肝細(xì)胞癌（LIHC）是最常見的癌癥之一，每年新增確診病例約60萬人。盡管過去幾十年治療手段一直在發(fā)展，肝癌病人整體的預(yù)后情況仍然較差，5年期存活率仍不足20%。miRNAs是一類小的非編碼RNA分子，是近年來眾多研究領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)，在許多生物學(xué)進(jìn)程中扮演重要角色，包括調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和細(xì)胞死亡等。已有大量的研究顯示miRNAs及其靶標(biāo)基因的表達(dá)失調(diào)，在許多癌癥的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要的功能。近年來，隨著腫瘤相關(guān)的二級數(shù)據(jù)庫的出現(xiàn)和日益完善，使得研究者能夠?qū)μ囟ò┓N中的表達(dá)失調(diào)的miRNA 及其調(diào)控靶標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)的挖掘研究。然而，圍繞肝細(xì)胞癌中生存相關(guān)的促癌miRNA的系統(tǒng)性研究還未見報(bào)道。本項(xiàng)研究旨在鑒定肝細(xì)胞癌中表達(dá)失調(diào)并且與生存相關(guān)的促癌miRNA，鑒定和分析它們的靶標(biāo)基因并構(gòu)建相應(yīng)的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并對關(guān)鍵miRNA-靶基因進(jìn)行驗(yàn)證，以期可以為促癌miRNA在肝癌的發(fā)生和進(jìn)展中的功能和機(jī)制提供新的線索或提示。

1 材料和方法

1.1 促癌miRNA的鑒定

從OncoLnc 數(shù)據(jù)庫中下載肝細(xì)胞癌（Liver hepatocellular carcinoma，LIHC）中的miRNA的數(shù)據(jù)信息（http：//www.oncolnc.org/download/），提取其中生存相關(guān)的miRNA（Raw-value<0.05）形成數(shù)集A；在OncomiR 數(shù)據(jù)庫中選擇 Liver hepatocellular carcinoma，設(shè)置<0.05，提取生存相關(guān)的miRNA形成數(shù)集B（http：//www.oncomir.org/oncomir/search_cancer_surv_miR.html）；數(shù)集A和數(shù)集B取交集，形成數(shù)集C作進(jìn)一步分析；數(shù)集C中的每個(gè)miRNA依次在OncoLnc 中檢測生存曲線（http：//www.oncolnc.org/），在OncomiR 中作表達(dá)分析（http：//www.oncomir.org/oncomir/search_miR_tumor.html），最后我們將在肝細(xì)胞癌中表達(dá)量較癌旁組織升高的，并且高表達(dá)提示預(yù)后更差的miRNA鑒定為LIHC中的促癌miRNA。

1.2 生存相關(guān)靶基因的分析與鑒定

在miRnet 中設(shè)置好選項(xiàng)：Organism，（human）；ID type，miRBase ID；Tissue，Not specified；Targets，genes（miRTarbase v8.0+TarBase v8.0+miRecords）。將促癌miRNA的list直接粘貼到miRnet數(shù)據(jù)庫（https：//www.mirnet.ca/miRNet/upload/MirUploadView.xhtml）中，點(diǎn)擊“Submit”，然后“Proceed”，得到所有預(yù)測的miRNA-靶基因?qū)π畔ⅰ?/p>

將靶基因按200個(gè)一組粘貼到GEPIA2中Survival Map工具中的Gene or Transcript框中；Active Datasets選擇LIHC，點(diǎn)擊“Plot”鍵進(jìn)行批量的生存相關(guān)性分析，結(jié)果中藍(lán)色框表示該基因與生存期相關(guān)，并且高表達(dá)提示更好的預(yù)后（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#survival）；經(jīng)GEPIA2 生存分析篩選得到的靶基因進(jìn)一步利用Ualcan中的“Scan my genes”工具進(jìn)行批量的表達(dá)分析（http：//ualcan.path.uab.edu/analysis.html）；經(jīng)GEPIA2和Ualcan 雙重分析后篩選到的靶基因與其對應(yīng)的miRNA在Starbase數(shù)據(jù)庫中作miRNA-mRNA的共表達(dá)系數(shù)分析（http：//starbase.sysu.edu.cn/panMirCoExp.php），<0.05 被設(shè)定為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義，對應(yīng)的mRNA才被認(rèn)定為對應(yīng)肝細(xì)胞癌中促癌miRNA的生存相關(guān)靶基因。

