多囊卵巢綜合征（PCOS）是女性最常見的婦科內(nèi)分泌疾病，伴有生殖功能障礙和代謝異常，影響患者一生的健康及生命質(zhì)量。如今，PCOS已被視為生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域不可忽視的重大疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采用激素替代、促排卵聯(lián)合輔助生殖技術(shù)進行治療，但存在妊娠率低、副作用大的風(fēng)險。近年來，中醫(yī)從宏觀辨證入手，采用辨證與辨病相結(jié)合的方法進行治療，取得了一定的療效，展示了中醫(yī)藥治療PCOS的優(yōu)勢。

補腎化痰方是江蘇省中醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科臨床常用經(jīng)驗方。前期研究表明，補腎化痰方能夠改善胰島素抵抗，可能與胰島素信號傳導(dǎo)分子蛋白表達的調(diào)控有關(guān)。而胰島素抵抗是PCOS 的關(guān)鍵發(fā)病機制之一。Zhou等進行了一項用于識別多囊卵巢綜合征臨床紊亂的非侵入性尿代謝組學(xué)研究，表明尿液中小分子代謝物的差異可能反映了多囊卵巢綜合征的潛在發(fā)病機制，其中PCOS患者的甲基丙二酸水平明顯高于健康受試者，維生素B12缺乏引起的甲基丙二酸升高可能與多囊卵巢綜合征患者的胰島素抵抗有關(guān)。Zhang等采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）血清代謝組學(xué)方法，探討PCOS患者高雄激素血癥和胰島素抵抗患者的代謝紊亂途徑，也發(fā)現(xiàn)了差異代謝物能反映PCOS 的潛在機制，并可作為HA與IR互補診斷的生物標(biāo)志物。這都提高了對多囊卵巢綜合征潛在作用機制的認識。但目前為止，對其作用機制難以提供較為科學(xué)、全面、有效的闡釋。本課題組基于多年的臨床及基礎(chǔ)研究，利用與中醫(yī)藥學(xué)整體觀和辨證論治理論體系相契合的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)，結(jié)合動物實驗，探究并驗證補腎化痰方治療多囊卵巢綜合征的潛在活性成分、作用靶點、信號通路等相關(guān)機制，以期為進一步的臨床運用和實驗研究提供客觀科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，小測驗不僅可以作為PBL課堂的一種可以接受的考察形式，而且還可以作為一種提高學(xué)生學(xué)習(xí)動力、學(xué)習(xí)成績和提高課堂表現(xiàn)的一種簡單方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雌性C57BL/6J小鼠24只，3周齡，體質(zhì)量15～20 g。實驗動物由南京中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供，本實驗經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動物護理和使用委員會批準（倫理號：012071002387）。

1.1.2 藥物 補腎化痰方顆粒劑（仙靈脾10 g、仙茅10 g、蒼術(shù)10 g、半夏6 g、陳皮6 g、九節(jié)菖蒲10 g、香附10 g、川芎6 g、澤瀉10 g、鹿角霜10 g、膽南星6 g、砂仁3 g、炒白術(shù)6 g、淮山藥6 g）由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供。

研究結(jié)果表明，將本實驗粗提到的線粒體用緩沖液懸浮，加入到鋪設(shè)好蔗糖密度梯度的超速水平離心管中，經(jīng)超速水平離心后出現(xiàn)分層。處理1中分層不明顯(圖1)，且重復(fù)性不高，3管均出現(xiàn)不同情況的分層，線粒體層聚集不明顯，無法準確吸取線粒體層。處理2分層效果明顯(圖2)，且3管分層均相同，可以看到明顯的線粒體層，有利于線粒體的收集。實驗結(jié)果說明處理2中改進的蔗糖密度梯度效果最佳。

根據(jù)KEGG通路分析結(jié)果，選取前20位，分別建立通路與對應(yīng)靶點之間的相互作用關(guān)系和節(jié)點屬性與對應(yīng)靶點之間的相互作用關(guān)系，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中，對“通路-靶點”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進行可視化分析，構(gòu)建補腎化痰方治療多囊卵巢綜合征的“通路-靶點”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（圖6）。

