張雨晗，朱鴻成，杜曉霞，肖文香，李華

實(shí)現(xiàn)微米級(jí)滅菌范圍控制的微細(xì)等離子體射流裝置

張雨晗，朱鴻成，杜曉霞，肖文香，李華*

（桂林電子科技大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004）

為了實(shí)現(xiàn)微細(xì)等離子體的精準(zhǔn)滅菌，設(shè)計(jì)了新型微細(xì)等離子體射流裝置，并對(duì)該裝置產(chǎn)生的含氧活性粒子（Reactive Oxygen Species， ROS）和含氮活性粒子（Reactive Nitrogen Species， RNS）分布范圍及其滅菌范圍進(jìn)行研究。淀粉碘化鉀混合溶液里的碘離子可以被微細(xì)等離子體射流產(chǎn)生的ROS，RNS氧化成碘單質(zhì)，根據(jù)淀粉遇碘變藍(lán)的顯色原理，使用含有淀粉碘化鉀混合溶液的瓊脂培養(yǎng)基表征該裝置射流中ROS，RNS的分布范圍。將菌液涂布在瓊脂培養(yǎng)基上，使用微細(xì)等離子體射流裝置在相同的條件下處理不同的時(shí)間，于生化培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)以進(jìn)行滅菌范圍的表征。最后在Ts2FL尼康倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在交流電壓幅值為5 kV，中心頻率為10 kHz，作用時(shí)間為10，20和30 s時(shí)，滅菌范圍分別控制在30，65和75 μm的直徑內(nèi)。等離子體射流與處理物體表面不直接接觸和等離子體與物體表面直接接觸兩種作用方式相比，前者的滅菌范圍更小，更容易實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)控制。該裝置將目前毫米量級(jí)的滅菌范圍提高到了微米量級(jí)，對(duì)等離子體醫(yī)學(xué)研究具有重要意義。

微細(xì)等離子體；滅菌；淀粉碘化鉀混合溶液；微米級(jí)

1 引　言

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展對(duì)細(xì)菌檢測(cè)以及滅菌消毒技術(shù)的要求越來越高，其應(yīng)用領(lǐng)域也越來越廣。醫(yī)療器械的消毒、皮膚表面的傷口處理、牙齒根管治療、癌細(xì)胞的殺滅等大量臨床治療都需要進(jìn)行高精度的滅菌消毒。在細(xì)菌檢測(cè)方面，近幾年已經(jīng)做到了高精度快速定量的檢測(cè)［1-2］。目前，滅菌方式主要有物理法、化學(xué)法和生物法等［3］。物理法滅菌主要是通過施加高溫高壓、紫外線等進(jìn)行滅菌，包括熱力滅菌、輻射滅菌等，容易破壞不耐高溫高壓的醫(yī)療器械及人體組織，且大量的紫外線對(duì)人體皮膚、免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等均會(huì)造成一定的損傷；化學(xué)法滅菌主要是通過投加化學(xué)藥物進(jìn)行滅菌，常用的滅菌劑有戊二醛、鄰苯二甲醛和二溴海因等，極易殘留化學(xué)試劑并對(duì)人體及生態(tài)環(huán)境造成不可逆轉(zhuǎn)的損害；生物法滅菌主要是利用各種生物酶以達(dá)到消滅微生物及其排泄物的目的，雖然更加生態(tài)環(huán)保，但降解率低，且易受到外界環(huán)境的影響，使用范圍有限［4］。相比之下，低溫等離子體射流因具有低溫、高效、無殘留的特點(diǎn)，可以在高精度醫(yī)療器械消毒和空氣凈化等技術(shù)領(lǐng)域彌補(bǔ)傳統(tǒng)滅菌方式的不足［5］。繼1996年Laroussi課題組在世界上首次將大氣壓低溫等離子體技術(shù)應(yīng)用于滅菌消毒以來［6］，在學(xué)術(shù)界迅速掀起了大氣壓低溫等離子體滅菌消毒技術(shù)的研究熱潮，各種新型等離子體如介質(zhì)阻擋放電等離子體（DBD）、電暈放電等離子體（corona discharge）、輝光放電等離子體（glow discharge）等相繼被提出［7-9］。

