孫曉萌

高分子的生物合成受到許多因素的影響[1-3]，然而實(shí)現(xiàn)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)控制才是大分子研究領(lǐng)域的最大挑戰(zhàn)。近年來，研究者通過蛋白質(zhì)骨架應(yīng)用、化學(xué)交聯(lián)及基因融合等技術(shù)構(gòu)建了多個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合體[4-5]，但是上述組裝模塊存在許多問題，如引入半胱氨酸殘基造成二硫鍵干擾、蛋白載體局限等。隨后在探索和發(fā)掘新型模塊化組裝技術(shù)過程中研究者發(fā)現(xiàn)基于異肽鍵的 SpyCatcher-SpyTag 共價(jià)偶聯(lián)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)控制[6]。構(gòu)建穩(wěn)定且具有普適性的異肽鍵系統(tǒng)在大分子拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)精準(zhǔn)控制領(lǐng)域具有重要意義。

1 異肽鍵

肽鍵是指一分子氨基酸的 α-羧基和另一分子氨基酸的α-氨基脫水縮合形成的酰胺鍵，是蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。該反應(yīng)由核糖體催化完成并由 DNA 遺傳序列定義。然而，少數(shù)蛋白質(zhì)含有第二類肽鍵，稱為異肽鍵。它是指蛋白質(zhì)序列中氨基酸之間至少有一個(gè)非 α 位的氨基或羧基參與而形成的不可逆的酰胺鍵。作為酰胺鍵，該共價(jià)鍵也具有良好的穩(wěn)定性且廣泛存在于革蘭氏陽性菌的菌毛蛋白中[7]。近年來，人們利用異肽鍵作為分子粘合劑在疫苗合成、細(xì)菌納米生物反應(yīng)器以及蛋白質(zhì)水凝膠等領(lǐng)域開展了一系列研究工作。

人們最早在豬糞分離出的 HK97 噬菌體衣殼蛋白組裝過程中發(fā)現(xiàn)氨基酸之間可以自發(fā)形成異肽鍵[8]，而后又在化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）菌毛蛋白中再次得以驗(yàn)證[9]。隨著研究的不斷深入，人們總結(jié)出：在目前已知細(xì)菌中，異肽鍵常見于革蘭氏陽性菌；異肽鍵主要存在于兩大類成分中——微生物表面成分識別黏附基質(zhì)分子（microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules，MSCRAMMs）和菌毛[10]。在這些 MSCRAMMs 和菌毛中，異肽鍵不斷地自發(fā)形成，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)和菌毛的穩(wěn)定性。

異肽鍵的形成可以分為脫氨和脫水兩種形式。賴氨酸在谷氨酸催化下親核攻擊天冬酰胺，該過程釋放一分子氨并自發(fā)形成異肽鍵[9]。與此類似，賴氨酸在谷氨酸參與下親核攻擊天冬氨酸，通過釋放一分子水形成酰胺鍵[11]（圖1）。

圖1 異肽鍵形成機(jī)制[12]

2 SpyCatcher-SpyTag 系統(tǒng)

源于化膿性鏈球菌黏連蛋白 FbaB 中 CnaB2 結(jié)構(gòu)域的 SpyCatcher-SpyTag 模體可形成穩(wěn)定且特異的酰胺鍵，為模塊化蛋白質(zhì)的構(gòu)建提供了基礎(chǔ)[13-14]。CnaB2 結(jié)構(gòu)域被分為兩個(gè)部分：較大的、不完整的、由 138 個(gè)殘基（15 kD）組成的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（稱為 SpyCatcher）和一個(gè)有13 個(gè)殘基的短肽（稱為 SpyTag）。SpyCatcher 包含反應(yīng)性賴氨酸和催化用谷氨酸，而 SpyTag 包含反應(yīng)性天冬氨酸，這兩個(gè)組件可以高親和力識別彼此。

另外，基于另一種革蘭氏陽性菌表面蛋白——肺炎鏈球菌的黏附素 RrgA，研究人員已經(jīng)開發(fā)出了類似的系統(tǒng)[15-16]。RrgA 的 D4 結(jié)構(gòu)域可自發(fā)形成異肽鍵。與 CnaB2 結(jié)構(gòu)域類似，該結(jié)構(gòu)域也可以分為一個(gè)大的支架蛋白（稱為SnoopCatcher）和一個(gè)只有 12 個(gè)氨基酸殘基的短肽（稱為SnoopTag）。與 SpyCatcher-SpyTag 一樣，SnoopCatcher 與SnoopTag 兩者混合后能夠迅速形成不可逆的共價(jià)鍵。然而不同的是反應(yīng)性賴氨酸存在于 SnoopTag 中，反應(yīng)性天冬氨酸存在于 SnoopCatcher 中，因而該系統(tǒng)與SpyCatcher-SpyTag 正交，即 SnoopCatcher 不與 SpyTag反應(yīng)，SpyCatcher 也不與 SnoopTag 反應(yīng)。這使得在設(shè)計(jì)一種疫苗時(shí)可同時(shí)使用這兩種系統(tǒng)，因而擴(kuò)展了模塊化多蛋白協(xié)作方式，為精準(zhǔn)設(shè)計(jì)多蛋白復(fù)合體提供了雙軌道（表1）。

