翟佳麗，壩玉蓉，甘 雪，徐慧妮

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650224)

氮是植物生長和產(chǎn)量的一個(gè)重要因素，影響著植物的生物過程[1]。氮的缺乏導(dǎo)致許多植物的光合作用顯著下降，影響植物細(xì)胞分裂和生長，從而導(dǎo)致植株矮小，分支分蘗減少，葉片發(fā)黃，葉片早衰，最終導(dǎo)致產(chǎn)量減少[2]。缺氮后恢復(fù)供氮，植物生長趨向正常，但表型性狀、干物質(zhì)質(zhì)量和根系的恢復(fù)程度不同[3]。研究發(fā)現(xiàn)，玉米幼苗復(fù)氮后，根系活力有一定的恢復(fù)，但仍顯著低于正常處理[3]。冬小麥研究表明，缺氮會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)谷氨酸濃度下降，恢復(fù)供氮后其濃度回升[4]。缺氮脅迫影響了植物的正常代謝活動(dòng)，除與氮素相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)子及轉(zhuǎn)錄因子外，與植物代謝調(diào)節(jié)相關(guān)的基因也常在缺氮脅迫轉(zhuǎn)錄組中呈現(xiàn)明顯的表達(dá)變化[5-6]。研究表明，AP2/ERF、WRKY、NAC 和 MYB 等與植物非生物逆境脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子也常在缺氮條件下表達(dá)量升高[7]。

MYB(v-Myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)轉(zhuǎn)錄因子是指含有高度保守的DNA結(jié)合區(qū)-MYB結(jié)構(gòu)域的一類轉(zhuǎn)錄因子，是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[8-9]。MYB 轉(zhuǎn)錄因子在植物整個(gè)生長發(fā)育、次生產(chǎn)物代謝、生物和非生物脅迫應(yīng)答等方面都起著至關(guān)重要的作用[10]。依據(jù)MYB基序重復(fù)種類和數(shù)目的不同，將整個(gè)MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族分為四類：4R-MYB、3R-MYB、1R-MYB/MYB-related、R2R3-MYB[11]，且R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中數(shù)目最多的一類，具有廣泛的生物活性，參與植物體內(nèi)的各種生理生化活動(dòng)[12]。研究表明MYB通過直接靶向結(jié)合相關(guān)代謝酶基因的啟動(dòng)子調(diào)控其表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)類黃酮[13]、木質(zhì)素[14]、黃酮醇[15]、花青素和原花色素[16]、苯丙酸代謝[17]、纖維素[18]等次生產(chǎn)物代謝的調(diào)控。此外，MYB轉(zhuǎn)錄因子(尤其R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子)通過直接或間接調(diào)控下游逆境相關(guān)基因的表達(dá)來增強(qiáng)或減弱植物對(duì)逆境的適應(yīng)性。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtMYB20的過表達(dá)植株在鹽脅迫下表現(xiàn)出更高的抗性[19]；大豆R2R3-MYB基因GmMYB68的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽堿脅迫的抗性增強(qiáng)[20]，其轉(zhuǎn)錄因子GmMYB101在氮代謝調(diào)節(jié)中起重要作用[21]；谷子MYB類轉(zhuǎn)錄因子SiMYB42基因可以調(diào)控下游硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)影響植物低氮脅迫耐性[22]。

番茄R2R3-MYB基因家族中有121個(gè)成員，在應(yīng)答非生物脅迫和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮主要作用[23]。SlMYB49可以提高干旱和鹽脅迫的抗性[24]，SlMYB102可以提高轉(zhuǎn)基因番茄的鹽脅迫抗性[8]，而番茄SlMYB86在缺氮脅迫下功能和作用機(jī)制還未見報(bào)道。本研究克隆了番茄轉(zhuǎn)錄因子SlMYB86基因，通過qRT-PCR分析缺氮脅迫下SlMYB86表達(dá)，并對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行原核表達(dá)分析，用Western blot驗(yàn)證SlMYB86對(duì)缺氮脅迫的應(yīng)答，為后續(xù)生物學(xué)功能和分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理