將等離子體應(yīng)用于臨床，除了要考慮生物安全性、滅菌效果等因素外，還應(yīng)著重考慮是否會(huì)對(duì)周圍正常組織產(chǎn)生損傷，是否可以做到對(duì)處理區(qū)域的范圍及劑量的精確控制。此外，等離子體在細(xì)菌滅活方向的科學(xué)研究也迫切需要在細(xì)胞大小層面（微米量級(jí)）開展原理性研究。因此，等離子體射流對(duì)滅菌區(qū)域的精準(zhǔn)定位作用近年來成為研究熱點(diǎn)。盧新培課題組采用針電極電暈放電實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)細(xì)胞的精準(zhǔn)滅活控制［10］。Sun等研究了2×7的微細(xì)等離子體射流陣列對(duì)中耳炎的治療效果［11］。Shinya等以硅片為基底制作出一種等離子體芯片（Plasma-on-Chip），將等離子體放電電極和細(xì)菌培養(yǎng)皿集成設(shè)計(jì)，可對(duì)特定區(qū)域的小球藻細(xì)胞進(jìn)行等離子體處理［12-15］。上述裝置采用針電極或光纖材質(zhì)產(chǎn)生微細(xì)等離子體射流。裸露的針電極上有高壓，使用不方便且?guī)硪欢ǖ陌踩[患，而光纖材料做工精細(xì)，容易破碎，實(shí)際應(yīng)用中具有一定的難度；微細(xì)等離子體射流作用的實(shí)際范圍未見描述，不利于實(shí)際應(yīng)用。目前，微細(xì)等離子體作用的滅菌范圍還在毫米量級(jí)，如上海交通大學(xué)采用的微細(xì)等離子體射流裝置，滅菌范圍在0.4～2 mm之間［16］。本課題組在前期研究中，微細(xì)等離子體的作用精度也只停留在直徑為2 mm的圓形區(qū)域［17］，還不能滿足等離子體醫(yī)學(xué)研究的需求。

針對(duì)目前研究的不足與實(shí)際的臨床應(yīng)用，本文設(shè)計(jì)了一種新型的微細(xì)等離子體裝置。一方面，該裝置會(huì)限制ROS，RNS向四周擴(kuò)散，縮小處理范圍，減少了無關(guān)ROS，RNS的損耗；另一方面，等離子體處理劑量主要依賴射流時(shí)間的長(zhǎng)短和ROS，RNS的劑量，在保證時(shí)間恒定的情況下，可提高ROS，RNS變化的精度，從而精確控制滅菌范圍及其效果，為細(xì)胞層面的等離子體生物醫(yī)學(xué)研究提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)手段。

2 實(shí)　驗(yàn)

2.1　實(shí)驗(yàn)裝置

如圖1所示，微細(xì)等離子體由載氣流速控制裝置、交流電源、微細(xì)等離子體射流產(chǎn)生裝置以及數(shù)據(jù)采集和存儲(chǔ)裝置4部分組成。氣體流速控制部分主要由高壓氣瓶、D08-1F型流量顯示儀和CS200A數(shù)字式氣體質(zhì)量流量控制器（北京七星華創(chuàng)電子股份有限公司）組成。交流電源為低溫等離子體電源CTP-2000K（南京蘇曼電子有限公司，中心頻率10 kHz）。微細(xì)等離子體射流產(chǎn)生裝置采用內(nèi)徑為0.2 mm、外徑為0.49 mm、長(zhǎng)度為60 mm的中空金屬毛細(xì)管作為單電極，在單電極上施加交流電壓電離氦氣產(chǎn)生低溫等離子體射流。一個(gè)內(nèi)徑為75 μm、涂層厚度為20 μm、長(zhǎng)度為40 mm的彈性石英毛細(xì)管（YN-標(biāo)準(zhǔn)聚酰胺涂層毛細(xì)管，銳沛色譜器件有限公司，人工合成的高純度石英玻璃，其金屬粒子總含量≤30、OH含量≤100；抗張拉力>300 Kpsi；工作溫度為350 ℃，最高可達(dá)400 ℃）通過石英管（內(nèi)徑為2 mm，外徑為3 mm，長(zhǎng)度為2.5 mm）與金屬毛細(xì)管連接。微細(xì)等離子體射流產(chǎn)生的ROS，RNS在氦氣的作用下從彈性石英毛細(xì)管口吹出到達(dá)被處理物體表面，從而起到滅菌作用。放電電壓波形由衰減1 000倍的P6015A高壓探頭測(cè)量獲得，并通過TDS1002B-SC泰克示波器顯示和存儲(chǔ)。放電圖像由NIKON D300S相機(jī)進(jìn)行拍攝，光譜信息由AvaSpec-ULS3648-USB2光譜儀進(jìn)行采集，Ts2FL尼康倒置熒光顯微鏡用來觀察經(jīng)微細(xì)等離子體處理過后的培養(yǎng)基。

