晁江濤，曹建敏，吳新儒，李志遠(yuǎn)，曹鵬云，崔萌萌，孫玉合*，劉貫山*

烤煙特征香韻品系8號清甜香韻的形成機(jī)制研究

晁江濤1,2，曹建敏1，吳新儒1，李志遠(yuǎn)1，曹鵬云1，崔萌萌1，孫玉合1*，劉貫山1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

烤煙特征香韻品系8號（特8）是通過EMS誘變中煙100，連續(xù)自交選育的烤煙新品系，其現(xiàn)蕾期的上部葉具有明顯的清甜香韻。為探討鮮煙葉香韻的形成機(jī)制，以特8和中煙100為研究對象，運(yùn)用頂空-箭型固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（HS-SPME Arrow-GC/MS）測定其揮發(fā)性成分，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法開展相關(guān)研究。結(jié)果顯示：（1）特8揮發(fā)性成分有26種化合物，其中萜烯類化合物數(shù)量18種，相對含量均值為71.74%，是中煙100的2.34倍；（2）特8芳樟醇的相對含量均值為52.12%，為中煙100的3.40倍，是清甜香韻的主體成分；（3）MVA通路負(fù)責(zé)合成揮發(fā)性萜烯類化合物，特8現(xiàn)蕾期上部葉有9個關(guān)鍵限速酶基因、12個TPS基因上調(diào)表達(dá)，有助于提高萜烯類化合物的釋放量，其中TPS亞家族b成員可能是芳樟醇合酶基因。綜上所述，特8現(xiàn)蕾期上部葉的MVA通路存在多個關(guān)鍵基因協(xié)同上調(diào)，有助于提升其揮發(fā)性萜烯類化合物的總體釋放量，而具有清甜香味且相對含量最高的芳樟醇可能是賦予其清甜香韻的主效因子。

煙草；EMS突變體；清甜香韻；特8；萜烯合酶

特8是通過EMS誘變中煙100種子[1]，運(yùn)用系譜法經(jīng)定向選育獲得的烤煙新品系，該品系自苗期至現(xiàn)蕾期，清甜香特征逐漸明晰，處于現(xiàn)蕾期的嫩葉或側(cè)芽表現(xiàn)尤為明顯。隨著嫩葉伸展成為成熟葉，清甜香特征逐漸變?nèi)?，此進(jìn)程伴隨腺毛脫落，腺毛脫落會直接減少腺毛分泌物的總量。這一現(xiàn)象最初是通過人工嗅聞發(fā)現(xiàn)的[2]。但是，該香韻的形成機(jī)制尚不明確，例如香韻主要化合物的構(gòu)成，合成通路及其關(guān)鍵調(diào)控基因等。

鮮煙葉與烤后煙葉的香韻特征緊密相關(guān)又存在較大差異[3]。鮮煙葉經(jīng)歷一系列復(fù)雜的烘烤工藝，大量內(nèi)含物完成物質(zhì)轉(zhuǎn)換才能形成烤后煙香韻特征。本課題組前期分析研究了烤煙品種中煙特香301烤后煙葉的特征香氣物質(zhì)[4-6]，該品種具有玫瑰花香韻，其揮發(fā)性氣體的種類及相對含量以萜烯類化合物為主，玫瑰花香韻的主要組分為β-羅勒烯。除此之外，果香、辛香及薩姆遜香韻突變品系的組成成分，均以萜烯類化合物為主。但是，前期研究未對鮮煙葉中特征香氣物質(zhì)的分子代謝機(jī)制深入解析。本研究以清甜香突變品系特8和中煙100鮮煙葉為試驗(yàn)材料，在采用GC-MS非靶標(biāo)分析技術(shù)明確其特征香氣物質(zhì)的基礎(chǔ)上，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，從分子水平和基因水平探索清甜香韻的形成機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為特8和中煙100（對照），種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙草突變體庫提供。試驗(yàn)材料于2019年5月1日移栽至山東省諸城洛莊試驗(yàn)站（北緯：35°59′25.20″，東經(jīng)：119°07′55.37″），7月16日進(jìn)入現(xiàn)蕾期，開展樣品采集相關(guān)工作。

