豆彪，楊如夢，鄭路，李霞，王佳佳

哺乳動物細胞中大多數(shù)蛋白可發(fā)生糖基化修飾，糖基化作為一種重要的翻譯后修飾類型，在信號轉(zhuǎn)導、表觀遺傳、應激反應、蛋白質(zhì)降解及細胞凋亡等生命進程中扮演著非常重要的角色，如細胞之間的識別、信號的傳導、病原體的入侵以及癌癥發(fā)生發(fā)展等。在脊椎動物中，每個細胞的表面幾乎都分布著大量的聚糖分子[1]，它們是由 9 種類型單糖組合成的生物聚合物，這些糖鏈的末端一般為唾液酸。唾液酸是一類帶有負電荷且結構相似的九碳糖的總稱，通常出現(xiàn)在 N-連接和 O-連接糖基化蛋白結構的末端。哺乳動物體內(nèi)存在三種唾液酸，其中，N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac）和 N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）是最為常見的，脫氨神經(jīng)氨酸（ketodeoxynonulosonic acid，KDN）[2]含量較少。細胞表面唾液酸在不同的生理和病理過程中起著重要作用，例如，細胞表面唾液酸聚糖可作為唾液酸識別蛋白的配體，介導淋巴細胞歸巢、免疫反應、細胞之間的識別和病原體入侵等，唾液酸廣泛地參與受精[3]、骨骼發(fā)育[4]、神經(jīng)連接[5]等過程，而唾液酸合成和修飾的失調(diào)與癌癥[6]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[7]等嚴重疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關。

盡管唾液酸聚糖參與了許多重要的生物過程，但是糖基化過程不直接受中心法則調(diào)控，且聚糖結構復雜多變，一直缺乏有效的標記技術。前期唾液聚糖識別凝集素或抗體被用于唾液聚糖成像和糖蛋白組分析，然而，基于凝集素和抗體的方法具有低親和力、毒性和低組織滲透性等，使得其標記方法局限[8]。近些年，化學生物學蓬勃發(fā)展，出現(xiàn)了對唾液酸化聚糖以及其他多種糖鏈結構修飾的代謝標記，科學家開發(fā)了基于生物正交反應的非天然糖代謝標記策略，并逐漸成為了在細胞和活體水平上研究糖基化修飾的最主要手段之一。N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）是合成唾液酸的前體，在 ManNAc的 N-乙酰位引入一些非天然的基團，例如在乙酰基等結構中加長碳鏈，這些改造后的 ManNAc 類似物依然能順利進入唾液酸的代謝途徑，從而表達于細胞表面[9]。隨后，該團隊研究了其類似物 N-丙酰甘露糖胺（N-propanoylmannosamine，ManNProp，圖1A）在大鼠中的代謝情況，ManNProp 在多個器官均可被代謝為 SiaNProp，隨后被整合到細胞膜表面聚糖中；基于以上研究，Bertozzi 團隊[10]開發(fā)了具有功能性的 ManNAc 類似物 N-4-氧代戊酰甘露糖胺（N-levulinoylmannosamine，ManLev，圖1B）。同樣的原理，ManLev 可以通過代謝進而轉(zhuǎn)化為 SiaLev，隨后整合到細胞膜上的唾液酸聚糖中，為細胞表面聚糖引入功能基團——羰基，實現(xiàn)了細胞膜表面聚糖可發(fā)生化學反應性的功能化。由于羰基和肼的偶聯(lián)反應需要在弱酸性條件下進行，并且細胞中天然存在含有羰基的分子，導致其應用具有很大的局限性，因而需要設計和開發(fā)適用于活細胞中特異性高的偶聯(lián)反應。隨后，該團隊于2000年又報道了含有疊氮的 ManNAc 類似物 N-疊氮乙酰甘露糖胺（N-azidoacetylmannosamine，ManNAz，圖1C），該探針可通過代謝進入到細胞的唾液酸合成途徑，在細胞膜表面糖鏈中引入含有疊氮基團的唾液酸 SiaNAz，接著利用疊氮與三苯基磷的偶聯(lián)反應進行功能化修飾，這種方法被稱為非天然糖代謝標記（metabolic glycan labeling，MGL）或糖代謝工程（metabolic oligosaccharide engineering，MOE）[11]。2004年 Bertozzi 課題組還將 Ac4ManNAz 采用連續(xù)腹腔注射方式成功對小鼠活體組織唾液酸標記[12]。唾液酸的代謝標記即基于上述原理，在唾液酸分子及其合成前體ManNAc 上引入生物正交基團[13]，利用生物正交反應[14]或其他手段標記非天然糖[15-18]，并通過熒光探針、化學發(fā)光等手段，檢測細胞表面的糖鏈結構。