表1 Catcher-Tag 系統(tǒng)氨基酸序列

2.1 SpyCatcher-SpyTag 系統(tǒng)的常規(guī)應(yīng)用

作為快速、可靠、不可逆的肽-蛋白質(zhì)偶聯(lián)工具，SpyCatcher-SpyTag 系統(tǒng)是在生物大分子研究領(lǐng)域中從藥物遞送到檢測工具、疫苗研發(fā)的理想選擇[19-21]。

2.1.1 Spy 環(huán) SpyCatcher-SpyTag 系統(tǒng)的主要應(yīng)用是形成 Spy 環(huán)（SpyRings），即通過將蛋白質(zhì)氨基酸 N 末端融合 SpyTag，C 末端融合 SpyCatcher，兩者間可自發(fā)形成共價(jià)鍵，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生環(huán)化，反之亦然。該環(huán)化過程可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)對變性的抵抗，減緩蛋白質(zhì)的降解[22]。

2.1.2 水凝膠 SpyCatcher-SpyTag 系統(tǒng)的另一個(gè)用途是工程蛋白水凝膠，如作為醫(yī)療材料人工胞外基質(zhì)、人體工程組織、細(xì)胞培養(yǎng)基等[23-25]。水凝膠是一種聚合材料，可模擬特定組織的細(xì)胞外環(huán)境，滿足生理功能與結(jié)構(gòu)要求，同時(shí)也可以作為分子傳遞的載體。研究人員利用 SpyCatcher 與聚合材料融合，再將 SpyTag 融合的蛋白與其混合即可實(shí)現(xiàn)特定微環(huán)境的模擬[26-27]。SpyCatcher-SpyTag 系統(tǒng)作為穩(wěn)定、快速的偶聯(lián)工具，可以將不同的靶分子摻入或呈遞到水凝膠中或者表面，從而避免了費(fèi)力的工程過程，實(shí)現(xiàn)了靶分子的精準(zhǔn)定位。

2.1.3 合成疫苗 將 SpyCatcher 與不動(dòng)桿菌噬菌體AP205 衣殼蛋白基因融合并在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)及組裝，組裝后 SpyCatcher 可均勻分布在病毒樣顆粒的表面。再將 SpyTag 融合外源性抗原的產(chǎn)物與病毒樣顆?；旌霞纯赏ㄟ^形成異肽鍵獲得二價(jià)或多價(jià)病毒樣顆粒[28-30]。這種蛋白質(zhì)組裝策略可有效激活免疫系統(tǒng)。此外，研究人員在個(gè)體化精準(zhǔn)治療領(lǐng)域也將異肽鍵靈活運(yùn)用于抗體標(biāo)記、示蹤、藥物遞送等，成功地實(shí)現(xiàn)了特定蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的擴(kuò)展[31]。

2.1.4 納米生物反應(yīng)器 基于 SpyCatcher-SpyTag 系統(tǒng)構(gòu)建的立體幾何規(guī)則的納米級顆粒，若在其表面融合酶等大分子可用于生物催化反應(yīng)[32]。將一種酶與 SpyCatcher 進(jìn)行重組，并與連接在大腸桿菌膜上的 SpyTag 混合可自發(fā)形成異肽鍵。這樣酶即固定在大腸桿菌上形成了穩(wěn)定的功能性生物膜結(jié)構(gòu)[33]。這種帶有某種酶的改良型生物膜可以在廣泛的環(huán)境條件下維持有效活性，具有良好的延展性。

2.2 SpyCatcher-SpyTag 系統(tǒng)在細(xì)菌致病因子中的應(yīng)用

隨著對 SpyCatcher-SpyTag 系統(tǒng)研究的不斷加深，人們也將視野放寬至更廣闊的領(lǐng)域，特別是對革蘭氏陰性菌的研究。最近該系統(tǒng)被用于調(diào)查革蘭氏陰性菌的致病因子，特別是自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也被稱為 V 型分泌系統(tǒng)，是革蘭氏陰性菌分泌蛋白家族成員。該家族中許多蛋白與毒力介導(dǎo)相關(guān)[34]。