酶標(biāo)儀（Rayto），臺式高速冷凍離心機（DRAGONLAB），渦旋混合器、磁力攪拌器（Servicebio），超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物）。

1.2 方法

1.2.1 補腎化痰方活性成分的收集與篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https：//tcmspe.com/）檢索，并查閱已發(fā)表的相關(guān)文獻以補充，收集補腎化痰方（仙靈脾，仙茅，蒼術(shù)，半夏，陳皮，九節(jié)菖蒲，香附，川芎，澤瀉，鹿角霜，膽南星，砂仁，炒白術(shù)，淮山藥）的主要活性成分，以藥物成分口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為條件作進一步篩選。將最終得到的活性成分導(dǎo)入化學(xué)信息數(shù)據(jù)庫Pubchem，檢索各個活性成分的規(guī)范SMILES 結(jié)構(gòu)和化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

1.2.6 KEGG“通路-靶點”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 根據(jù)KEGG通路分析結(jié)果，選取前20位，分別建立通路與對應(yīng)靶點之間的相互作用關(guān)系和節(jié)點屬性與對應(yīng)靶點之間的相互作用關(guān)系，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建補腎化痰方治療多囊卵巢綜合征的“通路-靶點”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.3 PCOS 靶點的預(yù)測 以GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/），OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）為平臺，“Polycystic Ovary Syndrome”為關(guān)鍵詞進行搜索，取交集并刪除重復(fù)靶點，獲取PCOS靶標(biāo)，運用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫對疾病靶點和藥物靶點進行官方校正。通過Draw Venn Diagram網(wǎng)站在線分析，繪制藥物-疾病靶點的韋恩圖（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），獲得其交集靶點。

本校為化工原理認識實習(xí)提供了充足的資金支持，由化工原理教研室聯(lián)系實習(xí)場所，近幾年來，先后聯(lián)系了青島市內(nèi)的化工廠(現(xiàn)已遷至董家口)、青島雙桃精細化工(集團)有限公司(現(xiàn)已遷至平度市)、青島石油化工廠、青島污水處理廠(勝利橋)、青島市中等職業(yè)技術(shù)學(xué)校和校內(nèi)仿真實習(xí)機房等場所.認識實習(xí)的學(xué)時非常短，只有一周時間，如何在短暫的時間內(nèi)完成所有的實習(xí)任務(wù)，并確保認識實習(xí)的質(zhì)量，這是認識實習(xí)面臨的主要問題；同時，在工廠實習(xí)首先必須滿足企業(yè)安全生產(chǎn)的要求，并且保證學(xué)生的安全.

1.2.4 補腎化痰方治療PCOS的PPI網(wǎng)絡(luò)分析及核心靶點篩選 利用STRING（http：//www.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，以“Multiple proteins”為數(shù)據(jù)分析模式、“Homo Sapiens”為物種限定、Required Confidence（combined score）>0.9為閾值，對交集靶點進行相互作用關(guān)系分析。后導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 并利用CytoNCA插件，以Degree值大小對各靶點進行排序，取排名前十的靶點為核心靶點。

1.2.5 GO 富集與KEGG 通路分析 通過DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）網(wǎng)站，借助“Functional Annotation Tool”對交集靶點進行GO富集分析，包括生物過程、細胞成分和分子功能3 個模塊的分析，以<0.05和FDR<0.05為標(biāo)準篩選，根據(jù)涉及靶點數(shù)目排序，選取前30位；同時對交集靶點進行KEGG通路分析，以<0.01為篩選標(biāo)準，根據(jù)值大小排序，選取前20位。

為了量化噴施過程中的霧滴飄移情況，將輔助氣流出口下風(fēng)向5m處的位置定義為飄失邊界，霧滴運動至到噴頭下方0.5m以下認為其沉積到標(biāo)靶或地面上(如圖1所示)；把通過該邊界的霧滴質(zhì)量設(shè)定為飄移量，飄移量與噴施的藥液量的比值定義為飄移率。最終，把霧滴飄移率作為霧滴飄移的評價指標(biāo)，具體公式為

因此，敗血型大腸桿菌病的出現(xiàn)，主要是對羊的血液與組織系統(tǒng)造成破壞，要抓緊時間進行治療，并通過注射藥物提高藥物的擴散速度，如此治療該病的見效速度才能加快。保障羔羊的健康成長。