圖1 唾液酸代謝標記探針（A：N-丙酰甘露糖胺；B：N-4-氧代戊酰甘露糖胺；C：N-疊氮乙酰甘露糖胺；D：N-丁炔?；?全乙?；事短前罚〧igure 1 Metabolic probes for sialic acid glycans labeling (A: ManNProp; B: ManLev; C: ManNAz; D: Ac4ManNAl)

隨著生物正交反應的大力發(fā)展，唾液酸聚糖的代謝標記可選擇多種新的生物正交基團，比如上文提到的 Ac4ManNAz，由于疊氮基團體積小、正交反應性好、化學性質(zhì)較穩(wěn)定以及便于引入等優(yōu)點，從而被廣泛使用。作為一價銅離子催化的疊氮-炔基環(huán)加成反應[18-20]（Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC）中疊氮基團的互補反應伙伴炔基也同樣具有作為生物正交化學報告基團的良好特性。炔基具有較好的穩(wěn)定性，且不天然存在于細胞中，便于特異性偶聯(lián)。我們課題組前期報道了一系列含有疊氮基團的分子探針[21-24]，然而含有炔基基團的探針卻鮮有報道，借此本文探討了能與疊氮正交反應的炔基探針 Ac4ManNAl（圖1D），并對其進行活細胞和活體標記分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人肺腺癌細胞系 A549、H1299、人腎上皮細胞系 293T、人宮頸癌細胞系 HeLa 細胞和小鼠肺癌細胞系 LLC-LUC 細胞、人結腸腺癌細胞系SW1116 均購于 ATCC；C57BL/6J 小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與傳代 所有細胞系在 37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至 90%時即可進行細胞傳代。棄去培養(yǎng)基用 PBS 先洗一遍，加入胰酶消化至細胞收縮變圓，然后加入完全培養(yǎng)基終止消化。用移液槍輕輕將細胞吹下，轉(zhuǎn)移至 15 ml 離心管，800 r/min 離心 5 min。棄去上清，用完全培養(yǎng)基重懸細胞，平均傳至新的培養(yǎng)皿中，一般 2 天左右傳代 1 次。

1.2.2 活細胞代謝標記 六孔板密度為 80% 的細胞用不同濃度的非天然糖處理 24 h。通過胰蛋白酶消化獲取，用 PBS 洗滌 3 次。細胞在 RIPA 裂解液（1% NP-40，0.5% 脫氧膽酸鈉，1% SDS，50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，蛋白酶抑制劑，pH = 7.4）中裂解并超聲，12 000 r/min 離心 15 min 并取上清。用 BCA 法進行蛋白定量，隨后取 200 μmol/L 蛋白裂解液與 100 μmol/L Azide-PEG4-Biotin 在 CuSO4/THPTA（100 μmol/L CuSO4，200 μmol/L THPTA）和 5 mmol/L 抗壞血酸鈉催化下室溫振蕩 2 h 進行 Click 反應。加入500 μl 甲醇于 -80 ℃ 靜置 2 h，沉淀出的蛋白經(jīng)離心后，再用 500 μl 甲醇清洗 2 遍；晾干后，用80 μl 4% SDS 和 20 μl 5 × loading 調(diào)節(jié)蛋白濃度為 2 mg/ml。蛋白利用 10% SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)膜，加入 5% 脫脂奶粉的 TBST（150 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20，10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6）室溫封閉 2 h 后進行 Streptavidin-HRP 抗體室溫孵育 2 h 及 ECL 免疫印跡顯色。