圖1　微細(xì)等離子體放電電路原理

2.2　菌株與培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)用到的菌種為大腸桿菌（ATCC 25922）。將一定數(shù)量的大腸桿菌接種于75 mL無菌Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基并放置于恒溫震蕩搖床中孵育16 h，設(shè)置參數(shù)180 rmp、37 ℃。之后，取100 μL已完成一次活化的菌液加入到75 mL的LB培養(yǎng)基中，放置于恒溫震蕩搖床中孵育6 h以使其菌種活性達(dá)到最佳，其余參數(shù)與第一次活化時(shí)設(shè)置相同。

2.3　實(shí)驗(yàn)方法

在微細(xì)等離子體ROS，RNS濃度測(cè)量實(shí)驗(yàn)中，主要采用分光光度法測(cè)量等離子體ROS，RNS中H2O2，HNO3/HNO2的濃度，基于Beer-Lambert定律進(jìn)行物質(zhì)濃度含量的測(cè)量：

式中：表示吸光度，表示吸光系數(shù)，表示吸收層的厚度，表示吸光物質(zhì)的濃度［18］。吸光度是被測(cè)等離子體ROS，RNS在紫外分光光度計(jì)特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)產(chǎn)生的，可以對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析。同時(shí)結(jié)合顯色法測(cè)量O3的濃度。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將同一操作下經(jīng)等離子體處理過的水溶液中ROS，RNS在特定波長(zhǎng)處的吸光度帶入前述所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，最后得出等離子體中ROS，RNS的實(shí)際濃度。

在微細(xì)等離子體滅菌范圍表征實(shí)驗(yàn)中，取100 μL活化好的菌液涂布到瓊脂培養(yǎng)基上。本次實(shí)驗(yàn)所用的瓊脂培養(yǎng)基每升超純水中含有如下成分：16 g瓊脂，10 g胰蛋白胨，5 g氯化鈉和5 g酵母提取物。涂布有菌液的瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)微細(xì)等離子體射流裝置滅菌后放在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h。最后在顯微鏡下觀察并測(cè)量滅菌范圍，并與未處理的對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比以分析其滅菌效果。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行三組以減小誤差。

3 結(jié)論與分析

3.1　放電特性分析

實(shí)驗(yàn)裝置中，電源的中心頻率固定在10 kHz，氦氣流速在0～0.3 slm（standard liter per minute，每分鐘標(biāo)準(zhǔn)升）可調(diào)，電壓幅值在0～9 kV內(nèi)變化。放電方式為單電極模式，即交流高壓加載在金屬毛細(xì)管上，等離子體射流末端相當(dāng)于虛地。當(dāng)加載的交流電壓幅值為5 kV，氦氣流速為0.1 L/min時(shí)，放電圖像如圖2所示。金屬毛細(xì)管兩端的等離子體射流從管口噴出，呈淡紫色。當(dāng)放電電壓幅值從5 kV增加到9 kV時(shí)，等離子體射流的長(zhǎng)度和強(qiáng)度逐漸增大，且發(fā)出不斷增強(qiáng)的“嗡嗡”音。

圖2　微細(xì)等離子體器件與電壓波形

根據(jù)氣體放電理論，等離子體以子彈的形式在空氣中傳播，本質(zhì)上是流光傳播過程。由于只有一個(gè)電極，因此放電在金屬毛細(xì)管高壓電極和周圍的氦氣中產(chǎn)生，類似于正電暈放電，且放電呈現(xiàn)周期性的脈沖形式，放電穩(wěn)定，能夠持續(xù)工作。等離子體射流只在金屬毛細(xì)管兩端產(chǎn)生，金屬毛細(xì)管不僅起到放電裝置的作用，也是氣體通路的一部分。ROS，RNS在氦氣流速的帶動(dòng)下進(jìn)入微細(xì)彈性石英毛細(xì)管，并排出管口進(jìn)行滅菌。