1.2.2 補腎化痰方潛在靶點的預(yù)測 將獲得的各個活性成分結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入到Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，預(yù)測其相關(guān)作用靶點，再根據(jù)相關(guān)性的高低選取潛在作用靶點。

1.2.7 分子對接驗證 選取成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中核心活性成分Degree值排名前3的β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素與CytoNCA 篩選出來的核心靶點PIK3CA、PIK3R1、APP、AKT1、MAPK1進行分子對接。在PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載核心活性成分的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)合PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）中核心靶點的蛋白結(jié)構(gòu)，運用AutoDock Vina對核心活性成分與核心靶點進行分子對接驗證，并利用Pymol對部分結(jié)果進行可視化。

1.2.8 動物實驗驗證 24只SPF級雌性C57BL/6J小鼠按隨機數(shù)字表法分為3組：對照組、模型組、治療組，每組8只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，利用來曲唑誘導(dǎo)PCOS小鼠模型。對照組：以1mg/（kg·d）生理鹽水灌服35 d；模型組：來曲唑1 mg/（kg·d）溶于1%羧甲基纖維素（CMC）中，連續(xù)灌服35 d，并予高脂飼料喂養(yǎng)；治療組：造模結(jié)束后，補腎化痰方顆粒劑以1 mg/（kg·d）溶于5%生理鹽水中，連續(xù)灌服35 d。小鼠末次給藥后，取卵巢組織于-80 ℃保存，以便后續(xù)實驗進行。

1.2.9 Western blot 檢測PI3K、AKT、MAPK1 蛋白表達 取各組小鼠卵巢組織，使用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)模、封閉后，加入一抗4 ℃孵育搖床過夜，TBST洗滌3次，室溫孵育二抗30 min，TBST洗滌3次，曝光，顯色。

1.2.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用檢驗。<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補腎化痰方活性成分

通過DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）網(wǎng)站，借助“Functional Annotation Tool”對434個共同靶基因進行KEGG富集分析，得141條信號通路，設(shè)置<0.01為篩選標(biāo)準，根據(jù)值大小進行排序，選取前20位為主要信號通路如癌癥通路、HIF-1信號通路、Rap1信號通路、PI3K-Akt信號通路、雌激素信號通路等（表4）。借助微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）在線網(wǎng)站作KEGG通路富集氣泡圖（圖5）。

利用Genecards 數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫，以“Polycystic Ovary Syndrome”為關(guān)鍵詞進行搜索，合并所得疾病靶點，去重，最終得到4759個疾病靶點。將990 個藥物靶點和4759 個疾病靶點通過Draw Venn Diagram網(wǎng)站在線分析，獲得434個交集靶點，繪制韋恩圖（圖1）。

2.2 補腎化痰方成分靶點預(yù)測結(jié)果

將上述所得125個有效活性成分，依次輸入Swiss Target Prediction 網(wǎng)站，得到每個成分相對應(yīng)的藥物靶點，以Probability>0為條件進行篩選，導(dǎo)出數(shù)據(jù)并去重，最終得到990個補腎化痰方成分靶點。

2.3 多囊卵巢綜合征靶點預(yù)測結(jié)果

根據(jù)德國聯(lián)邦統(tǒng)計局的數(shù)據(jù)，2000—2014年，德國生活垃圾年產(chǎn)生量為5.0×107t左右，整體變化不大，2002年達到高峰值5.277 2×107t。2014年德國生活垃圾產(chǎn)生總量為5.110 2×107t，人均生活垃圾產(chǎn)生量約633 kg/（a·人），即1.73 kg/（d·人），其中剩余垃圾量為0.48 kg/（d·人）。

