張 勇 秦 鳳 張 彥 童曉琪 黃 浩 徐 浩 孫健誠 黃德輝 石 涼

(1六安市金安區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，安徽六安 237000； 2安徽省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑研究所，安徽合肥 230061)

家蠶在飼養(yǎng)過程中易受病原微生物的侵染，家蠶核型多角體病毒(BmNPV)病是養(yǎng)蠶生產(chǎn)中最嚴重的一種蠶病[1]，具有極強的傳染性和致病性，除徹底消毒和嚴格按照規(guī)范化技術(shù)飼養(yǎng)外，培育抗BmNPV家蠶品種是應(yīng)對BmNPV最經(jīng)濟有效的手段[2]。近年來，我國已先后育成多個抗BmNPV家蠶實用新品種，如華康系列品種[3-4]、華康×湘泰[5]、桂蠶N2[6]、粵蠶11號[7]等已在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。安徽省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑研究所育成的家蠶品種皖·豐×潤康也具有顯著抗BmNPV的效果，其對BmNPV多角體的半數(shù)致死濃度(LC50)值在108～1014個/mL之間(未發(fā)表)，顯著強于現(xiàn)行國家蠶品種試驗對照種秋豐×白玉。

雖然抗BmNPV家蠶新品種在對BmNPV的抗性方面得到了顯著提高，但從近年推廣區(qū)域的實際情況看，此類品種易受細菌病原危害，在高溫、多濕季節(jié)或地區(qū)尤為明顯，常常給蠶桑生產(chǎn)帶來一定損失。據(jù)報道[8]，從養(yǎng)蠶場所分離到的細菌50%對家蠶有致病力，其中80%為沙雷氏菌屬(Serratiamarcescens)，引起家蠶的靈菌敗血病。為了解細菌對抗BmNPV家蠶新品種皖·豐×潤康(一代雜交種)的致病力，以粘質(zhì)沙雷氏菌為試驗菌，以秋豐×白玉為對照家蠶品種，于2021年夏季開展梯度濃度的粘質(zhì)沙雷氏菌懸液經(jīng)體壁穿刺接種試驗，調(diào)查了2個家蠶品種的半數(shù)致死時間(LT50)，以期為抗BmNPV家蠶品種對細菌病的抗性提供相關(guān)信息與借鑒資料，為蠶業(yè)生產(chǎn)中合理飼養(yǎng)抗BmNPV家蠶品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試家蠶品種 抗BmNPV家蠶品種：皖·豐×潤康，由安徽省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑研究所家蠶研究室提供；對照家蠶品種：秋豐×白玉，由浙江省蠶種質(zhì)量檢驗檢疫站提供。2個品種的家蠶正反交均由6個蛾區(qū)混合收蟻，常規(guī)催青，正常條件下普通桑葉育飼養(yǎng)至4齡眠，5齡起蠶后供LT50測定試驗用。

1.1.2 主要試劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，南京樂診生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；細菌基因組DNA快速抽提試劑盒，生工生物工程(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 家蠶粘質(zhì)沙雷氏菌株的分離和純化 蠶室內(nèi)采集到自然感染靈菌敗血病的病蠶，先用75%的酒精將蠶體表面消毒，在無菌條件下，用昆蟲針刺破其體壁，無菌環(huán)沾取體液，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線，于28 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落。將純化后的粘質(zhì)沙雷氏菌株，挑取單菌落制成菌懸液，重復(fù)感染健康5齡起蠶，收集死亡癥狀相同的家蠶個體，按前述方法進行粘質(zhì)沙雷氏菌的再分離，保留并培養(yǎng)特征完全相同的菌株，即得到純化的家蠶粘質(zhì)沙雷氏菌株。