由于在氦氣電離放電時(shí)，電子與氦中性氣體相撞的概率很小，通常氦原子只能夠電離激發(fā)到亞穩(wěn)態(tài)，無法完全電離，而且自然狀態(tài)下空氣中氮分子電離所需的能量低于氦原子電離為亞穩(wěn)態(tài)所需要的能量，因此在電子與氦原子發(fā)生碰撞后，生成的亞穩(wěn)態(tài)氦原子極大可能還會(huì)與氮分子發(fā)生二次碰撞激發(fā)。如此，氦亞穩(wěn)態(tài)原子便將本身存在的能量傳導(dǎo)給了氮分子，該過程中進(jìn)一步碰撞激發(fā)，而激發(fā)所產(chǎn)生的能量可以通過氮分子離子退激過程中產(chǎn)生的光子來進(jìn)行釋放，因此可以在氦氣的發(fā)射光譜中明顯看到氮?dú)獾谝回?fù)帶系的譜線，且對(duì)于氦氣等離子體射流的溫度測(cè)量也是選擇氮?dú)獾谝回?fù)帶系來進(jìn)行計(jì)算［20-21］。

圖3顯示了由大氣壓氦氣低溫等離子體單管射流裝置生成的氦氣等離子體射流的發(fā)射光譜圖，標(biāo)記了羥基譜線、氮?dú)獾诙龓?、氮?dú)獾谝回?fù)帶系、氦氣關(guān)鍵譜線及氧的譜線，具體如表1所示。

圖3　大氣壓氦等離子體射流的發(fā)射光譜

表1氦等離子體發(fā)射光譜中的主要譜線

Tab.1　Main spectral lines in helium plasma emission spectra

3.2　ROS，RNS濃度測(cè)量及分布范圍表征

321HNO3濃度檢測(cè)及結(jié)果

硝酸根在紫外分光光度計(jì)中有最大吸收波長(zhǎng)［25］，因此本文以氫氧化鈉和硝酸反應(yīng)生成硝酸鈉來反映等離子體ROS，RNS中硝酸的濃度。然而，氫氧化鈉濃度過高會(huì)對(duì)吸光值產(chǎn)生影響，故實(shí)驗(yàn)所用的氫氧化鈉濃度為450 μmol/L。在標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制過程中，取濃硝酸347 μL定容至500 mL配置成0.01 mol/L的硝酸溶液，隨后將0.01 mol/L的硝酸溶液稀釋成一系列梯度濃度后，與450 μmol/L氫氧化鈉溶液各500 μL混合反應(yīng)定容至3.5 mL，測(cè)其吸光度值，最后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在測(cè)量等離子體ROS，RNS中硝酸濃度的過程中，各取500 μL等離子體處理的超純水和450 μmol/L 氫氧化鈉溶液加入比色皿中定容至3.5 mL，測(cè)量其吸光度。具體結(jié)果如圖4和表2所示。

圖4　硝酸鹽的吸收光譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線

322H2O2濃度檢測(cè)及結(jié)果

在酸性條件下，H2O2與鉬酸銨反應(yīng)生成穩(wěn)定且呈黃色的過氧鉬酸化合物，利用這個(gè)原理對(duì)H2O2濃度進(jìn)行測(cè)量［26］。采用碘化鉀作為顯色劑，通過顯色劑與活性物質(zhì)反應(yīng)生成新的長(zhǎng)壽命粒子，在紫外分光光度計(jì)設(shè)定的波長(zhǎng)超過300 nm時(shí)，碘單質(zhì)和碘離子基本沒有吸收波長(zhǎng)，碘三離子在350 nm處有最大吸收波長(zhǎng)［27］，檢測(cè)結(jié)果的靈敏度更高。分別配制檢測(cè)液A和B，A液由2 g鄰苯二甲酸氫鉀定容至100 mL配制而成，B液由0.02 g鉬酸銨、6.6 g碘化鉀以及0.2 g氫氧化鈉混合后定容至100 mL制得，最后將A，B液等體積混合得到最終的檢測(cè)液。在標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制中，將100 μL 30%的過氧化氫溶液加入99.6 mL超純水配制成0.01 mol/L的過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液，隨后將0.01 mol/L的過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成一系列梯度濃度的過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)液，隨后取不同濃度的過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液與檢測(cè)液各1 mL于3.5 mL石英比色皿中混合，再加超純水稀釋至3 mL，充分反應(yīng)10 min后，進(jìn)行吸光度檢測(cè)。選取吸收波長(zhǎng)為350 nm處繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)于H2O2濃度的測(cè)量，各取1 mL經(jīng)等離子體處理不同時(shí)間的超純水與檢測(cè)液后稀釋到3 mL，充分反應(yīng)10 min后測(cè)量吸光度，結(jié)果如圖5和表3所示。

