劉慧，楊淑嬌，李玉霞

作為干細(xì)胞臨床治療最常用的細(xì)胞類型之一，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是基質(zhì)來源的成體干細(xì)胞，主要存在于骨髓、牙髓、脂肪、臍帶等結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。近年的研究發(fā)現(xiàn)，移植后的干細(xì)胞能夠成功遷移，并定向分化修補(bǔ)缺損組織的比例十分有限，且移植后產(chǎn)生治療效應(yīng)的時(shí)間與其所需的漫長的遷移分化時(shí)間不符，更支持 MSCs 通過旁分泌的機(jī)制來發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn) MSCs 的作用機(jī)制是由于其旁分泌因子和外泌體/微囊泡的作用[1]，其中可能主要由囊泡中包含的旁分泌因子介導(dǎo)[2]。細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）目前被認(rèn)為是通過生物活性脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和RNA 轉(zhuǎn)移進(jìn)行細(xì)胞間通訊的重要信使。外泌體直徑為 30 ～150 nm，當(dāng)多泡體與細(xì)胞膜融合時(shí)釋放到細(xì)胞外，外泌體富含許多生物活性分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、mRNA、轉(zhuǎn)移 RNA（tRNA）、長鏈非編碼 RNA（lncRNA）、微小 RNA（miRNA）和線粒體 DNA（mtDNA）[3]。外泌體被釋放到細(xì)胞外，可以被微環(huán)境中的靶細(xì)胞吸收，也可以通過生物體液運(yùn)送到遠(yuǎn)處[4]。

使用外泌體的優(yōu)勢在于可以避免 MSCs 的副作用，避免產(chǎn)生 MSCs 移植相關(guān)的潛在肺栓塞[5]，以及干細(xì)胞的潛在分化作用。一般認(rèn)為干細(xì)胞發(fā)揮作用，主要通過兩種途徑。第一種是細(xì)胞分化為基礎(chǔ)的治療：聯(lián)合應(yīng)用足夠數(shù)量的外源性干細(xì)胞、生物活性支架和細(xì)胞因子以達(dá)到組織的修復(fù)與再生。第二種是無細(xì)胞治療（以干細(xì)胞旁分泌外泌體為主）。細(xì)胞分泌的 EV 或者微囊泡是細(xì)胞相互交流的一種方式，作為干細(xì)胞旁分泌活動的重要方式，在組織再生中發(fā)揮重要作用。MSCs 的免疫調(diào)節(jié)作用是其獨(dú)特能力，且初步數(shù)據(jù)表明，MSC 的一些免疫調(diào)節(jié)特性能轉(zhuǎn)移到它們的外泌體中。MSCs 來源的外泌體可調(diào)控固有免疫與適應(yīng)性免疫應(yīng)答，通過抑制 T 淋巴細(xì)胞功能，降低 B 細(xì)胞活化、增殖與分泌，影響巨噬細(xì)胞分化與樹突狀細(xì)胞成熟，抑制自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒活性來發(fā)揮其免疫調(diào)控作用，從而提高M(jìn)SCs 外泌體衍生藥物遞送載體的壽命和藥物的生物利用度。而且，越來越多的證據(jù)顯示 MSC 相比其他細(xì)胞能產(chǎn)生大量的外泌體。通過測量外泌體相關(guān)蛋白 CD81 的量來評估不同細(xì)胞系中外泌體的水平，發(fā)現(xiàn) MSC 外泌體的產(chǎn)量最高，用MSCs 產(chǎn)生外泌體能降低外泌體的生產(chǎn)成本。因此 MSCs外泌體研究有望成為再生醫(yī)學(xué)治療方案的未來發(fā)展方向。

1 研究方法

對 Web of Science 核心數(shù)據(jù)庫、臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行關(guān)鍵詞的系統(tǒng)檢索，然后利用文獻(xiàn)分析軟件VOSviewer1.6.16 版本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。VOSviewer 是荷蘭萊頓大學(xué)科技研究中心開發(fā)的一款建立于可視化技術(shù)的處理文獻(xiàn)知識單元軟件，主要面向文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，對科技文獻(xiàn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化分析，以發(fā)現(xiàn)科學(xué)技術(shù)內(nèi)容的熱點(diǎn)與內(nèi)在關(guān)系，獲得可視化知識圖譜，在文獻(xiàn)數(shù)據(jù)知識圖譜系統(tǒng)分析的基礎(chǔ)上，總結(jié)關(guān)鍵領(lǐng)域文獻(xiàn)研究進(jìn)展。