相比革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌細(xì)胞表面是以外膜（outer membrane，OM）為代表的復(fù)雜的、不對稱的脂質(zhì)雙分子層。外膜表面主要由脂多糖和外膜蛋白構(gòu)成，包含許多常見的用于黏附、遷移和分泌的致病因子，如自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素、鞭毛等[35-36]。在研究外膜蛋白的表達(dá)、分泌、遷移及相互作用時(shí)需要通過報(bào)告蛋白或其他熒光團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，然而目前該技術(shù)仍具挑戰(zhàn)。雖然可以通過基因融合的方式表達(dá)報(bào)告基因，但是許多熒光報(bào)告基因無法在細(xì)胞周質(zhì)中成熟[37]，因而基因融合表達(dá)系統(tǒng)在蛋白示蹤領(lǐng)域應(yīng)用較少。一個(gè)較為理想的方法是利用非共價(jià)鍵結(jié)合或者通過蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行定位、示蹤。然而，非共價(jià)鍵需要高親和力以使熒光標(biāo)記能夠與蛋白質(zhì)維持長時(shí)間的結(jié)合，蛋白交互作用由于占位等原因可能干擾其他外膜蛋白。為應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，研究人員采用 SpyCatcher-SpyTag 系統(tǒng)通過高特異性共價(jià)標(biāo)記外膜結(jié)合的致病因子從而發(fā)揮了探針的作用，解決了傳統(tǒng)致病因子研究中的難點(diǎn)。系統(tǒng)中 SpyTag 為線性短肽，解決了空間位阻問題，為研究蛋白質(zhì)交互作用、蛋白熒光標(biāo)記提供了優(yōu)化方案，為基于細(xì)菌致病因子開發(fā)疫苗提供了便利。

2.3 SpyCatcher-SpyTag/SnoopCatcher-SnoopTag 正交系統(tǒng)的應(yīng)用

多樣模塊化的偶聯(lián)系統(tǒng)構(gòu)建了可塑性高、時(shí)間成本低的研究工具，也為實(shí)現(xiàn)個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療提供了選擇。研究人員利用該正交系統(tǒng)在甲羥戊酸生物合成途徑中組裝了多個(gè)關(guān)鍵酶，從而極大地提高了產(chǎn)量[38]；以煙草花葉病毒（TMV）病毒樣顆粒（VLP）作為蛋白質(zhì)支架，正交反應(yīng)蛋白作為接頭模塊，在大腸桿菌中可組裝三種萜烯生物合成酶[39]。這些例子說明在多酶復(fù)合物體系中，應(yīng)用 SpyCatcher-SpyTag/SnoopCatcher-SnoopTag 正交系統(tǒng)可以協(xié)同生物合成，改善細(xì)胞內(nèi)代謝通量，并促使人們獲得更高產(chǎn)品產(chǎn)量。

2.4 SpyCatcher-SpyTag/SnoopCatcher-SnoopTag 正交系統(tǒng)的優(yōu)勢

該正交系統(tǒng)最大的價(jià)值在于對蛋白質(zhì)工程中的拓?fù)湔{(diào)控。拓?fù)湓跀?shù)學(xué)上是指點(diǎn)、線和多邊形在不斷變換中所保持不變的空間性質(zhì)，而在化學(xué)領(lǐng)域中則是被用來描述分子在化學(xué)鍵不斷裂的前提下保有的原子間和肽鏈間的連接關(guān)系和空間關(guān)系。在高分子中，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)常常是調(diào)控高分子物理性能與功能的重要參數(shù)。利用異肽鍵的特異性與緊密結(jié)合的特點(diǎn)，可賦予蛋白質(zhì)特定的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，使其兼具穩(wěn)定性與生物功能。

另外，值得一提的是該系統(tǒng)將蛋白質(zhì)工程模塊化。模塊的概念從建筑學(xué)引申至生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。人們可通過模塊組合滿足定制需求，這樣就可以創(chuàng)建不同需求的生物產(chǎn)品。同時(shí)該產(chǎn)品也可基于經(jīng)驗(yàn)與相似性而進(jìn)行二次加工再利用，這大大縮減了產(chǎn)品研究的生命周期；減輕了產(chǎn)品工程復(fù)雜程度，使得 SpyCatcher-SpyTag/SnoopCatcher-SnoopTag 正交系統(tǒng)所攜帶的功能區(qū)既為整體服務(wù)，又發(fā)揮了特定靶點(diǎn)研究的作用。

相比傳統(tǒng)的 His-Tag-Ni-NTA 連接系統(tǒng)、生物素鏈霉親和素系統(tǒng)，該正交系統(tǒng)突破了底物分子大小、親和力強(qiáng)弱的限制，為基于該系統(tǒng)的偶聯(lián)工具在多個(gè)領(lǐng)域的開發(fā)與靈活應(yīng)用拓展了空間。

2.5 SpyCatcher-SpyTag/SnoopCatcher-SnoopTag 正交系統(tǒng)的劣勢

該正交系統(tǒng)相關(guān)研究仍處于初級階段，特別是對于SnoopCatcher-SnoopTag 的研究很少，可能需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。其中值得注意的是尚不清楚 SpyCatcher-SpyTag/SnoopCatcher-SnoopTag 正交系統(tǒng)本身是否會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，這限制了其在疫苗領(lǐng)域中的應(yīng)用。

3 結(jié)語

基于異肽鍵的分子偶聯(lián)系統(tǒng)具有良好的穩(wěn)定性及可操作性，在多個(gè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。其中，可修飾的SpyCatcher-SpyTag 系統(tǒng)為模塊化精準(zhǔn)控制蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，構(gòu)建多價(jià)疫苗快速生產(chǎn)體系提供了新思路。