2.4 補腎化痰方治療PCOS的核心靶點篩選

利用STRING（http：//www.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，以“Multiple proteins”為數(shù)據(jù)分析模式、“Homo Sapiens”為物種限定、Required Confidence（combined score）>0.9為閾值，對交集靶蛋白進行相互作用關(guān)系分析，后導(dǎo)入Cytoscape3.7.2并利用其中CytoNCA插件分析交集網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點的屬性值，計算Degree值的二倍中位數(shù)，篩選出大于其值的靶點，構(gòu)建核心靶點的篩選策略圖（圖2）。篩選結(jié)果從大到小依次排序，取排名前10的靶點為核心靶點，分別為PIK3CA、PIK3R1、APP、KNG1、SRC、AKT1、TP53、MAPK1、MAPK3、BDKRB2（圖3、表2）。節(jié)點分別代表潛在作用靶點，節(jié)點大小與顏色代表靶點的度值，節(jié)點越大、顏色越深，表明靶點在網(wǎng)絡(luò)體系中的度值越大；節(jié)點間連線表示靶點間存在潛在的相互作用關(guān)系。

2.5 GO功能富集分析

通過DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）網(wǎng)站，借助“Functional Annotation Tool”對434 個交集靶點進行GO富集分析，包括生物過程、細胞成分和分子功能等3個模塊的分析，以<0.05和FDR<0.05為標(biāo)準篩選，根據(jù)涉及靶點數(shù)目排序，選取前30個GO條目：其中BP相關(guān)條目8個，CC相關(guān)條目14個，MF相關(guān)條目8個，結(jié)果顯示補腎化痰方治療多囊卵巢綜合征主要靶點的生物過程主要富集在藥物反應(yīng)、凋亡過程的負調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化、細胞增殖的正調(diào)控、氧化還原過程等；細胞組成主要富集在細胞質(zhì)、細胞膜、胞質(zhì)溶膠、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等；分子功能主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、酶結(jié)合、鋅離子結(jié)合等（表3），并借助微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）在線網(wǎng)站作GO富集BP CC MF三合一圖（圖4）。

2.6 KEGG通路富集分析

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索，并查閱已發(fā)表的相關(guān)文獻進行補充，以藥物成分口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為條件進一步篩選得到補腎化痰方中14味中藥包含125個有效活性成分，其中通過查閱文獻所得的九節(jié)菖蒲主要活性成分為Palmitic acid、Ferulic acid、Adenosine 等；鹿角霜主要活性成分為gamma-Aminobutyric acid、Glutamic acid等；膽南星主要活性成分為Apigenin、Schaftoside、Cholesterol等，其余部分篩選結(jié)果如下（表1）。

2.7 KEGG“通路-靶點”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

1.1.3 試劑與儀器 來曲唑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），BCA 蛋白定量檢測試劑盒、RIPA 裂解液、5×蛋白還原型上樣緩沖液、磷酸化蛋白酶抑制劑、β-actin、GAPDH、Histone H3、HRP標(biāo)記山羊抗兔、HRP標(biāo)記驢抗山羊、HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠、HRP 標(biāo)記山羊抗大鼠（Servicebio），高脂飼料（金益柏生物科技有限公司）。

2.8 分子對接驗證

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析結(jié)果選取核心活性成分Degree 值排名前3 的β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素與CytoNCA 篩選出來的核心靶點PIK3CA、PIK3R1、APP、AKT1、MAPK1分別進行分子對接。一般認為結(jié)合能<-4.25 kcal/mol表示配體小分子與受體蛋白之間有一定的結(jié)合活性；結(jié)合能<-5.0 kcal/mol表明二者之間有較好的結(jié)合活性；結(jié)合能<-7.0 kcal/mol表明配體與受體具有強烈的結(jié)合活性。分子對接結(jié)果（表5）可見核心活性成分β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素與核心靶點PIK3CA、PIK3R1、APP、AKT1、MAPK1之間的結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol，說明兩者之間有較好的結(jié)合活性；并且β-谷甾醇與PIK3CA、PIK3R1、APP、AKT1、MAPK1，山奈酚與PIK3CA、APP、MAPK1，槲皮素與PIK3CA、PIK3R1、APP、MAPK1 之間的結(jié)合能均小于-7.0 kcal/mol，說明兩者具有強烈的結(jié)合活性。依據(jù)自由結(jié)合能的大小，選取部分對接結(jié)果進行可視化，利用PyMOL軟件繪圖（圖7）。由圖可見，β-谷甾醇能穩(wěn)定地對接到PIK3CA蛋白結(jié)構(gòu)6GVF的活性口袋中，二者通過氨基酸殘基LYS-271發(fā)生氫鍵作用；山奈酚能穩(wěn)定地對接到AKT1蛋白結(jié)構(gòu)1UNQ的活性口袋中，二者通過氨基酸殘基AGR-48和ASN-54發(fā)生氫鍵作用；槲皮素能穩(wěn)定地對接到MAPK1蛋白結(jié)構(gòu)2Y9Q的活性口袋中，二者通過氨基酸殘基GLU-33和LYS-114發(fā)生氫鍵作用。