2 文獻(xiàn)分析結(jié)果

截至 2020年，在 Web of Science 數(shù)據(jù)庫共檢索出1550 篇相關(guān)文獻(xiàn)，文獻(xiàn)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體相關(guān)研究文章于 2007年開始出現(xiàn)，此后呈現(xiàn)緩慢增長趨勢，并于 2017年出現(xiàn)相關(guān)文獻(xiàn)的快速增長（圖1）。其中我國以 774 篇相關(guān)文獻(xiàn)居于首位，美國以 350 篇相關(guān)文獻(xiàn)居于第二位，意大利以 103 篇文獻(xiàn)居于第三位。

圖1 2007 - 2020年間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體文獻(xiàn)發(fā)表情況

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體相關(guān)研究熱點(diǎn)主題分析

通過 VOSviewer 對間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體相關(guān)文獻(xiàn)的關(guān)鍵詞進(jìn)行分析，設(shè)定頻次大于等于 5 次為高頻關(guān)鍵詞，建立共詞矩陣并繪制關(guān)鍵詞共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖譜。從高頻關(guān)鍵詞可以看出，該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)聚集于間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的促增殖與分化、作用機(jī)制、炎癥調(diào)節(jié)、損傷修復(fù)、腫瘤之間的關(guān)系等方面（表1）。

表1 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體研究高頻關(guān)鍵詞

2.2 關(guān)鍵詞共現(xiàn)知識網(wǎng)絡(luò)

通過 VOSviewer 進(jìn)行關(guān)鍵詞共現(xiàn)聚類分析，采用聚類視圖進(jìn)行關(guān)鍵詞共現(xiàn)展示。在聚類視圖中，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表1 個(gè)關(guān)鍵詞，節(jié)點(diǎn)越大，說明該關(guān)鍵詞共現(xiàn)的頻次越高，1 個(gè)顏色代表1 個(gè)聚類，聚類是由共現(xiàn)頻次高的關(guān)鍵詞或術(shù)語構(gòu)成，圖中的連線代表連接的 2 個(gè)關(guān)鍵詞至少有 1 次共現(xiàn)在 1 篇文獻(xiàn)里，共現(xiàn)頻次越高連接線越粗。通過對間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體相關(guān)文獻(xiàn)關(guān)鍵詞共現(xiàn)分析，共有 8 個(gè)聚類（圖2，表2）。

表2 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體相關(guān)研究主題關(guān)鍵詞表

圖2 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體相關(guān)研究關(guān)鍵詞共現(xiàn)聚類圖

2.3 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體領(lǐng)域研究趨勢

間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體相關(guān)研究從 2017年進(jìn)入快速期。結(jié)合時(shí)間，從該領(lǐng)域的文獻(xiàn)關(guān)鍵詞聚類（圖3）可以看出，從 2007 - 2017年，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體領(lǐng)域開展的主要是外泌體機(jī)制方面的基礎(chǔ)研究；2017 - 2018年，主要進(jìn)行的是外泌體表達(dá)、分化、生長、再生等方面的研究，并初步開始了外泌體在疾病治療中的探索和嘗試；2018年至今，隨著對間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的了解和研究，開始了外泌體用于更多疾病治療中的探索，逐步開始了外泌體在心臟疾病、腎臟疾病、骨科疾病、炎癥等相關(guān)疾病治療中的嘗試。

圖3 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體領(lǐng)域關(guān)鍵詞共現(xiàn)聚類圖（標(biāo)簽視圖）

2.4 國家合作網(wǎng)絡(luò)

從國家合作網(wǎng)絡(luò)來看，在間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體研究方面，中國和美國合作最為密切（圖4），除此之外，中國的主要合作國家還有德國、新加坡、澳大利亞等，美國的主要合作國家還有意大利、德國、法國、澳大利亞等。

圖4 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體相關(guān)研究國家合作網(wǎng)絡(luò)

3 熱點(diǎn)研究領(lǐng)域研究現(xiàn)狀

通過主題詞、共被引聚類分析結(jié)果顯示腎臟疾病、再生修復(fù)、心臟疾病、骨科疾病、炎癥為間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體研究熱點(diǎn)領(lǐng)域。以下結(jié)合聚類節(jié)點(diǎn)文獻(xiàn)，通過腎臟疾病、傷口愈合與再生修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等領(lǐng)域進(jìn)展，以勾勒 MSCs 外泌體未來的發(fā)展。