1.3 miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將鑒定出的促癌miRNA 的生存相關(guān)靶基因和miRNA 一一對應(yīng)形成一個(gè)矩陣文件，將其導(dǎo)入Cytoscape軟件形成可視化相互關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖，再作進(jìn)一步的調(diào)整和處理形成清晰的miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 靶基因富集分析

為了分析生存相關(guān)的靶基因所參與的細(xì)胞內(nèi)信號通路，我們進(jìn)行了富集分析，結(jié)果顯示富集程度最高的為脂肪酸代謝信號通路（圖3A），富集在該通路的基因包括EHHADH，GCDH，ACAT1，ADH1C 和CYP4A11（圖3B）。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵基因鑒定

將鑒定出的生存相關(guān)靶基因列表拷貝到STRING數(shù)據(jù)庫的粘貼框（https：//www.string-db.org/cgi/input？sessionId=bMa3IQdZVRH6&input_page_active_form=multiple_identifiers），點(diǎn)擊“search”，“continue”得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖；下載對應(yīng)的TSV格式文件，將矩陣數(shù)據(jù)信息導(dǎo)入Cytoscape軟件，利用cytohubba插件進(jìn)行關(guān)鍵基因的分析和鑒定。

1.6 關(guān)鍵基因的表達(dá)和生存分析

單個(gè)基因的生存分析在GEPIA2 中完成，在“survival analysis”界面輸入基因名，選擇癌種，點(diǎn)擊“Plot”鍵即可生成生存曲線圖；單基因的表達(dá)分析在Ualcan 中完成，在“Enter gene symbol”框中輸入基因名，選擇癌種（TCGA dataset），點(diǎn)擊“Explore”鍵后在生成的界面點(diǎn)擊“Expression”即可生成表達(dá)的箱線圖。

（2）范圍加載。根據(jù)點(diǎn)位風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)結(jié)果，加載點(diǎn)位風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)結(jié)果，初步劃定風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)單元。按照主導(dǎo)性原則，若每項(xiàng)污染物80%以上的土壤點(diǎn)位分類結(jié)果一致時(shí)，則采用該結(jié)果判定該項(xiàng)污染物所代表的評價(jià)單元類別。

1.7 關(guān)鍵基因與miRNA調(diào)控關(guān)系及細(xì)胞功能驗(yàn)證

稱取一定量的純化后的玫瑰茄花色苷凍干粉，配制成1 g/L的花色苷溶液，用0.2 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制成pH=2.2的花色苷溶液，分裝5個(gè)帶帽試管中，每個(gè)試管中的花色苷溶液體積均為20 mL，其中海藻酸鈉、CMC和β-環(huán)糊精均按濃度比取 1.0%，分別放置在 80 ℃、90 ℃恒溫水浴鍋和100 ℃的恒溫油浴鍋中，避光加熱150 min，每隔30 min測定5組花色苷含量的變化。為避免溶液在加熱過程中水分蒸發(fā)而引起濃度變化，每次取樣后，標(biāo)記好水位線，下次取樣測量前用相同溫度的蒸餾水將花色苷溶液補(bǔ)充至前一次取樣后的水位線。

人肝癌細(xì)胞株HepG2 用RPMI 1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）于恒溫培養(yǎng)箱（5%CO、37 ℃）中培養(yǎng)。hsa-miR-1226-3p，hsa-miR-221-5p 的mimic 和inhibitor，對照的NC，以及熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（p-GCDH-WT和p-GCDH-MUT），過表達(dá)質(zhì)粒pEGFP N1-GCDH均由公司合成而得。Q-PCR、Western blot及Transwell實(shí)驗(yàn)均按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行。熒光素酶活性檢測按試劑盒說明書操作。EHHADH上游引物：TGAGGAAA TGAGCCTGAAGA，下游引物：ATAACAGTGGCAA TGGTAGTG；GCDH 上游引物：GGGTGGACAGTGG CTACAGG，下游引物：TAGGGTGCATGACGAGGG AG；內(nèi)參基因ACTB上游引物：ACTCTTCCAGCCTT CCTTCC，下游引物：TGTTGGCGTACAGGTCTTTG。GCDH抗體（Proteintech，1∶1000），β-Actin抗體（CST，1∶5000）。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌中促癌miRNA及其生存相關(guān)靶基因的鑒定