1.2.2 粘質(zhì)沙雷氏菌的分子鑒定 為進一步確定得到菌株的種屬，利用16S rDNA方法對其進行鑒定。用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取分離菌株的基因組。設(shè)計16S rDNA通用引物，上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，下游引物1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性5 min，96 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，16 ℃終止反應(yīng)。取3 μL的PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠檢測，PCR產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結(jié)果在NCBI進行Blast比對鑒定菌株。

1.2.3 菌液的制備 將分離純化后的家蠶粘質(zhì)沙雷氏菌株用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取單菌落制成菌懸液，采用平板菌落計數(shù)法[9]計算菌懸液濃度，用無菌水稀釋成1×107、1×106、1×105cfu/mL等3個試驗所需的濃度梯度菌液。

1.2.4 粘質(zhì)沙雷氏菌對家蠶不同品種的致病力測定 將粘質(zhì)沙雷氏菌懸液每個濃度設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)30頭5齡起蠶，采用體壁穿刺法接種[10]，試驗組每只家蠶經(jīng)體壁用微量注射器注射接種1 μL菌液，對照組每只家蠶從體壁注射接種1 μL無菌水。接種后所有家蠶均用正常桑葉在24 ℃下飼養(yǎng)，連續(xù)觀察24 h，每1 h定時記錄家蠶幼蟲的死亡頭數(shù)，并將死亡的蠶體挑出單獨放置，觀察是否為靈菌敗血病感染致死。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，建立直線回歸模型，計算LT50，以LT50為判斷粘質(zhì)沙雷氏菌對不同品種之間致病力強弱的指標。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的分子鑒定

該菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形的紅色菌落，菌落邊緣整齊、濕潤。分離得到粘質(zhì)沙雷氏菌的PCR產(chǎn)物，測得序列為1 477 bp，對結(jié)果進行NCBI-blast，對BLAST結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)分離菌株16S rDNA序列與Serratiamarcescensstrain S7.1 chromosome親源關(guān)系最近，其相似性達到100%，綜合其生物學特征，分離菌株被鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。

2.2 不同家蠶品種注射不同濃度的粘質(zhì)沙雷氏菌懸液后的發(fā)病情況

注射粘質(zhì)沙雷氏菌懸液后，不同濃度菌液均引起2個品種的家蠶快速發(fā)病死亡，而注射無菌水的對照組均未發(fā)病。發(fā)病初期蠶體僵硬、胸部膨大，蠶體縮短，吐出腸液，死亡，幾個小時后皮膚松弛，病蠶尸體逐漸軟化全身變成紅色。粘質(zhì)沙雷氏菌對2個家蠶品種5齡幼蟲均有較強的致病力，隨著粘質(zhì)沙雷氏菌菌液濃度的增加，對家蠶的致病力逐漸增強，以1×107cfu/mL濃度下的致病力最強，致死時間最短，皖·豐×潤康正反交平均最早在注射后13.0 h發(fā)生死亡，而秋豐×白玉正反交平均時間為13.5 h。

2.3 粘質(zhì)沙雷氏菌對皖·豐×潤康的致病力

從表1可以看出，隨著粘質(zhì)沙雷氏菌菌液濃度的降低，其對皖·豐×潤康和秋豐×白玉的致病力均逐漸減弱，LT50逐漸延長。其中以1×107cfu/mL濃度的致病力最強，其對皖·豐×潤康正反交幼蟲的LT50分別為15.6 h和14.4 h，對秋豐×白玉正反交幼蟲的LT50分別為16.2 h和15.7 h；以1×105cfu/mL濃度的致病力最弱，對皖·豐×潤康正反交幼蟲的LT50分別為16.9 h和16.0 h，對秋豐×白玉正反交幼蟲的LT50分別為17.0 h和16.9 h；1×106cfu/mL濃度的致病力介于1×107和1×105cfu/mL之間，對皖·豐×潤康正反交幼蟲的LT50分別為16.2 h和15.5 h，對秋豐×白玉正反交幼蟲的LT50分別為16.4 h和16.2 h。粘質(zhì)沙雷氏菌對皖·豐×潤康和秋豐×白玉正反交之間的致病力略有差異，同一濃度下，反交的LT50均短于正交。另外，感染同一濃度粘質(zhì)沙雷氏菌后，抗BmNPV家蠶品種皖·豐×潤康正反交的LT50平均比對照家蠶品種秋豐×白玉正反交的LT50縮短0.6 h，說明抗BmNPV家蠶品種皖·豐×潤康對抵御粘質(zhì)沙雷氏菌沒有優(yōu)勢。