3.1 腎臟疾病

間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在急性腎損傷和慢性腎病實(shí)驗(yàn)動物中顯示出潛在的治療效應(yīng)?；加心I缺血再灌注損傷的大鼠經(jīng)靜脈注射人臍帶源性 MSCs（huMSCs）外泌體，通過增加促血管生成因子血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)，可以增加腎毛細(xì)血管密度并減少纖維化[6]，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體減輕實(shí)驗(yàn)動物腎臟炎癥，有效降低腎靜脈中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 促炎細(xì)胞因子水平，顯示了外泌體的免疫調(diào)節(jié)潛力[7]。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體通過誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞增殖可以加速 SCID 小鼠甘油誘導(dǎo)的急性腎損傷的形態(tài)和功能恢復(fù)，并增強(qiáng)腎小管上皮細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的抵抗力[8]。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體含有胰島素樣生長因子-1 受體（IGF-1R）mRNA，促進(jìn)受損腎小管細(xì)胞的外泌體增殖和修復(fù)[9]。MSCs 的三維培養(yǎng)使外泌體獲得更高的產(chǎn)量，可以有效減輕順鉑誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷，表現(xiàn)為腎功能改善、腎小管病理變化減弱、炎癥因子減少以及 T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤受到抑制[10]。

3.2 傷口愈合和再生

間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)損傷修復(fù)、組織再生和抗衰老的能力非常顯著，MSCs 外泌體也具有類似的潛力。通過介導(dǎo)細(xì)胞之間的相互作用并刺激細(xì)胞增殖再生，MSCs 外泌體可用于治療多種疾病。例如，干細(xì)胞衍生的外泌體參與轉(zhuǎn)移miRNA 并影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)入靶細(xì)胞，可作為 miRNA治療與年齡相關(guān)的肌肉骨骼疾病[11]，可以促進(jìn)皮膚傷口愈合[12]和神經(jīng)再生[13]。MSCs 外泌體或 EVs 通過激活相關(guān)受體和通路發(fā)揮作用，MSCs 外泌體通過激活 VEGF 受體和重要的促血管生成途徑（SRC、AKT 和 ERK），從而加速后肢缺血的恢復(fù)[14]。同時(shí) MSCs 外泌體或 EV 中的mRNAs 在組織再生和年齡相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用。然而，鑒于目前對 MSCs 外泌體的認(rèn)識還不成熟，還需要進(jìn)一步的研究來探索分子機(jī)制和信號通路，MSCs 外泌體的特異性和細(xì)胞間通訊需要更深入的討論，并找出可能賦予MSCs 外泌體治療特性的差異[15]。

3.3 免疫調(diào)節(jié)

MSCs 外泌體富含 MSC 來源的生物活性分子（mRNA和 miRNA、酶、細(xì)胞因子、趨化因子、免疫調(diào)節(jié)和生長因子），可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的表型、功能、存活和歸巢[16]。MSCs外泌體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制依賴于向炎癥免疫細(xì)胞（M1 巨噬細(xì)胞、DC 和 Th1/Th17 細(xì)胞）傳遞免疫調(diào)節(jié) miRNA 和免疫調(diào)節(jié)蛋白，使其表型轉(zhuǎn)化為抗炎和免疫抑制細(xì)胞[17]。這些過程與先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞有關(guān)，其中巨噬細(xì)胞、CD4+Th1、Th17 和 Treg 細(xì)胞及其免疫調(diào)節(jié) miRNA 至關(guān)重要。相關(guān)研究顯示 MSCs 衍生的 EV 表達(dá)幾種黏附分子（CD29、CD44 和 CD73），使得它們能夠歸巢到受傷和發(fā)炎的組織。在 AKI 小鼠模型中，MSC-EVs 主要積聚在發(fā)炎的腎臟中[18]。