我們選取了EHHADH，GCDH兩個(gè)關(guān)鍵基因和其對應(yīng)的miRNA進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。Q-PCR結(jié)果顯示，向HepG2 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染hsa-miR-1226-3p 和hsa-miR-221-5p的mimics后，EHHADH和GCDH的表達(dá)量對應(yīng)的發(fā)生顯著下調(diào)（圖6A）。而向HepG2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染hsa-miR-1226-3p 和hsa-miR-221-5p 的inhibitor 后，EHHADH 和GCDH 的表達(dá)量相應(yīng)的上升（圖6B）。CCK8 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染hsa-miR-1226-3p 的mimics 和inhibitor后，細(xì)胞增殖活力的改變并不明顯（圖6C）。而轉(zhuǎn)染hsa-miR-221-5p 的mimics 和inhibitor 后，可顯著地促進(jìn)或抑制細(xì)胞的增殖活力（圖6D）。

促癌miRNA的生存相關(guān)靶基因的鑒定流程如圖1B所示。miRnet數(shù)據(jù)庫中預(yù)測出10 278 個(gè)基因?yàn)樯鲜龃侔﹎iRNA的靶基因；經(jīng)GEPIA2數(shù)據(jù)庫的表達(dá)分析后有129 個(gè)符合預(yù)期；再經(jīng)Ualcan生存分析后有44個(gè)符合預(yù)期；Starbase數(shù)據(jù)庫中作miRNA-mRNA的共表達(dá)系數(shù)分析后，有27 個(gè)mRNA 與其對應(yīng)的miRNA的共表達(dá)關(guān)系符合預(yù)期的負(fù)相關(guān)關(guān)系，形成45 個(gè)miRNA-mRNA對（表2）。這45 個(gè)mRNA即為這些促癌miRNA的生存相關(guān)靶基因。

唐玄奘，前世為如來二弟子金蟬子，法號“玄奘”，被尊稱為“三藏法師”，后世俗稱“唐僧”，受大唐皇帝之托組建取經(jīng)四人組，從東土大唐出發(fā)，到西天拜佛求取真經(jīng)。唐僧作為整個(gè)取經(jīng)團(tuán)隊(duì)的領(lǐng)袖，負(fù)責(zé)整個(gè)團(tuán)隊(duì)的經(jīng)營和管理，和車間主任的崗位較為相似。每天要掌控車輛的維修進(jìn)度，協(xié)調(diào)車間的日常管理工作，對那些不聽話的人員不時(shí)還要念念“緊箍咒”。當(dāng)然除了管理之外還要配合其他部門完成相應(yīng)工作，關(guān)心自己團(tuán)隊(duì)人員的工作與生活困難，遇到問題時(shí)還要幫忙解決?？偟膩碚f唐僧的工作比較繁瑣，需要由膽大心細(xì)、有責(zé)任心的人來做。

2.2 miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

目前，高職教師到企業(yè)掛職鍛煉的時(shí)間一般為2-6個(gè)月（一個(gè)學(xué)期），最長也僅為1年（一個(gè)學(xué)年），掛職的時(shí)間相對較短。在短時(shí)間內(nèi)，教師很難做到與企業(yè)崗位、企業(yè)團(tuán)隊(duì)和企業(yè)管理等相融合，與企業(yè)的融合度不夠。因時(shí)間相對較短，企業(yè)也存在著不愿意將關(guān)鍵核心的崗位安排給掛職教師，通常會安排相對清閑的崗位，僅安排一些協(xié)作性、臨時(shí)性的工作。

基于上述分析鑒定的結(jié)果，我們構(gòu)建了肝細(xì)胞癌中促癌miRNA及其生存相關(guān)靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖2）。該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)由25 個(gè)促癌miRNA和27 個(gè)生存相關(guān)靶基因組成，其中hsa-mir-940 靶向最多的基因（6 個(gè)），CPEB3可被最多的miRNA靶向（7 個(gè)）（圖2）。

2.3 靶基因富集分析及關(guān)鍵基因鑒定

將鑒定出的生存相關(guān)靶基因列表拷貝到Enrichr數(shù)據(jù)庫中的粘貼框中，點(diǎn)擊“submit”進(jìn)行富集分析（https：//maayanlab.cloud/Enrichr/），在“pathways”菜單欄下可查詢KEGG富集的結(jié)果信息。