實(shí)驗(yàn)材料為番茄(SolanumlycopersicumL.)品種‘黃果’自交系，于本實(shí)驗(yàn)室保存。挑選顆粒飽滿的番茄種子，用50 ℃的無菌水浸泡30 min，將種子鋪于濕潤的濾紙上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱催芽48 h左右，待種子大部分露白后播種于蛭石中。待幼苗生長到一片真葉，將表型一致的幼苗移栽到盆中，當(dāng)幼苗處于三葉期時(shí)開始缺氮處理。番茄幼苗于缺氮營養(yǎng)液中處理2 d，之后將番茄幼苗轉(zhuǎn)移到含有10 mmol/L NO3-正常氮營養(yǎng)液中(CK，含有2.5 mmol/L硝酸鈣和5 mmol/L硝酸鉀)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置6個(gè)處理：(1)正常處理(CK)；(2)缺氮6 h(-N 6 h)；(3)缺氮24 h(-N 24 h)；(4)缺氮2 d(-N 2 d)；(5)缺氮復(fù)氮6 h(-N+N 6 h)；(6)缺氮復(fù)氮24 h(-N+N 24 h)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將不同處理后番茄幼苗的根、葉立即在液氮中冷凍，并儲(chǔ)存在-80 ℃。實(shí)驗(yàn)在昆明理工大學(xué)溫室自然條件下進(jìn)行，白天氣溫23～28 ℃，夜間13～18 ℃。

1.2 方 法

1.2.1 番茄SlMYB86的生物信息學(xué)分析從Sol Genomics Network、Plant Transcription Factor Database、NCBI 網(wǎng)站下載R2R3-MYB類的番茄(SolanumlycopersicumL.)、擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、黃瓜(CucumissativusL.)的蛋白質(zhì)序列，使用 MEGA 7.0 軟件對(duì)MYB蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Boot-strap設(shè)置1 000 次，使用Jalview 2.9.0.1軟件對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)與分析，使用TBtools 1.09852軟件對(duì)SlMYB86轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.2.2 qRT-PCR分析使用Trizol試劑(TaKaRa)從番茄葉片及根部提取總RNA。利用Yeasen公司的Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用 Hifair?qPCR SYBR?Green Master Mix試劑盒進(jìn)行mRNA表達(dá)水平分析。使用CFX96實(shí)時(shí)PCR機(jī)(Bio-Rad，美國)進(jìn)行qRT-PCR，基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算用2-ΔΔCT法。

1.2.3SlMYB86原核表達(dá)載體構(gòu)建通過Sol Genomics Network 查找SlMYB86的cDNA序列(Solyc02g082040.2.1)，SlMYB86的編碼框大小為975 bp。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)帶有pET-28a接頭的特異性引物SlMYB86-EcoRⅠ-F(CGCGGATCCGAAT-TCATGGGTCATCACTGCTGC)和SlMYB86-HindⅢ-R(TGCGGCCGCAAGCTTACAATCCCATGCAAGT)，利用Trizol法提取番茄總 RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用cDNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增得到SlMYB86的編碼區(qū)，通過同源重組的方法，將SlMYB86重組到pET-28a載體中，挑取陽性菌落，進(jìn)行PCR及測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 SlMYB86重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)使用DNAMAN軟件分析，SlMYB86蛋白相對(duì)分子量大約為37.089 kD，pET-28a載體所帶的His標(biāo)簽加上SlMYB86蛋白后，大小約為41 kD。將測(cè)序成功的SlMYB86原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入E.coliBL21表達(dá)菌株，接種到含有卡那霉素(50 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜活化。將活化菌液再以1∶100比例接種到20 mL LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.5～0.8。加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG，分別于37 ℃、28 ℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，取0、2、4、6和8 h后的菌液各2 mL，12 000 r/min離心1 min，收集菌體，用1×TBS洗2次，最后菌體沉淀用100 μL的2×蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液重懸，沸水浴煮10 min，冷卻后進(jìn)行SDS-PAGE分析，選取最佳誘導(dǎo)條件。

1.2.5 SlMYB86蛋白純化及抗體制備培養(yǎng)pET-28a-SlMYB86菌液，使其OD值在0.5～0.8，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。將1 mL細(xì)菌培養(yǎng)物10 000 g離心2 min，棄上清液。將細(xì)胞沉淀于-70 ℃冷凍5 min，通過反復(fù)凍融使細(xì)菌菌株實(shí)現(xiàn)最大程度的裂解。使用Promega公司的MagneHisTMProtein Purifi cation System(V8550)進(jìn)行蛋白純化。將所純化的蛋白1∶1加入2×蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液(含有β-巰基乙醇)，沸水浴10 min使蛋白變性，冷卻后立即上樣，通過SDS-PAGE分析樣品。用純化得到的融合蛋白為抗原，定期免疫昆明小鼠，通過眼球取血獲得抗血清。