表2　等離子體處理水溶液和氫氧化鈉反應(yīng)后混合溶液中硝酸的吸光度和實(shí)際濃度

圖5　過氧化氫的吸收光譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3等離子體處理水溶液和鉬酸銨反應(yīng)后混合液中過氧化氫的吸收光譜

Tab.3　Absorption spectra of hydrogen peroxide in mixed liquid after plasma treatment of aqueous solution and reaction of ammonium molybdate

323O3濃度檢測(cè)及結(jié)果

2014年，Patil等檢測(cè)到等離子體ROS，RNS中存在O3［28］。氣相臭氧溶解于水溶液中產(chǎn)生了液相臭氧，但是半衰期較短，本文采用碘量法測(cè)量液相臭氧的濃度。根據(jù)臭氧具有氧化性，可以將碘離子氧化成碘單質(zhì)，具體反應(yīng)如下：

O3+2KI+H2O→O2+I2+2KOH，（4）

I2+2Na2S2O3→2NaI+Na2S4O6，（5）

臭氧的濃度可以通過硫代硫酸鈉溶液的體積間接計(jì)算得出：

其中：Na為硫代硫酸鈉標(biāo)液的體積，為硫代硫酸鈉標(biāo)液的濃度，0代表所含臭氧的溶液體積。

在檢測(cè)液的配制過程中，取20 g碘化鉀定容至100 mL得到20%的碘化鉀溶液，避光保存一天后使用；將1 g可溶性淀粉加熱溶解于200 mL超純水中獲得淀粉指示劑，隨后放于4 ℃冰箱中隔夜沉淀，第二日取上清液使用；（1+5）硫酸溶液由2 mL濃硫酸和10 mL超純水混合制得；0.05 mol/L硫代硫酸鈉溶液由1.24 g硫代硫酸鈉溶液加超純水定容至100 mL。在臭氧濃度的測(cè)量過程中，將500 μL 20%的碘化鉀溶液和125 μL（1+5）硫酸溶液加入500 μL等離子體剛處理完的超純水中，并用保鮮膜密封避光保存5 min。取0.05 mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定檢測(cè)液直到呈現(xiàn)淡黃色，隨后滴加2.5 μL配置好的淀粉指示劑，此時(shí)溶液呈藍(lán)色，繼續(xù)滴定同時(shí)搖勻溶液，直到藍(lán)色恰好消失且30 s內(nèi)不變顏色為止，此為滴定終點(diǎn)。記錄消耗的硫代硫酸鈉溶液的量，利用式（6）計(jì)算并得出臭氧的濃度。具體結(jié)果見表4。

表4等離子體處理溶液中臭氧的濃度

Tab.4　Concentration of ozone in solution treated by plasma

如圖6所示，在處理距離為（處理距離為含有淀粉碘化鉀混合溶液的培養(yǎng)基平面和內(nèi)徑75 μm的彈性石英毛細(xì)管末端的距離）1 mm、電源電壓為5 kV、氣流量為0.1 L/min的條件下，按照不同時(shí)間進(jìn)行處理，隨后拿到顯微鏡下觀察處理區(qū)域。可以明顯看到，ROS，RNS的分布范圍隨著時(shí)間的增加而增大。當(dāng)處理時(shí)間為10 s時(shí)，ROS，RNS的作用范圍呈圓形，直徑為30 μm。處理時(shí)間增大到20 s和30 s時(shí)，ROS，RNS的作用范圍分別增大到40 μm和63 μm，顏色逐漸加深，表明ROS，RNS濃度越大，作用范圍越寬。這是因?yàn)樵陔妷汉蜌饬髁恳欢ǖ那闆r下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，微細(xì)等離子體射流產(chǎn)生的ROS和RNS的含量不斷增加，其可以氧化含有淀粉碘化鉀混合溶液瓊脂培養(yǎng)基里I形成I2的含量就越多，故而形成的顏色就會(huì)越深。