我們選擇了hsa-miR-221-5p/GCDH進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染hsa-miR-221-5p 的mimics和inhibitor 后，GCDH 的蛋白水平發(fā)生相應(yīng)的下調(diào)或增加（圖7A）。序列分析鑒定出了GCDH與hsa-miR-221-5p的結(jié)合位點(diǎn)（圖7B）；利用結(jié)合位點(diǎn)附近的序列我們構(gòu)建了正常序列的（WT）和突變序列的（MUT）熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（圖7B）；將hsa-miR-221-5p或NC的mimics 與兩種質(zhì)粒分別組合，共轉(zhuǎn)染HEG2細(xì)胞，檢測結(jié)果顯示hsa-miR-221-5p的mimic可以顯著降低正常序列質(zhì)粒（GCDH-WH）組的熒光素酶活性（圖7C）。

利用Ualcan 做表達(dá)分析的結(jié)果顯示，EHHADH，GCDH和ACAT1在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平較正常組織顯著升高（圖5A～C）；GEPIA數(shù)據(jù)庫得到的生存分析結(jié)果顯示，EHHADH，GCDH和ACAT1高表達(dá)的患者比低表達(dá)的患者總體生存率更高（圖5D～F）。

促癌miRNA的鑒定流程如圖1A。從OncoLnc數(shù)據(jù)庫中下載到486 條miRNA的數(shù)據(jù)信息，其中生存相關(guān)的miRNA 為146 個(gè)（<0.05）；OncomiR 數(shù)據(jù)庫中，提取生存相關(guān)的miRNA為223個(gè)（<0.05）；兩者的交集為131 個(gè)；在OncoLnc檢測miRNA的預(yù)后價(jià)值，發(fā)現(xiàn)120 個(gè)miRNA的高表達(dá)提示預(yù)后結(jié)果更差；進(jìn)一步在OncomiR中逐個(gè)作miRNA的表達(dá)分析后發(fā)現(xiàn)有48 個(gè)miRNA在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)量較癌旁組織升高。依據(jù)分析結(jié)果我們將這48 個(gè)miRNA定義為肝細(xì)胞癌中的促癌miRNA（表1）。

進(jìn)一步用STRING數(shù)據(jù)庫的分析得到生存相關(guān)靶基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（圖4A）；將該網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件，利用Cytohubba插件中的Closness，Degree，DMNC，EPC，MCC及MNC算法得到排名前9的基因（圖4B）；在此基礎(chǔ)上，再取交集得到排名前三的關(guān)鍵基因?yàn)镋HHADH，GCDH和ACAT1。

CCK8結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP N1-GCDH可抑制細(xì)胞的增殖活力，并且可以拯救由hsa-miR-221-5p 的mimics帶來的增殖促進(jìn)效應(yīng)（圖8A）。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果與CCK8結(jié)果保持一致，過表達(dá)hsa-miR-221-5p可增加細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而過表達(dá)GCDH可抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力；并且GCDH 可恢復(fù)由hsamiR-221-5p 過表達(dá)形成的遷移和侵襲能力的增強(qiáng)（圖8B～E）。

除以上柴油機(jī)特征參數(shù)外，還可通過柴油機(jī)排放氣體成分及濃度分析、柴油機(jī)振動分析和燃油供給系統(tǒng)的壓力監(jiān)測等，為柴油機(jī)故障診斷提供更充分的依據(jù)。[9-12]隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，更多監(jiān)測技術(shù)將在船舶上得到應(yīng)用，為船舶安全提供更為有利的保障。