1.2.3 小鼠組織體內(nèi)標記 選取 6 周齡C57BL/6J 雄性小鼠 2 只。將 2 只小鼠隨機分為對照組和 Ac4ManNAl 組，對 Ac4ManNAl 組連續(xù)7 d 進行腹腔注射 200 μl Ac4ManNAl（300 mg/kg，溶于 70% DMSO 生理鹽水），對照組小鼠腹腔注射同體積 DMSO 生理鹽水溶液。第 8 天，對兩組小鼠進行安樂死處理，取各組織約 20 mg并研磨成蛋白溶液，通過 Click 反應后，進行 Western blot分析 Ac4ManNAl 對各組織中的聚糖標記情況。

2 結果

2.1 Ac4ManNAl 在細胞代謝標記的濃度梯度

以 HeLa 細胞作為研究對象，分別將終濃度為0、25、50、100、200、500 μmol/L 的Ac4ManNAl探針與細胞共培養(yǎng) 24 h。棄去培養(yǎng)基用 PBS 洗一次，加入 200 μl 細胞裂解液收集細胞于 1.5 ml 離心管中，于 4 ℃ 反應 30 min；BCA 進行蛋白濃度定量，取 200 μmol/L 蛋白進行 Click 反應，最后經(jīng) Western blot 分析（圖2）。結果表明，隨著濃度的增加，代謝標記信號隨之增強，提示Ac4ManNAl 探針對細胞的標記具有濃度依賴性，而且當濃度達到 100 μmol/L 時就已經(jīng)具有很強的標記效果。

圖2 不同濃度 Ac4ManNAl 在 HeLa 細胞中代謝標記效果Figure 2 Various concentrations of Ac4ManNAl metabolic labeling in HeLa cells

2.2 Ac4ManNAl 代謝標記的時間梯度變化

將 200 μmol/L Ac4ManNAl 與 HeLa 細胞共培養(yǎng) 0、6、12、24、36、48 h 六個時間段，收取并裂解細胞，蛋白定量后，進行 Click 反應。經(jīng)Western blot 分析，如圖3 所示，隨著孵育時間的增加，代謝標記信號隨之增強，且 24 h 時標記信號可以達到峰值，表明 24 h 為此探針的最佳標記時間，延長培養(yǎng)時間并不會有標記效果的提升。

圖3 Ac4ManNAl（200 μmol/L）在 HeLa 細胞代謝標記的時間依賴性Figure 3 Ac4ManNAl (200 μmol/L) metabolic labeling in HeLa cells cultured with different time lengths

2.3 Ac4ManNAl 對多種細胞的標記

為了探究 Ac4ManNAl 在不同細胞的標記效率，選取人肺腺癌細胞系 A549、H1299、人腎上皮細胞系 HEK293T、人宮頸癌細胞系 HeLa 細胞和小鼠肺癌細胞系 LLC-LUC 細胞、人結腸腺癌細胞系 SW1116 共六種細胞系與 200 μmol/L 終濃度的 Ac4ManNAl 共培養(yǎng) 24 h。并通過 Western blot分析，評價其在不同細胞系中的標記差異。如圖4所示，Ac4ManNAl 對六種細胞均有不同程度的標記效果，證明此探針具有多樣性，且根據(jù)細胞類型的不同又具有不同程度的標記效果，提示針對不同類型的細胞選取適合的探針進行相關蛋白標記研究。

圖4 Ac4ManNAl 在六種不同細胞系的代謝標記效果Figure 4 Ac4ManNAl metabolic labeling in a range of mammal cell lines