1.2 儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫科技有限公司）；自制三角頂空瓶；固相微萃?。⊿PME）進(jìn)樣器及50/70 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（美國Supelco公司）；氮吹儀（美國Organomation公司）；甲醇、三氯甲烷、吡啶（色譜純，純度>99.5%），甲氧基胺鹽酸鹽（純度>98%）購自上海泰坦科技股份有限公司；正十七烷醇（純度>99.5%）,N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟利乙酰胺（MSTFA，純度>98.5%）購自美國Sigma公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 揮發(fā)性氣體采集 依據(jù)煙草揮發(fā)性氣體采集最優(yōu)條件[7]，頂空采樣裝置使用硅烷化處理后的自制三角瓶，運(yùn)用原位靜態(tài)頂空法采集活體煙株揮發(fā)性氣體，設(shè)8個生物學(xué)重復(fù)，在實(shí)際操作過程中，有3份中煙100樣品數(shù)據(jù)異常，因此中煙100參與后續(xù)分析的生物學(xué)重復(fù)為5個。采集氣體前，萃取頭需在氣相色譜儀進(jìn)樣口老化15 min（進(jìn)樣口溫度為250℃）。采集氣體時，選取無物理損傷、無病蟲害、生長勢一致的煙株上部2～3片嫩葉，完全收入三角瓶中。三角瓶整體倒置，萃取頭通過瓶底部小孔插入至瓶內(nèi)，將纖維頭伸出針管，靜態(tài)萃取40 min。完成后，放入冰盒中等待GC-MS上機(jī)檢測。

1.3.2 GC-MS條件 參考徐曉玲等[7]優(yōu)化的GC-MS條件：色譜柱為DB-5MS石英毛細(xì)管（30 m× 250 μm×0.25 μm），載體為高純氦氣，流速1 mL/min。進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣。進(jìn)樣時，柱溫箱升溫程序設(shè)置：45 ℃保持2 min，5 ℃ /min的速率升至200 ℃，保持2 min，15 ℃/min升至300 ℃，保持5 min。離子源選用EI源，電離電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度250 ℃。全掃描模式，掃描范圍33 ～550 （/）。

1.3.3 GC-MS數(shù)據(jù)分析 GC-MS分析后，各色譜峰與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)局化學(xué)數(shù)據(jù)庫（https://webbook.nist.gov/chemistry/）和Agilent Fiehn代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)離子片段進(jìn)行比對，之后對比輔助保留指數(shù)及參考已有文獻(xiàn)，最終確定化合物名稱。每個揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的相對含量采用峰面積百分比法表示，用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算內(nèi)在代謝產(chǎn)物相對含量。揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析中，主要針對在DB-5MS色譜柱中保留指數(shù)(retention index, RI) < 1700的成分，剔除因萃取頭和色譜柱流失導(dǎo)致組內(nèi)差異較大的成分和空白對照中檢出的環(huán)境中苯系類化合物等，最終確定26種揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)分析。由于樣品之間變異系數(shù)較大，每個代謝產(chǎn)物的相對含量均用最大值、最小值及平均值進(jìn)行標(biāo)注，特8與對照之間的差異倍數(shù)采用平均值進(jìn)行計(jì)算。

1.3.4 轉(zhuǎn)錄組取樣 于現(xiàn)蕾期選擇天氣晴朗的上午8∶30至11∶30之間取樣。選取生長勢一致的煙株，掛牌標(biāo)記。采摘靠近煙株頂部，葉片長度15～20 cm左右的嫩葉，迅速打孔，每份樣品取5～10個2.5 cm圓葉片。用錫箔紙包裹，做好標(biāo)記，并用棉繩扎好之后迅速置于液氮中。轉(zhuǎn)錄組測序生物學(xué)重復(fù)默認(rèn)為3個，另外增加2個重復(fù)作為備用樣。

1.3.5 轉(zhuǎn)錄組測序 用Trizol 法提取待測葉片總 RNA；使用Illumina公司提供的NEBNext?UltraTM RNA Library Prep Kit 試劑盒構(gòu)建cDNA文庫；之后郵寄cDNA文庫至天津諾禾致源生物科技有限公司，利用Illumina高通量測序平臺NovaSeq 6000進(jìn)行測序。

1.3.6 萜類代謝通路基因檢索 通過關(guān)鍵詞檢索白肋煙TN90基因組注釋信息[8]，獲得萜類代謝通路關(guān)鍵限速酶候選基因。以Pfam數(shù)據(jù)庫[9]保守結(jié)構(gòu)域PF01397、PF03936 和PF19086為查詢序列，運(yùn)用HMMER[10]（v3.0）檢索TN90基因組蛋白注釋信息，經(jīng)校正獲得萜烯合酶（terpene synthase, TPS）基因家族。以番茄TPS基因[11]為參考，用MEGA[12]（v11.0.10）軟件，基于鄰接法（Neighbor-Joining, NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（Bootstrap=1000），利用iTOL在線工具[13]（https://itol.embl.de）美化進(jìn)化樹。

1.3.7 基因表達(dá)模式分析 以TN90[8]為參考基因組。用HISAT2[14]（v2.1.0）將轉(zhuǎn)錄組比對至參考基因上，利用bedtools[15]（v2.19.1）從中提取基因相對表達(dá)量信息，用R語言包DESeq2[16]分析差異表達(dá)基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）。篩選時，設(shè)置表達(dá)差異（log2Fold Change，log2）≥1.0, P-value≤0.05。使用TBtools[17]工具包中HeatMap繪制基因差異表達(dá)圖。