圖6　不同處理時(shí)間階段微等離子體中ROS，RNS分布的圖像

為了進(jìn)一步驗(yàn)證含有淀粉碘化鉀混合溶液的瓊脂培養(yǎng)基顯色是微細(xì)等離子體的作用而與載氣無關(guān)，將瓊脂培養(yǎng)基放到只通載氣的彈性石英毛細(xì)管下處理30 s，隨后拿到顯微鏡下觀察處理的區(qū)域，結(jié)果如圖7所示。視野范圍內(nèi)標(biāo)注的處理區(qū)域未見明顯的深色區(qū)域，即淀粉碘化鉀混合溶液顯色區(qū)域。由此可以得出結(jié)論，含有淀粉碘化鉀混合溶液的瓊脂培養(yǎng)基顯色是微細(xì)等離子體射流的作用，即微細(xì)等離子體射流產(chǎn)生的ROS和RNS具有將I氧化成I2的性質(zhì)。

圖7　含淀粉碘化鉀混合溶液的瓊脂培養(yǎng)基僅通氦氣的對(duì)比

3.3　滅菌范圍表征

雖然沒有從彈性石英毛細(xì)管末端觀察到射流，但在載氣的作用下，確實(shí)會(huì)把射流產(chǎn)生的ROS，RNS吹出彈性石英毛細(xì)管并與含有淀粉碘化鉀混合溶液的瓊脂培養(yǎng)基里的I發(fā)生氧化還原反應(yīng)而顯色。同樣將裝置電壓控制在5 kV、氣流量控制在0.1 L/min，可以明顯觀察到處理區(qū)域內(nèi)有一形狀改變區(qū)域，且隨著時(shí)間的增大，其范圍明顯增大，如圖8所示。可以明顯看到，滅菌范圍隨著時(shí)間的增加而增大。當(dāng)處理時(shí)間為10 s時(shí)，滅菌作用范圍呈圓形分布，直徑為30 μm。處理時(shí)間增大到20 s和30 s時(shí)，滅菌作用范圍分別增大到65 μm和75 μm。其滅菌范圍較上述ROS，RNS的分布范圍相比偏大，其原因是能夠使含淀粉碘化鉀混合溶液的瓊脂培養(yǎng)基顯色的ROS，RNS都是具有強(qiáng)氧化性的，然而一些不具有氧化性的ROS，RNS均具有滅菌效果。以上實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3組，結(jié)果取平均值。

圖8　不同處理時(shí)間階段微等離子體射流滅菌范圍表征圖像

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上文所述的滅菌作用是微細(xì)等離子體射流產(chǎn)生的，將涂布有菌液的瓊脂培養(yǎng)基放在彈性石英毛細(xì)管末端，不施加電壓僅通入流速為0.1 slm的氦氣，在顯微鏡下的觀察結(jié)果如圖9所示?？梢悦黠@觀察到，雖然氣流會(huì)使瓊脂培養(yǎng)基產(chǎn)生凹陷，但不會(huì)改變其涂布的菌液的形狀，無滅菌效果，即滅菌效應(yīng)與所通載氣無關(guān)。

圖9　涂有菌液的瓊脂培養(yǎng)基僅通氦氣的對(duì)比

3.4　溫度和濕度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響

為了研究環(huán)境溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，對(duì)培養(yǎng)基局部進(jìn)行加熱，模擬環(huán)境溫度的改變，在3組不同溫度下測(cè)量淀粉碘化鉀的顯色范圍。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，將培養(yǎng)基加熱到50 ℃以上時(shí)，培養(yǎng)基存在融化的可能，故溫度控制在50 ℃以下。觀察數(shù)據(jù)可知，隨著溫度的升高，顯色區(qū)域（如圖10中各圖標(biāo)出的黑色圓圈部分）逐漸變大。這是因?yàn)闃悠芳訜岬捷^高溫度時(shí)，其表面附近的氣體溫度也升高，導(dǎo)致氣體密度降低。氣體密度的降低會(huì)降低周圍氣體與等離子體羽的碰撞，等離子體膨脹過程中等離子體壓力降低，這會(huì)直接增加等離子體羽的大小。根據(jù)上述內(nèi)容，樣品溫度的提高會(huì)影響等離子體羽的膨脹動(dòng)力學(xué)，進(jìn)而可以增大等離子體的尺寸［29］，所以隨著實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度的提高，顯色范圍逐漸增大。具體結(jié)果如圖10所示。