1.2.6 Western blot分析SDS-PAGE后，將蛋白膠于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡平衡15 min，裁取8.5 cm × 5.0 cm的 PVDF膜，置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15 min。按照自上而下濾紙-凝膠-膜-濾紙的順序平鋪于轉(zhuǎn)膜儀上，30V，200 mA，轉(zhuǎn)膜 1.5 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用20 mL TBST洗10 min，隨后將膜放置于封閉緩沖液(含 5% 脫脂牛奶的 TBST)中室溫孵育封閉2 h。用20 mL TBST 洗3次，每次10 min。按1∶5 000 的比例加入一抗，4 ℃ 過夜孵育。用20 mL TBST洗3次后按1∶5 000的比例加入山羊抗小鼠二抗，室溫孵育1 h后用 TBST洗 3 次，使用蛋白顯影液檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄SlMYB86生物信息學(xué)分析

番茄SlMYB86和其他物種MYB轉(zhuǎn)錄因子聚類分析結(jié)果表明，番茄SlMYB86與番茄SlMYB26在進(jìn)化樹上屬于同一分支，親緣關(guān)系較近(圖1，A)。番茄MYB保守域序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，番茄R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子含有2個(gè)MYB基序，R2保守域中有3個(gè)保守的色氨酸殘基，R3保守域中第一個(gè)色氨酸殘基被苯丙氨酸所替代且含有2個(gè)色氨酸殘基(圖1，B)。對(duì)SlMYB86轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，目的基因N端含有2個(gè)Myb_DNA-binding保守結(jié)構(gòu)域，與R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子特征一致，表明SlMYB86轉(zhuǎn)錄因子屬于R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子(圖1，C)。

2.2 缺氮脅迫下番茄幼苗SlMYB86基因的表達(dá)

圖2結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，隨著缺氮時(shí)間的增加，番茄幼苗根與葉中SlMYB86的表達(dá)量逐漸增加，在缺氮2 d時(shí)，番茄幼苗根與葉中SlMYB86的表達(dá)量約為對(duì)照組的12.6和16.5倍。在缺氮處理后對(duì)番茄幼苗進(jìn)行了復(fù)氮處理，復(fù)氮處理6 h時(shí)，番茄幼苗根與葉中SlMYB86的表達(dá)量開始下降，與缺氧 2 d相比分別下降了25.2%和38.9%。以上結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，缺氮條件下番茄幼苗根與葉中SlMYB86的表達(dá)量顯著增加，SlMYB86基因在缺氮條件下被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，說明SlMYB86基因參與了缺氮脅迫應(yīng)答。

2.3 pET-28a-SlMYB86原核表達(dá)載體構(gòu)建

通過RT-PCR擴(kuò)增SlMYB86基因編碼框，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為975 bp(圖3，A)，與預(yù)期大小相符，且無雜帶，特異性強(qiáng)，將目的片段回收純化。通過同源重組的方法，將目的片段連接到EcoRⅠ和Hind Ⅲ 酶切回收后的原核表達(dá)載體pET-28a上，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5a，獲得pET-28a-SlMYB86原核表達(dá)載體。挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為975 bp(圖3，B)，與預(yù)期大小相符。將陽性克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與序列一致，表明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為pET-28a-SlMYB86。

2.4 pET-28a-SlMYB86的誘導(dǎo)和表達(dá)

pET-28a-SlMYB86使用0.5 mmol/L的IPTG，分別于28和 37 ℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，SlMYB86蛋白在28 和37 ℃條件下，隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加蛋白表達(dá)量也增加，且37 ℃下蛋白表達(dá)量明顯高于28 ℃。綜上，SlMYB86重組蛋白在大腸桿菌E.coliBL21菌株中的最佳誘導(dǎo)條件為：IPTG濃度0.5 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為 8 h。

2.5 SlMYB86蛋白純化及Western blot分析

在最佳誘導(dǎo)條件下對(duì)SlMYB86蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)純化，并對(duì)上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)(圖5，A)，在細(xì)胞裂解液、流穿液中沒有得到純化蛋白，在洗脫液中成功檢測(cè)到目的條帶，且條帶單一，蛋白大小約為41 kD，與預(yù)期大小相符，表明在洗脫液中成功獲得了SlMYB86蛋白。SDS-PAGE后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用His抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在約 41 kD 位置出現(xiàn)一條明顯的蛋白純化條帶(圖5，B)，表明獲得了較高純度的SlMYB86原核蛋白，純化蛋白將用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.6 缺氮及復(fù)氮條件下番茄幼苗SlMYB86蛋白的表達(dá)量