1.3.8 序列比對分析 序列比對使用BLAST（v2.2.26+）工具。其中BLASTN用于核苷酸序列比對，e-value值設(shè)為0.05，其余參數(shù)默認(rèn)；BLASTP用于氨基酸序列比對，e-value值設(shè)為0.05，其余參數(shù)默認(rèn)。

表1 特8和中煙100現(xiàn)蕾期上部嫩葉的揮發(fā)性氣體成分

2 結(jié) 果

2.1 揮發(fā)性氣體成分分析

單一化合物的相對含量采用峰面積百分比法表示，設(shè)置差異倍數(shù)（Fold Change,）≥2為差異顯著。由表1可知，檢測到特8揮發(fā)性氣體26種化合物，其中萜烯類為18種，其他化合物8種，相對含量分別為71.74%、28.26%，整體來看，特8揮發(fā)性氣體以萜烯類為主，其萜類化合物的相對含量是中煙100的2.34倍；特8有11種化合物的相對含量平均值≥1%，其中芳樟醇差異水平顯著（=3.40，相對含量平均值為52.12 %）。

2.2 萜類化合物代謝通路的基因表達(dá)差異分析

研究表明，萜類化合物的釋放量與TPS基因的表達(dá)量呈正相關(guān)[18-21]，其中MVA通路主要負(fù)責(zé)合成揮發(fā)性萜類化合物。本研究圍繞MVA通路，篩選特8與中煙100之間的差異表達(dá)基因。經(jīng)檢索，MVA通路上游AACT、HMGS、HMGR、MK、PMK、MVD等6個關(guān)鍵限速酶的候選基因數(shù)分別為14、6、7、4、2、4，共計(jì)37個；中游IDI、GPPS、FPPS、GGPPS等4個關(guān)鍵酶的候選基因數(shù)分別為6、2、4、15，共計(jì)27個；下游TPS基因家族有55個成員，以番茄TPS基因?yàn)閰⒖迹瑢⑵鋭澐譃閍、b、c、e/f 和g等5個亞家族（圖1），其成員數(shù)分別為20、18、6、10和1，其中TPS-a和TPS-b主要負(fù)責(zé)合成倍半萜和單萜化合物。

注：煙草TPS基因前綴為LOC，番茄TPS基因前綴為Sly。

為便于描述MVA通路不同階段的差異基因，將通路分為上游、中游和下游3個階段（圖2），其中上游負(fù)責(zé)合成GPP/FPP/GGPP的前體物IPP和DMAPP；中游負(fù)責(zé)合成萜烯類化合物前體物GPP/FPP/GGPP；下游負(fù)責(zé)直接合成單萜、倍半萜或二萜等萜烯類化合物。由圖2可知，從MVA通路中篩選到30個差異表達(dá)基因，其中21個基因顯著上調(diào)，9個基因顯著下調(diào)。

（1）在通路上游，AACT基因（LOC107806485）、HGMS基因（LOC107796407）、HGMR基因（LOC107765219）及MVD基因（LOC107811776）均顯著上調(diào)，有助于增強(qiáng)合成IPP和DMAPP的能力。

（2）在通路中游，有3個IDI基因（LOC107808635、LOC107821723和LOC107821727）上調(diào)，有助于提升IPP與DMAPP的動態(tài)轉(zhuǎn)換效率；2個FPPS基因（LOC107765018和LOC107795792）上調(diào)，1個FPPS基因（LOC107779968）下調(diào)，有助于提升倍半萜底物FPP的合成能力；3個GGPPS基因（LOC107822513、LOC107783257和LOC107830453）下調(diào)，可降低通路合成二萜底物GGPP數(shù)量，間接為合成GPP和FPP提供更多的原材料。

圖2 MVA通路相關(guān)基因差異表達(dá)分析

（3）在通路下游，有10個TPS-a基因（LOC107760760、LOC107769201、LOC107769393、LOC107778627、LOC107783716、LOC107799408、LOC107812685、LOC107819330、LOC107821548、LOC107829287）顯著上調(diào)表達(dá)，有助于提升合成單萜和倍半萜的水平；TPS-b有2個基因（LOC107762925和LOC107794877）上調(diào)表達(dá)，1個基因（LOC107828918）下調(diào)，有助于合成更多的單萜；TPS-c有1個基因（LOC107790102）下調(diào)；TPS-e/f有1個基因（LOC107816701）下調(diào)；TPS-g有1個基因（LOC107828192）下調(diào)。