3.4 治療心腦血管疾病

心血管疾病是全球發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一，在臨床前研究中，MSCs 衍生的外泌體用于治療心血管疾?。–VD），例如急性心肌梗死、腦卒中、肺動脈高壓和敗血性心肌病。MSCs 來源的外泌體在心肌再生中具有治療潛力。通過防止心肌細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)缺血區(qū)域的新血管生成以及促進(jìn)心臟干細(xì)胞（CSC）的存活、血管生成能力和自我更新能力來促進(jìn)心肌再生。間充質(zhì)干細(xì)胞 MSCs 療法已被研究作為一種潛在的治療選擇，以幫助替換丟失的心肌細(xì)胞并改善心臟功能[19]。在大鼠心肌缺血損傷模型中，發(fā)現(xiàn)人臍帶 MSC-exosomes 可減少心肌細(xì)胞纖維化，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)增殖[20]。脂肪來源的 MSC（AdMSC）來源的外泌體導(dǎo)致 H9C2 細(xì)胞在體外缺氧/復(fù)氧（H/R）下的細(xì)胞活力顯著增加，并且 AdMSC 衍生的外泌體給藥保護(hù)缺血心肌免受心肌缺血再灌注的影響[21]。MSC 療法在促進(jìn)卒中恢復(fù)方面已顯示出臨床前和臨床上的成功，并且 MSC 外泌體在各種卒中恢復(fù)的臨床前模型中顯示出前景。在創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）的大鼠模型中，MSCs 外泌體的給藥已被證明可以增強(qiáng)神經(jīng)發(fā)生和血管生成，并改善空間學(xué)習(xí)和感覺運(yùn)動功能恢復(fù)[22]。使用金納米粒子作為標(biāo)記劑跟蹤鼻內(nèi)給藥外泌體的遷移和歸巢模式，發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體MSC-exo 在給藥后 96 小時(shí)內(nèi)在腦疾病病理相關(guān)的小鼠模型大腦區(qū)域中特異性靶向并積累，而在健康對照中，它們在24 小時(shí)內(nèi)顯示出彌散遷移模式和清除。病理大腦中的神經(jīng)炎癥信號與 MSC-exo 積累高度相關(guān)顯示歸巢機(jī)制是炎癥驅(qū)動[23]。

4 外泌體臨床試驗(yàn)研究

目前全球共有十余項(xiàng)外泌體臨床治療研究，目前的研究重點(diǎn)為確定最佳劑量、外泌體給藥的適當(dāng)時(shí)間窗口以及達(dá)到最大療效且無不良反應(yīng)的給藥途徑。通過臨床試驗(yàn)評估干細(xì)胞外泌體治療方法在人類疾病治療中的可行性和安全性。美國臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫（clinicaltrials.gov）共檢索出 12 項(xiàng)臨床數(shù)據(jù)（表3），其中，臨床試驗(yàn)地址在中國的有 7 項(xiàng)，美國 2 項(xiàng)，伊朗 1 項(xiàng)，埃及 1 項(xiàng)，另外 1 項(xiàng)試驗(yàn)地址不詳。在12 項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，試驗(yàn)方向主要集中于間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在阿爾茨海默病、肺部感染、急性呼吸窘迫綜合征、新冠病毒感染、干眼癥等疾病方面的治療作用。在 12 項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，申辦方/合作方為瑞金醫(yī)院/西比曼生物科技集團(tuán)占了 5 項(xiàng)，其臨床試驗(yàn)地址均為瑞金醫(yī)院，試驗(yàn)分別為間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在阿爾茨海默病、肺部感染、急性呼吸窘迫綜合征、新冠病毒感染等的效果研究。由于新冠疫情的暴發(fā)，中國和美國分別開展了間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體治療新冠病毒的臨床試驗(yàn)研究，其中，中國方面是由瑞金醫(yī)院、上海市公共衛(wèi)生臨床中心、武漢市金銀潭醫(yī)院、西比曼生物科技集團(tuán)聯(lián)合在瑞金醫(yī)院開展的臨床試驗(yàn)，美國由 AVEM HealthCare 在密森社區(qū)醫(yī)院（Mission Community Hospital）開展。

5 小結(jié)

間充質(zhì)干細(xì)胞通過其分泌的外泌體靶向組織受損細(xì)胞，恢復(fù)組織穩(wěn)態(tài)并使細(xì)胞能夠修復(fù)和再生，并具有免疫調(diào)節(jié)與炎癥抑制能力。由于間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體具有諸多優(yōu)勢，取得了很多有希望的成果并已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，未來必將在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得重大進(jìn)展。但總的來說，生物治療方案的探索還處于起步階段。目前，間充質(zhì)干細(xì)胞領(lǐng)域還存在一些瓶頸問題，如外泌體分離純化的方法尚未形成適應(yīng)于大規(guī)模藥物制劑應(yīng)用的規(guī)范方法，影響研究結(jié)果的可重復(fù)性。外泌體進(jìn)入受體細(xì)胞后的轉(zhuǎn)歸、生物分布、藥代動力學(xué)和靶向遞送器官分布的特異性以及疾病的治療機(jī)制尚未完全闡明。與單克隆抗體產(chǎn)品相比，其規(guī)模量產(chǎn)、成分異質(zhì)性、保存需要冷鏈等因素均是產(chǎn)業(yè)化發(fā)展、用于臨床標(biāo)準(zhǔn)化需要解決的問題。相信隨著個(gè)性化和精準(zhǔn)治療的推進(jìn)，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的臨床應(yīng)用也將隨著干細(xì)胞領(lǐng)域的快速發(fā)展，取得更多突破。