利用SlMYB86抗體進(jìn)行Western blot分析發(fā)現(xiàn)，SlMYB86蛋白隨著缺氮時(shí)間的延長表達(dá)量增加(圖6，A)；在缺氮2 d時(shí)，與CK組相比SlMYB86蛋白表達(dá)量達(dá)到最大。與缺氮2 d相比，復(fù)氮6 和24 h條件下，SlMYB86蛋白表達(dá)量有所減少(圖6，B)，Western blot檢測(cè)結(jié)果與qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果規(guī)律保持一致。結(jié)果表明，SlMYB86參與了缺氮脅迫應(yīng)答，且SlMYB86蛋白在缺氮脅迫后表達(dá)量顯著增加。

3 討 論

在擬南芥、煙草、小麥、蕎麥、水稻和玉米等[25-28]植物中分離并克隆得到很多MYB 基因。1996年，Lin等[29]首次在番茄上克隆獲得14個(gè)MYB相關(guān)基因片段。2003年，蔡新忠等[30]以煙草MYBl中MYB保守區(qū)域編碼序列中的2個(gè)特異性序列為引物，在番茄中擴(kuò)增兩個(gè)長度為215 bp的MYB基因片段LeMYB1和LeMYB2，在植物過敏性反應(yīng)和抗病性產(chǎn)生中起重要調(diào)節(jié)作用。2011年，張欣等[31]從番茄中分離得到一個(gè)MYB類新基因SlCMYB1，為典型的R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子，定位在細(xì)胞核中，在高溫、干旱、鹽和脫落酸脅迫的誘導(dǎo)下，該基因的表達(dá)量有明顯的變化，將其轉(zhuǎn)入水稻中可顯著提高水稻對(duì)低溫脅迫的耐受能力。說明MYB轉(zhuǎn)錄因子在抗逆過程中起到重要的調(diào)控作用。

原核表達(dá)系統(tǒng)是目前最為成熟的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)在于成本低廉，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)獲得目的基因高效表達(dá)蛋白。這項(xiàng)技術(shù)的主要方法是將目的基因 DNA 片段，與原核表達(dá)載體進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過使用不同濃度的IPTG在不同時(shí)間及溫度下誘導(dǎo)并純化，獲得所需的目的蛋白[32]。有研究表明，0.1～1 mmol/L的 IPTG有利于重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)[33]，而低濃度的IPTG可以減少化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損傷[34]。為深入研究番茄SlMYB86在番茄中生物學(xué)功能，本研究構(gòu)建了SlMYB86基因原核表達(dá)載體pET-28a-SlMYB86，并成功在大腸桿菌E.coliBL21菌株中大量表達(dá)。通過融合蛋白攜帶的His標(biāo)簽進(jìn)行純化蛋白，免疫小白鼠制備了多克隆抗體。用Western blot證明成功獲得了SlMYB86重組蛋白。為進(jìn)一步研究SlMYB86基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

研究表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子在應(yīng)答缺氮脅迫中具有重要的作用。單細(xì)胞紅藻 MYB 轉(zhuǎn)錄因子CmMYB1 可以調(diào)節(jié)植物的氮素利用[35]。海棠花MYB 轉(zhuǎn)錄因子MsMYB10通過改變花青苷等類黃酮化合物的積累量來應(yīng)答低氮脅迫，最大程度保護(hù)機(jī)體不受損害[36]。MYB61受GRF4調(diào)控，促進(jìn)水稻氮素利用和生物量生產(chǎn)[37]。OsMYB305過表達(dá)抑制了低氮條件下纖維素的生物合成，從而釋放了碳水化合物用于硝酸鹽的吸收和同化，促進(jìn)了水稻的生長[38]。在MYB 4個(gè)亞家族中，主要是R2R3-MYB 亞族成員參與調(diào)控氮代謝吸收相關(guān)的基因的表達(dá)調(diào)控[39]。本實(shí)驗(yàn)中克隆的SlMYB86 轉(zhuǎn)錄因子也屬于R2R3-MYB 亞家族，qRT-PCR和Western blot分析表明缺氮脅迫下SlMYB86表達(dá)顯著增加，該基因參與了缺氮脅迫應(yīng)答。這為今后進(jìn)一步研究番茄MYB86在抗逆性中的功能研究提供基礎(chǔ)。