2.9 補腎化痰方對PI3K、AKT、MAPK1 蛋白表達的影響

Western blot 檢測PI3K、AKT、MAPK1 蛋白表達，其中，MAPK1編碼ERK1/2。結(jié)果表明，與對照組比較，模型組PI3K 蛋白、AKT蛋白表達升高，ERK1/2蛋白（<0.01）表達降低；與模型組比較，治療組PI3K蛋白（<0.01）、AKT 蛋白（<0.05）表達降低，ERK1/2 蛋白表達升高（圖8）。

3 討論

多囊卵巢綜合征是臨床上常見的婦科內(nèi)分泌疾病，好發(fā)于育齡期女性，以持續(xù)無排卵、卵巢多囊樣變、高雄激素血癥為特征，臨床常表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂、不孕、肥胖、多毛、黑棘皮癥等。痰濕證、血瘀證、濕熱證是PCOS的主要證候，痰、瘀壅滯胞宮表現(xiàn)為閉經(jīng)、不孕、卵巢呈多囊樣改變；化熱則表現(xiàn)出痤瘡、多毛等現(xiàn)象。以此長期不斷積累，則成為多囊卵巢綜合征的發(fā)病重要因素。本課題組基于多年的臨床及基礎(chǔ)研究，采用補腎化痰方以治療多囊卵巢綜合征。補腎化痰方是臨床經(jīng)驗方，由蒼附導(dǎo)痰湯化載而來。方中仙靈脾、仙茅、鹿角霜補腎益氣；蒼術(shù)、炒白術(shù)、半夏、陳皮、九節(jié)菖蒲、澤瀉、膽南星、砂仁健脾化痰，利水滲濕；淮山藥補脾益腎；香附、川芎活血化瘀，調(diào)經(jīng)助孕。全方補腎健脾，化痰逐瘀通經(jīng)，是臨床治療多囊卵巢綜合征的有效方劑。

這些因素在“一腳剎車”時，由于制動協(xié)調(diào)時間短，氣壓或液壓峰值很快作用在制動器上，因而對于左右輪制動力差影響不明顯，而在緩慢制動時，因制動協(xié)調(diào)時間長而對左右制動力差影響較大，所以往往超過規(guī)定數(shù)值。

由圖2可得，S點為原點，坐標(biāo)為(0,0,0)，假設(shè)由S點出發(fā)到F點經(jīng)過L1,L2,,Ln,Li(xi,yi,zi)表示UAV飛行過程中的第i個節(jié)點，因此UAV飛行全過程的路徑可表示為