圖10　不同溫度下含淀粉碘化鉀混合溶液的瓊脂培養(yǎng)基的顯色范圍比較

為了研究環(huán)境濕度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，通過將空調(diào)調(diào)至抽濕模式的方式，模擬環(huán)境濕度的變化，實(shí)驗(yàn)測(cè)了兩組淀粉碘化鉀的顯色范圍，其中實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)濕度為50% RH。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)觀察，隨著環(huán)境濕度的增大，顯色區(qū)域也逐漸增大。主要原因?yàn)?，低濕度的情況下，大量的高能電子直接作用于處理物體表面，但是由于水分子的數(shù)量較少，產(chǎn)生的OH自由基（由高能電子與水分子發(fā)生非彈性碰撞產(chǎn)生）等ROS的數(shù)量也比較少，隨著濕度的增加，高能電子直接作用于處理物體的自由電子數(shù)量減少，但是產(chǎn)生了更多的OH自由基，使得OH自由基與處理物表面的碰撞概率加大［30］，故顯色范圍隨著濕度的增加而變大。具體結(jié)果如圖11所示。

圖11　不同濕度下含淀粉碘化鉀混合溶液的瓊脂培養(yǎng)基的顯色范圍比較

3.5　機(jī)理分析

本文中微細(xì)等離子體射流實(shí)現(xiàn)滅菌采用的等離子體射流與處理物體表面不直接接觸的方式，其物理過程與另一種等離子體射流與處理物體表面直接接觸的方式不同。為了觀察兩者的不同，分別采用內(nèi)徑為20 μm（圖12（a））和100 μm（圖12（b））的毛細(xì)管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)?shù)入x子體射流與處理物體表面（玻璃平板和含有淀粉碘化鉀混合溶液的培養(yǎng)基）直接接觸時(shí)，在接觸面都有一個(gè)顯著的明亮斑點(diǎn)，說明在接觸面等離子體射流明顯增強(qiáng)，等離子體射流覆蓋的作用區(qū)域面積明顯增大。一方面，處理物體表面對(duì)氦氣起到了阻擋作用，使氦氣碰到物體表面后沿著物體表面向周圍擴(kuò)展；另一方面，空間電荷在物體表面更加容易沉積。以上兩方面因素會(huì)導(dǎo)致電離更容易發(fā)生，從而使等離子體射流變大變強(qiáng)，特別是在接觸點(diǎn)放電更加強(qiáng)烈。此外，等離子體射流與處理物體接觸，ROS，RNS運(yùn)動(dòng)距離更小，短壽命和長(zhǎng)壽命的ROS，RNS存活性更高，濃度更大，從而滅菌效能也相應(yīng)提高。

使用圖12（a）所示的等離子體射流裝置將涂布了菌液的瓊脂培養(yǎng)基處理30 s，之后于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h，如圖12（c）所示，圓形區(qū)域?yàn)闇缇鷧^(qū)域，直徑為6.7 mm。其顯微結(jié)構(gòu)如圖12（d）所示，左上角為未處理的對(duì)照區(qū)域，右下角為處理過的滅菌區(qū)域。可見經(jīng)等離子體射流裝置滅菌過后的瓊脂培養(yǎng)基在顯微鏡下的結(jié)構(gòu)與本實(shí)驗(yàn)微細(xì)裝置滅菌的性狀一致。在微細(xì)等離子體射流作用的過程中，ROS，RNS的分布沿軸向呈現(xiàn)依次遞減的趨勢(shì)，故而滅菌區(qū)域與對(duì)照區(qū)域交界處明顯可見部分白色的條紋。滅菌區(qū)域內(nèi)的透明小氣泡，為培養(yǎng)基制作過程中攪拌時(shí)產(chǎn)生的氣泡。

圖12　等離子體噴射裝置直接連接到被處理物體的表面及其滅菌效果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，直接接觸的等離子體射流相比不接觸的作用方式，產(chǎn)生的滅菌范圍更大，直徑在毫米量級(jí)。因此，為得到精度更高的滅菌范圍，本文采用的等離子體射流與物體表面不直接接觸的作用方式更有效。