2.4 Ac4ManNAl 在小鼠體內(nèi)代謝標記效果

小鼠體內(nèi)評價了 Ac4ManNAl 代謝標記效果。首先，將小鼠分為對照組和實驗組，每組 2 只；實驗組連續(xù) 7 d 進行腹腔注射 200 μl Ac4ManNAl（300 mg/kg，溶于 70% DMSO 生理鹽水），對照組小鼠腹腔注射同體積 DMSO 生理鹽水溶液。第 8 天，將兩只小鼠進行安樂死處理，隨后取其心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟以及直腸組織，經(jīng)研磨離心獲取蛋白，BCA 蛋白定量后，每組取 200 μg蛋白，經(jīng) Click 反應后，進行 Western blot 分析，評價 Ac4ManNAl 在小鼠體內(nèi)對各組織的標記情況。結果如圖5 所示，Ac4ManNAl 對六種組織器官均能具有明顯的標記效果，證明此探針可以很好地用于體內(nèi)活體組織標記；而在肝臟和腎臟組織中，標記效果不太明顯，推測其原因可能是由于組織中自身存在較高水平的生物素。為了驗證這情況，選取肝臟和腎臟兩種組織蛋白不經(jīng)過 Click 反應，直接進行 Western blot 驗證，可以觀察到肝臟和腎臟本身就具有較高水平生物素的表達，此結果與查詢的文獻[25]相符。

圖5 Ac4ManNAl 在小鼠體內(nèi)的代謝標記Figure 5 Ac4ManNAl metabolic labeling in vivo

3 討論

核酸、蛋白、糖以及脂類是哺乳動物細胞中的四類生物大分子，其中聚糖廣泛存在于已知所有的生物體中，從低等的微生物到高等的人類都存在著各種糖基化修飾。已知在哺乳動物細胞膜表面存在著大量唾液酸，其對細胞的物理、化學性質(zhì)、生理及病理功能都具有不可缺少的關鍵調(diào)節(jié)作用，并且由于唾液酸化聚糖在神經(jīng)功能、免疫調(diào)節(jié)功能、腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮著重要功能，以非天然糖代謝標記策略為代表的化學生物學方法實現(xiàn)了唾液酸聚糖的成像和蛋白組學分析，新的合成策略為獲取結構準確的天然糖類化合物進行功能研究開辟了新方向，非天然糖代謝標記技術將在解決相關生物學問題中得到更加廣泛的應用。與疊氮基團類似，炔基是一個體積微小的、惰性的生物正交基團，同樣可以通過點擊化學進行選擇性地標記。鑒于過去已經(jīng)成功地將疊氮化糖類似物加入細胞表面的唾液酸聚糖中，炔基糖也同樣可以被這些復雜的天然糖代謝途徑接受；另外當用流式細胞術監(jiān)測細胞結合時，相對于疊氮基團，炔基糖的毒性更小，產(chǎn)生更高的信號，背景更少[26]；除此之外，炔基生物正交基團的拉曼信號位于細胞拉曼光譜的“靜默區(qū)”，因此可以應用拉曼光譜對帶有炔基的非天然糖進行成像，而無需進行生物正交反應[27]。

總之，本文運用炔基唾液酸聚糖類似物Ac4ManNAl，可以通過唾液酸代謝途徑高效地代謝到細胞表面唾液酸聚糖中，而且我們的工作也證明了其對多種細胞系均有明顯的標記效果，體內(nèi)實驗也可以對多種組織器官進行活體標記，對我們后續(xù)的腫瘤細胞的唾液酸蛋白的研究以及腫瘤靶向治療提供一個切實可用的小分子工具。眾所周知，唾液酸糖基化蛋白的合成和修飾的失調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展息息相關[6]，雖然已報道一些表位，但還有許多其他尚未確認的唾液酸聚糖位點和變化，對這些聚糖的研究，一直以來困難重重。識別這些與糖相關的生物標記物和治療干預的靶點是現(xiàn)階段研究的關鍵目標之一。本文所研究的Ac4ManNAl 為唾液酸代謝標記相關疾病的研究提供了新的研究工具。