宋洪燕 郭 光 任鵬飛 韓建東 宮志遠

(1山東省蠶業(yè)研究所，山東煙臺 264002； 2山東省農業(yè)科學院農業(yè)資源與環(huán)境研究所，山東濟南 250100)

粗毛纖孔菌俗名粗毛黃孔菌或粗毛黃褐孔菌，按照現(xiàn)代分類系統(tǒng)該菌屬于擔子菌門(Basidiomycota)、傘菌綱(Agaricomycetes)、銹革孔菌目(Hymenochaetales)、銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)、纖孔菌屬(Inonotus)[1]。該菌以寄生為主，寄主有楊樹、水曲柳、榆樹、日本槐和桑樹等，是一種生長在溫帶的木腐菌，主要生長在活立木，偶見長于倒木上。經專家考證，粗毛纖孔菌(Inonotushispidus)即為古代中藥“桑黃”[2-3]，含有豐富的多糖、多酚、三萜以及多種活性物質[4-8]，是一種十分珍貴的藥用真菌，具有抗腫瘤[9]、降血糖[10]、降血脂[11]、抗病毒[12]、抗炎[13]、活血化瘀[14-15]、保肝[16]、免疫活性[17]、抗氧化和抑菌活性[18]等藥理作用。

食用菌母種培養(yǎng)基是實驗室及菌種生產部門保存菌種的關鍵，同時還是生產上制備原種的重要依據[19]；因此，為了明確粗毛纖孔菌生長發(fā)育的基礎，了解其營養(yǎng)特性，本試驗研究了母種培養(yǎng)基中不同碳、氮源對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響，旨在為粗毛纖孔菌的規(guī)模化、工廠化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種 粗毛纖孔菌，采自山東夏津黃河故道古桑樹群，保存于山東省蠶業(yè)研究所。

1.1.2 主要試劑 選用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉5種常用碳源，蛋白胨、酵母浸粉、牛肉粉、硫酸銨、大豆粉5種常用氮源，以及磷酸二氫鉀、硫酸鎂、瓊脂、新鮮馬鈴薯。其中，葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂，分析純，均為天津市致遠化學試劑有限公司產品；乳糖、蛋白胨、酵母浸粉、牛肉粉，生物試劑，均為北京奧博星生物技術有限公司產品；蔗糖，分析純，上海展云化工有限公司產品；瓊脂，生物試劑，天津市致遠化學試劑有限公司產品；馬鈴薯、大豆粉，均為市售成品。

1.1.3 主要儀器設備 1 000 mL、250 mL三角瓶，四川蜀牛玻璃儀器有限公司產品；直徑7 cm一次性塑料平板培養(yǎng)皿，比克曼生物科技有限公司產品；YXQ-LS-75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司產品；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，上海蘇凈實業(yè)有限公司產品；玻璃試管，四川蜀牛玻璃儀器有限公司產品；5D Mark Ⅲ佳能數碼相機，佳能(中國)有限公司產品；美的26 cm不銹鋼蒸鍋、C21-Simple103美的電磁爐，廣東美的生活電器制造有限公司產品；LQ-C5003電子天平，昆山優(yōu)科維特電子科技有限公司產品。

1.2 培養(yǎng)基的制作

1.2.1 PDA斜面培養(yǎng)基 逐一稱取去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g。將去皮馬鈴薯切小塊加蒸餾水蒸煮20～30 min，4層紗布趁熱過濾，取濾液，加入葡萄糖、瓊脂混合均勻，用1 000 mL三角瓶加蒸餾水定容至1 000 mL，攪拌均勻，倒入玻璃試管，硅膠塞封口，10支1組，用牛皮紙包裹，橡皮筋捆綁好，放入壓力蒸汽滅菌器中滅菌，溫度為121 ℃，時間為20～25 min。滅菌結束后將試管取出，傾斜45°放置制成斜面培養(yǎng)基，冷卻后待用。

1.2.2 CPDA平板培養(yǎng)基 逐一稱取去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，瓊脂20 g。蒸煮、定容按1.2.1項進行，分裝至250 mL三角瓶進行滅菌，方法同1.2.1項，滅菌結束后在無菌凈化工作臺制成平板培養(yǎng)基。

1.2.3 碳源供試平板培養(yǎng)基 蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，瓊脂20 g，待加入不同碳源滅菌、澆制，制作方法同1.2.2項。

1.2.4 氮源供試平板培養(yǎng)基 葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，瓊脂20 g，待加入不同氮源后滅菌、澆制，制作方法同1.2.2項。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化 將粗毛纖孔菌菌種從4 ℃冰箱中取出后，28 ℃下恒溫放置1 d，在無菌條件下把活化菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，28 ℃下恒溫培養(yǎng)3～4 d后挑取菌絲生長前端，轉接于CPDA平板培養(yǎng)基上，28 ℃下恒溫培養(yǎng)12 d左右，待菌絲長滿平板作為試驗種備用。

1.3.2 碳源篩選試驗 將相同質量(20 g)葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉5種碳源分別加入碳源供試培養(yǎng)基，進行碳源篩選試驗，每處理設3個重復。