4 結(jié)　論

本文為了實(shí)現(xiàn)微細(xì)等離子體的精準(zhǔn)滅菌，設(shè)計(jì)了一套直徑為75 μm的微細(xì)等離子體射流裝置。該裝置不同于傳統(tǒng)直接接觸的作用方式，在等離子體射流尾羽的末端通過石英管與內(nèi)徑75 μm的彈性石英毛細(xì)管相連接，在氦氣流速的推動(dòng)下，將等離子體產(chǎn)生的ROS，RNS經(jīng)彈性石英毛細(xì)管間接作用到處理物體的表面。內(nèi)徑75 μm的彈性石英毛細(xì)管不同于傳統(tǒng)的光纖材料，觸碰不易破碎，因此可以縮短對(duì)比于傳統(tǒng)裝置的處理距離，更好地抑制了ROS，RNS的擴(kuò)散；同時(shí)也不容易堵塞管口，提高了裝置的利用率。

射流裝置在交流電壓和He氣流的共同作用下，通過對(duì)該裝置的ROS，RNS分布范圍和滅菌范圍進(jìn)行表征。結(jié)果表明，在交流電壓幅值為5 kV，中心頻率為10 kHz，作用時(shí)間分別為10，20和30 s時(shí)，滅菌范圍可分別控制在30，65和75 μm的直徑范圍內(nèi)，均實(shí)現(xiàn)了微米級(jí)別圓形的精準(zhǔn)射流以及滅菌。該裝置可以滿足精準(zhǔn)滅菌的需求，對(duì)等離子體醫(yī)學(xué)研究具有重要意義。

在后續(xù)的研究中，將進(jìn)一步優(yōu)化裝置的控制精度。一方面，設(shè)計(jì)精密測(cè)控裝置，使等離子體射流出口與作用物體表面的距離可以精確控制；另一方面，通過三自由度運(yùn)動(dòng)平臺(tái)和攝像頭模塊相互配合，從而實(shí)現(xiàn)基于機(jī)器視覺的等離子體精準(zhǔn)滅菌。

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Micro plasma jet devices for micron sterilization range control

ZHANG Yuhan，ZHU Hongcheng，DU Xiaoxia，XIAO Wenxiang，LI Hua*

（，，541004，），：

In order to achieve precise sterilization using micro plasma， a novel micro plasma jet device was designed， and the distribution range of the reactive oxygen species （ROS） and reactive nitrogen species （RNS） generated by the device and the sterilization range of the device were investigated. First， iodine ions （I） in a potassium starch iodide mixture were oxidized to iodine monomers （I2） by the ROS and RNS generated by microplasma jets. The range of distribution of the ROS and RNS in the jet of the device was characterized using an agar medium containing the starch-potassium iodide mixture， based on the color development principle of starch， which turns blue when exposed to iodine. Next， a bacterial solution was coated on an agar medium and incubated overnight at 37 °C in a biochemical incubator using a micro plasma jet device for different times under the same conditions for characterization of the sterilization range. Finally， the sterilization ranges were observed under a Ts2FL Nikon inverted fluorescence microscope. The experimental results indicate that the sterilization range can be controlled within diameters of 30， 65， and 75 μm at an AC voltage amplitude of 5 kV， a center frequency of 10 kHz， and an action time of 10， 20， and 30 s， respectively. A plasma jet does not directly contact the surface of the object， whereas plasma directly contacts the surface of the object； the former has a smaller sterilization range， and it is easier to achieve accurate control. This device improves the current millimeter-scale sterilization range accuracy to the micron scale， which is of great significance for plasma medical research.

micro plasma； sterilization； starch-potassium iodide mixture； micron scale

TM213

A

10.37188/OPE.20223003.0296

1004-924X（2022）03-0296-14

2021-09-02；

2021-10-29.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.61864001，No.62163009）；廣西自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（No.2021GXNSFDA196005）；廣西自動(dòng)檢測(cè)技術(shù)與儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任基金資助項(xiàng)目（No.YQ21111）；廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（No.YCSW2021181）

張雨晗（1997），女，吉林長(zhǎng)春人，碩士研究生，主要從事微細(xì)等離子體滅菌的研究。E-mail：2504901871@qq.com

李華（1978），男，湖南郴州人，博士，教授，博士生導(dǎo)師，2001年、2004年于中北大學(xué)分別獲得學(xué)士和碩士學(xué)位，2007年于北京理工大學(xué)獲得博士學(xué)位，2010年于清華大學(xué)儀器科學(xué)與技術(shù)博士后流動(dòng)站出站，主要從事等離子體醫(yī)學(xué)、MEMS等的研究。E-mail：lihua@guet.edu.cn