表1 粘質(zhì)沙雷氏菌對皖·豐×潤康正反交的半數(shù)致死時間(LT50)

3 討論

沙雷氏菌屬是養(yǎng)蠶環(huán)境中廣泛存在，同時具有較強致病力的一種病原菌。本研究結(jié)果表明，抗BmNPV家蠶實用新品種皖·豐×潤康正反交在粘質(zhì)沙雷氏菌菌液濃度為1×107cfu/mL時LT50最短為15.6 h和14.4 h，在菌液濃度為1×105cfu/mL時LT50最長為16.9 h和16.0 h；粘質(zhì)沙雷氏菌對秋豐×白玉的致病力作用出現(xiàn)相同的趨勢，在相同濃度下抗BmNPV家蠶品種皖·豐×潤康正反交的LT50平均比對照家蠶品種秋豐×白玉正反交的LT50短0.6 h，說明抗BmNPV家蠶品種皖·豐×潤康對細菌病更加敏感，對抵御粘質(zhì)沙雷氏菌沒有優(yōu)勢。

BmNPV病毒的感染取決于宿主和環(huán)境之間的相互作用，宿主因素包括家蠶自身抗性的差異和免疫調(diào)節(jié)機制，調(diào)節(jié)抗病毒免疫反應(yīng)，決定病毒的清除和傳播。有研究表明[11]，細菌及其產(chǎn)物會對病毒的穩(wěn)定性和傳染性產(chǎn)生不利影響。通過小鼠糞便移植將分節(jié)絲狀菌轉(zhuǎn)移至易感動物體內(nèi)，可以保護易感動物免受甲型流感病毒(Influenza A virus)、水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)和呼腸孤病毒(Reovirus)的感染[12]。Surfacetin是枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的一種具有膜破壞特性的環(huán)狀脂肽，可破壞冠狀病毒粒子的完整性[13]，并損害幾種包膜病毒的傳染性，包括基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)、杜貝病毒(Dugbe virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、甲型流感病毒、馬雅羅病毒(Mayaro virus)、尼帕病毒(Nipah virus)、烏納病毒(Una virus)和寨卡病毒(Zika virus)[14]，但抗病毒宿主影響細菌的傳染力相關(guān)文獻在國內(nèi)外還未見報道。

家蠶品種間對BmNPV抵抗性存在顯著差異，可以利用高抗BmNPV的品種資源，通過雜交、回交等技術(shù)手段，將抗BmNPV基因?qū)雽嵱眯曰A(chǔ)品種中，培育出抗BmNPV生產(chǎn)實用新品種。隨著我國經(jīng)濟快速發(fā)展和蠶業(yè)生產(chǎn)方式的根本性變化，養(yǎng)蠶從業(yè)人員老齡化成為普遍現(xiàn)象；新型蠶業(yè)經(jīng)營主體發(fā)展迅猛，輕簡化、規(guī)?；B(yǎng)蠶在一定程度上帶來蠶病高發(fā)的風險，也對家蠶品種的抗病、抗逆性提出更高要求，推廣抗BmNPV家蠶品種成為養(yǎng)蠶生產(chǎn)中最有效的途徑和手段，也是確保其高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要措施。因此，弄清細菌對該類品種的致病規(guī)律，對蠶病綜合防治和蠶繭高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)都有積極意義，而細菌對抗BmNPV家蠶品種致病的分子機制值得進一步研究。