1.3.3 氮源篩選試驗 將相同質量(5 g)蛋白胨、酵母浸粉、牛肉粉、硫酸銨、大豆粉5種氮源分別加入氮源供試培養(yǎng)基，進行氮源篩選試驗，每處理設3個重復。

1.3.4 接種 在無菌凈化工作臺上，用直徑5 mm的打孔器將活化后的粗毛纖孔菌菌種取相同菌齡的菌塊，每個平板培養(yǎng)基接種1塊于中心位置，用封口膜封住，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)7 d，取出，測量菌落面積，并觀察記錄菌絲生長勢。菌絲生長勢用致密、密實、細密、稀疏表示，為依次減弱順序。

1.4 數據分析

為減少測量試驗誤差，本試驗采用7日菌落生長面積代替常用的每日測量菌落直徑求平均值的方法作為分析指標。菌落面積測量采用Image J軟件分析，試驗數據采用Excel2013和SPSS20.0 軟件進行分析，多重比較采用Tukey HSD檢驗法。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響情況

從圖1和表1可以看出，在相同培養(yǎng)條件下，粗毛纖孔菌菌絲在5種碳源培養(yǎng)基上都可以生長，但菌絲生長情況存在明顯不同，各處理間差異較大，這說明粗毛纖孔菌對碳源的利用是有選擇性的。從本次試驗中得出，在相同培養(yǎng)條件下，果糖培養(yǎng)基上該菌種的菌絲生長勢最強(顏色呈淺黃色，菌絲邊緣生長整齊，菌絲致密)，7日菌落生長面積最大，達1 063.827 mm2，與葡萄糖(615.641 mm2)、蔗糖(673.514 mm2)、乳糖(130.482 mm2)、可溶性淀粉(100.517 mm2)等其他4種碳源相比呈極顯著差異。由此得出，在相同培養(yǎng)條件下，適宜粗毛纖孔菌菌絲生長的最佳碳源是果糖。

C1、C2、C3、C4、C5分別表示葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可 溶性淀粉等不同碳源培養(yǎng)基，N1、N2、N3、N4、N5分別表示 蛋白胨、酵母浸粉、牛肉粉、硫酸銨、大豆粉等不同氮源 培養(yǎng)基。圖1 不同碳源和氮源粗毛纖孔菌接種7日菌落生長圖

表1 不同碳源對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響情況

2.2 不同氮源對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響情況

從圖1和表2可以看出，在選用的5種氮源中，除大豆粉培養(yǎng)基沒有菌絲生長外，粗毛纖孔菌在其他4種氮源培養(yǎng)基上都能生長，說明粗毛纖孔菌在有機氮源和無機氮源培養(yǎng)基上均能生長，但仍存在較大差異。從本次試驗中得出，在相同培養(yǎng)條件下，粗毛纖孔菌在酵母浸粉培養(yǎng)基上菌絲生長勢最強(顏色呈奶白色，菌絲邊緣生長整齊，菌絲致密)，7日菌落生長面積最大，達1 433.617 mm2，與蛋白胨(439.455 mm2)、牛肉粉(421.839 mm2)、硫酸銨(413.320 mm2)等其他3種氮源相比呈極顯著差異。由此得出，在相同培養(yǎng)條件下，適宜粗毛纖孔菌菌絲生長的最佳氮源是酵母浸粉。

表2 不同氮源對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響情況

3 小結與討論

針對本次試驗使用的碳源和氮源，我們在實驗室常用的試劑中選擇了單糖(葡萄糖、果糖)、雙糖(蔗糖、乳糖)、多糖(可溶性淀粉)作為碳源。在碳源單因素試驗中，粗毛纖孔菌對果糖的利用成績最好，這可能與該菌株具有對單糖分解更為快速的酶和途徑有關，劉鑫等[20]對寄生棗樹的粗毛纖孔菌研究獲得相近的結果。在氮源單因素試驗中，粗毛纖孔菌對有機氮源的利用結果要好于無機氮源，這可能與有機氮源中營養(yǎng)成分比較全面，從而更有利于粗毛纖孔菌菌絲生長[21-23]有關。在評價菌絲生長勢的指標中，菌絲顏色呈現(xiàn)奶白色和淺黃色2種，宋永學等[24]試驗得出粗毛纖孔菌母種菌絲顏色在一定程度上可體現(xiàn)菌絲的活力、顏色越淺活力越強的結論，正好與本試驗吻合；因此，綜合本試驗結果得出，適宜粗毛纖孔菌菌絲生長的最佳碳源和最佳氮源分別是果糖和酵母浸粉。

本次試驗選用的碳、氮源是實驗室常用試劑，為達到試驗的客觀合理性，每種物質的添加量設計為同一水平，究竟選出的碳、氮源添加的最適量是多少，以及用此制成的母種培養(yǎng)基在進行子實體栽培時是否會出現(xiàn)極好的產量優(yōu)勢，還有待我們今后進一步研究。