本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到補腎化痰方中共包含125個有效活性成分，對應(yīng)990個藥物靶點，多囊卵巢綜合征的相關(guān)作用靶點4759個，將藥物靶點和疾病靶點通過Draw Venn Diagram網(wǎng)站在線分析，獲得434個交集靶點。根據(jù)上述所篩選出的結(jié)果，可知β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素可能是補腎化痰方治療多囊卵巢綜合征的核心活性成分。β-谷甾醇是四環(huán)三萜類化合物，有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降糖、降脂、降低雄激素等作用。趙帥等發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可促進顆粒細胞增殖，抑制凋亡，其機制與PI3K/AKT 信號通路有關(guān)。山柰酚是黃酮類化合物，有抗炎、抗氧化、降低血脂、擴張血管、抗腫瘤等作用。有研究發(fā)現(xiàn)卵泡生長發(fā)育異常可能是引起多囊卵巢綜合征無排卵及臨床內(nèi)分泌改變的病理基礎(chǔ)。而山奈酚可以在綿羊次級卵泡的體外培養(yǎng)過程中保持卵泡存活率，增加活性線粒體水平并通過介導(dǎo)PI3K 信號通路促進卵母細胞減數(shù)分裂。槲皮素是黃酮類化合物，有抗炎、抗氧化、控制葡萄糖穩(wěn)態(tài)、抑制胰島素分泌等作用。研究證實槲皮素具有降低卵巢直徑和體質(zhì)量，促進卵泡腺外層和黃體功能恢復(fù)的作用，還可減輕PCOS患者性激素和代謝紊亂的作用。經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓撲屬性分析篩選出MAPK1、AKT1、PIK3CA等核心靶點，推測可能是補腎化痰方治療多囊卵巢綜合征的主要作用靶點。PIK3CA是PI3K家族中唯一存在腫瘤特異性突變的基因。在人體各個組織中均有表達的PIK3CA對PI3K/AKT信號通路有激活作用。MAPK1，MAPK3等屬于MAPK家族，MAPK通路能負反饋調(diào)節(jié)PI3K通路，導(dǎo)致PCOS胰島素抵抗的形成，而胰島素抵抗是PCOS重要發(fā)病機制。GO富集分析顯示補腎化痰方治療多囊卵巢綜合征主要靶點的生物過程主要富集在藥物反應(yīng)、凋亡過程的負調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化、細胞增殖的正調(diào)控、氧化還原過程等；細胞組成主要富集在細胞質(zhì)、細胞膜、胞質(zhì)溶膠、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等；分子功能主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、酶結(jié)合、鋅離子結(jié)合等。KEGG富集分析得141條信號通路，根據(jù)P值大小進行排序，選取前二十位為主要信號通路如癌癥通路、HIF-1信號通路、Rap1信號通路、PI3K-Akt信號通路、雌激素信號通路等。其中，PI3K-Akt信號通路與多囊卵巢綜合征密切相關(guān)。PI3K-Akt 信號通路與胰島素抵抗（IR）、糖尿病和代謝疾病密切相關(guān)。PI3K通路障礙是PCOS引起IR的主要因素，PI3K通過變構(gòu)并激活磷酸酰肌醇的激酶進而激活靶蛋白Akt；活化的胰島素受體β亞基的酪氨酸激酶通過激活胰島素受體底物，進一步激活PI3K 通路，激活后的PI3K 使其下游靶蛋白Akt多個殘基位點發(fā)生磷酸化進而激活A(yù)kt，導(dǎo)致卵泡膜細胞增生、卵泡異常發(fā)育或無排卵等。Qiu等運用六味地黃丸治療PCOS，發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt信號通路可通過上調(diào)CYP19A1，將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，減輕IR和卵巢多囊樣改變，恢復(fù)卵泡的發(fā)育，減少閉鎖卵泡?？梢酝茰y未來將會有更多的PCOS患者受益于PI3K-Akt信號通路的研究。

分子對接結(jié)果顯示核心活性成分β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素均能與核心靶點PIK3CA、PIK3R1、APP、AKT1、MAPK1穩(wěn)定結(jié)合并形成氫鍵，初步揭示了補腎化痰方通過多靶點，多通路治療多囊卵巢綜合征的作用特點，可為后期進一步探究其機制提供依據(jù)。

為進一步驗證補腎化痰方治療多囊卵巢綜合征的作用機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，結(jié)合以上分析最終選取了核心靶點MAPK1和核心通路PI3K-AKT進行動物實驗研究。結(jié)果表明，補腎化痰方能明顯改善多囊卵巢綜合征相關(guān)癥狀，并下調(diào)PI3K，AKT蛋白表達，上調(diào)MAPK1蛋白表達，提示了補腎化痰方可能通過β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素等活性成分作用于MAPK1等關(guān)鍵靶點，并通過介導(dǎo)PI3K-Akt等信號通路發(fā)揮抗炎、改善胰島素抵抗、促進卵泡發(fā)育、調(diào)節(jié)激素水平等藥理作用來治療多囊卵巢綜合征。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)，結(jié)合動物實驗初步驗證了補腎化痰方治療多囊卵巢綜合征的具體作用靶點和通路，表現(xiàn)了中藥、多成分、疾病、多靶點協(xié)同作用的藥理機制，為進一步探究其作用機制提供了一定的參考依據(jù)，為臨床上中藥治療多囊卵巢綜合征的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制提供了重要理論和實驗依據(jù)。