)人員業(yè)務(wù)能力低，不具備上崗資格，財(cái)務(wù)處理不規(guī)范，專業(yè)培訓(xùn)缺乏業(yè)務(wù)主管部門和財(cái)政部門的重視和支持，影響了醫(yī)療改革政策研究的分析與決策依賴的數(shù)據(jù)信息質(zhì)量。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，N-Pac-CD133對(duì)小鼠腫瘤的抑制效果最好，腫瘤體積抑制率達(dá)到了92%，顯著強(qiáng)于NPac和紫杉醇的腫瘤抑制效果。在治療終點(diǎn)時(shí)，我們?nèi)⌒∈竽[瘤并對(duì)腫瘤體質(zhì)量進(jìn)行稱量，N-Pac-CD133治療組和其他治療組相比，腫瘤體質(zhì)量顯著減小。小鼠的體內(nèi)數(shù)據(jù)顯示：紫杉醇治療后對(duì)小鼠毒性較大，而紫杉醇納米載體組能顯著減小對(duì)小鼠的體內(nèi)毒性，我們的結(jié)果和別人取得的結(jié)果一致。

本研究利用納米載體實(shí)現(xiàn)了對(duì)肺癌干細(xì)胞的靶向遞送藥物，CD133是靶向肺癌干細(xì)胞特異性輸送的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)。N-Pac-CD133能有效地將紫杉醇傳遞給CD133肺癌干細(xì)胞，并對(duì)CD133肺癌干細(xì)胞產(chǎn)生特異性毒性。N-Pac-CD133提供了靶向肺癌干細(xì)胞的一種有希望的治療方法。