2.3 TPS差異基因功能預(yù)測

結(jié)果顯示，在TPS基因家族中，有17個差異基因（圖2）：12個基因上調(diào)、5個基因下調(diào)；其中上調(diào)明顯、表達(dá)量較高的基因?yàn)長OC107762925 (TPS-b, TPM=48.7)和LOC107829287 (TPS-a, TPM=34.7)。通過與NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫（Non-redundant protein sequences, NR）做BLAST序列比對發(fā)現(xiàn)，LOC107762925與絨毛狀煙草基因LOC108948581編碼的氨基酸序列完全一致，后者已知產(chǎn)物為R-芳樟醇，這表明LOC107762925是芳樟醇合酶候選基因；而LOC107829287與番茄TPS32基因高度同源，推測該基因?yàn)?+)-喇叭烯合酶候選基因。

3 討 論

研究結(jié)果表明，特8可檢測的揮發(fā)性化合物種類比中煙100多6種；特8萜烯類化合物的相對含量為71.74%，是中煙100的2.34倍；特8芳樟醇的相對含量均值為52.12%，是相對含量最高的化合物，其香氣屬性為清甜香味，由此推測芳樟醇是特8品系鮮煙葉具有清甜香韻的主效因子。

鑒于TPS基因的表達(dá)量與其產(chǎn)物的釋放量正相關(guān)[18-21]，基于差異代謝物與差異基因分析結(jié)果，或許可從中發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物與基因之間的關(guān)聯(lián)線索。芳樟醇是相對含量最高、差異顯著的代謝產(chǎn)物；而LOC107762925是表達(dá)量較高、差異顯著的TPS-b基因。清甜香韻與芳樟醇、芳樟醇與LOC107762925均呈現(xiàn)強(qiáng)相關(guān)，三者之間存在密切聯(lián)系。進(jìn)一步經(jīng)過序列比對，LOC107762925與絨毛狀煙草基因LOC108948581編碼的氨基酸序列完全一致，后者已知產(chǎn)物為R-芳樟醇，可推測LOC107762925是芳樟醇合酶候選基因。

綜上所述，推測在特8嫩葉的MVA通路中，多個TPS基因協(xié)同上調(diào)，顯著增加了其煙葉腺毛釋放揮發(fā)性萜烯化合物的種類及總量，其中芳樟醇為主效因子，其自身的清甜香屬性賦予了特8清甜香韻，而LOC107762925是芳樟醇合酶的候選基因，催化底物GPP合成芳樟醇。

4 結(jié) 論

具有清甜香屬性的芳樟醇賦予了特8品系清甜香韻；更多種類的萜烯類化合物有助于提升特8清甜香韻的層次感；TPS基因亞家族b成員LOC107762925是合成芳樟醇的候選基因之一，其功能還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Study on the Formation of Fresh-Sweet Flavor in Tobacco Mutant T8

CHAO Jiangtao1,2, CAO Jianmin1, WU Xinru1, LI Zhiyuan1, CAO Pengyun1, CUI Mengmeng1, SUN Yuhe1*, LIU Guanshan1*

(1. Key Laboratory for Tobacco Gene Resources, Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

T8 is a new flue-cured tobacco mutant line, which was selected from the Zhongyan100 EMS mutant library to have obvious fresh-sweet fragrance at bud stage. In order to comprehensively understand the formation of flavor at the molecular and genetic levels, we analyzed T8 and Zhongyan100 fresh tobacco leaves using the headspace-arrow solid phase micro-extraction and gas chromatography mass spectrometry (HS-SPME Arrow-GC/MS) to detect volatile organic compounds (VOCs), and the results were analyzed in combination with with RNA-seq data. The results showed that: (1) There are 26 kinds of VOCs in T8, among which 18 kinds of terpenes were found, and the relative content of terpenoids was 71.74%, which was 2.34 times of that of Zhongyan100. (2) The relative content of T8 linalool was 52.12%, which was 3.40 times of Zhongyan100, and it was the main component of fresh-sweet flavor. (3) In the MVA pathways of T8 young leaves at bud stage, 9 key rate-limiting enzyme genes and 12 TPS genes were up-regulated, which contributed in increasing the release of terpenoids. In summary, the synergistic up-regulation of several key genes in the MVA pathway contributes to the increase of overall release amount of terpenoids, and linalool with sweet flavor accounts for the highest proportion, which may be the main contributing factor to fresh-sweet flavor.

; EMS mutant; fresh-sweet flavor; T8; TPS

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.06.012

TS41+1

A

1007-5119（2022）06-0082-06

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-TRIC02）；中國煙草總公司山東省公司重點(diǎn)項(xiàng)目（202209）；中國煙草公司“揭榜掛帥”項(xiàng)目（110202103009；110202103015）

晁江濤（1985-），男，助理研究員，從事煙草分子育種研究。E-mail：chaojiangtao@caas.cn

，E-mail：孫玉合，sunyuhe@caas.cn；劉貫山，liuguanshan@caas.cn

2022-06-06

2022-12-05