3 討論

腫瘤發(fā)病分子機(jī)制的研究有助于新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物的開發(fā)，以及可能的新的治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。隨著生物數(shù)據(jù)量的急速增加和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，近年來，腫瘤相關(guān)的二級數(shù)據(jù)庫逐漸出現(xiàn)并且功能也日益完善。這使得許多研究者能夠方便地對特定癌種中的基因表達(dá)異常進(jìn)行系統(tǒng)的研究。然而，圍繞肝細(xì)胞癌中生存相關(guān)的促癌miRNA的系統(tǒng)性研究還未見報(bào)道。本項(xiàng)研究中，我們分別從OncomiR和Oncolnc數(shù)據(jù)庫中下載了肝細(xì)胞癌中生存相關(guān)的miRNA，再取兩者的交集，提高了篩選結(jié)果的可靠性。通過表達(dá)和生存分析明確有48 個(gè)miRNA 為促癌miRNA。其中部分miRNA在肝細(xì)胞癌中的功能及其作用機(jī)制已有較為細(xì)致的報(bào)道。如hsa-miR-183-5p，hsa-miR-222-3p，hsa-miR-421，hsa-miR-940和hsa-miR-9-5p等。還有部分促癌miRNA在肝細(xì)胞癌中的功能還未見文獻(xiàn)報(bào)道，因此，這些miRNA也值得未來進(jìn)一步研究。為了探究促癌miRNA促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，我們通過miRnet數(shù)據(jù)庫預(yù)測了促癌miRNA的靶基因，并通過GEPIA2 的生存分析和Ualcan 的表達(dá)分析，以及Starbase中的miRNA-mRNA的共表達(dá)分析，最終鑒定出了27個(gè)與肝細(xì)胞癌病人生存相關(guān)的靶基因。通過靶基因和miRNA的對應(yīng)關(guān)系，我們構(gòu)建了肝細(xì)胞癌中促癌miRNA 和生存相關(guān)靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，由25 個(gè)miRNA和27個(gè)靶基因組成。該網(wǎng)絡(luò)可能部分揭示了促癌miRNA導(dǎo)致肝細(xì)胞癌發(fā)生和發(fā)展，以及影響病人預(yù)后的分子機(jī)制。該網(wǎng)絡(luò)中少數(shù)miRNA-mRNA的調(diào)控關(guān)系已經(jīng)有了實(shí)驗(yàn)性的報(bào)道給予了支持。例如，有研究報(bào)道hsa-miR-9-5p可靶向ACAT1 mRNA 的3’端非轉(zhuǎn)錄區(qū)，降低其蛋白表達(dá)水平。然而，更多的調(diào)控關(guān)系則需要以后進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。

相關(guān)研究表明，影響數(shù)控機(jī)床熱變形誤差的主要原因是主軸部件熱變形誤差，由于實(shí)驗(yàn)條件有限，并且這篇論文主要是驗(yàn)證LWT-LSSVM建模預(yù)測方法的可行性與準(zhǔn)確性，所以只對數(shù)控機(jī)床部分發(fā)熱部件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析和研究。

為了研究生存相關(guān)的靶基因可能集中作用的信號通路，我們做了富集分析，結(jié)果顯示有5個(gè)生存相關(guān)靶基因（EHHADH，GCDH，ACAT1，ADH1C 和CYP4A11）富集在脂肪酸代謝信號通路中。以往的研究報(bào)道表明，脂肪酸參與合成細(xì)胞質(zhì)膜及相關(guān)信號分子，在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵基因分析，鑒定出EHHADH，GCDH 和ACAT1為這些生存相關(guān)靶基因中的關(guān)鍵基因。這三個(gè)基因在我們構(gòu)建的miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)中分別與hsa-miR-1226-3p，hsa-miR-221-5p 和hsa-miR-9-5p形成靶向關(guān)系。ACAT1在不同腫瘤中的功能已經(jīng)有報(bào)道。hsa-miR-9-5p與ACAT1的靶向關(guān)系也有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。但是，hsa-miR-1226-3p/EHHADH和hsa-miR-221-5p/GCDH 的調(diào)控關(guān)系目前還未見報(bào)道。在本研究中，Q-PCR結(jié)果支持了它們與靶基因的特異性調(diào)控關(guān)系。然而CCK8 結(jié)果僅支持hsa-miR-221-5p在肝癌細(xì)胞中有功能。為此，我們通過Western和熒光酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了hsa-miR-221-5p/GCDH的靶向關(guān)系。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hsa-miR-221-5p具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲、遷移的能力，而GCDH則發(fā)揮的是抑制的功能；過表達(dá)GCDH 可恢復(fù)由hsamiR-221-5p表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞增殖能力及侵襲、遷移能力的增強(qiáng)。這些結(jié)果表明hsa-miR-221-5p/GCDH軸在肝細(xì)胞癌的中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能。同時(shí)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也表明本研究中構(gòu)建的促癌miRNA和生存相關(guān)靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有較高的可信度；然而，更多分子的調(diào)控關(guān)系和功能仍需要以后進(jìn)一步的研究。

總之，本研究基于數(shù)據(jù)庫對肝細(xì)胞癌中生存相關(guān)的促癌miRNA進(jìn)行了系統(tǒng)性的挖掘和研究，并對鑒定到的關(guān)鍵miRNA/靶基因?qū)M(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這些結(jié)果有望為肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制和治療提供新的線索。