甘勇輝，李 珍，林美珍*

(1 漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品工程學(xué)院，福建漳州 363000；2 漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)系，福建漳州 363000)

蘭科(Orchidaceae)植物是被子植物中的第二大類群，約有800屬 25 000多種[1-2]。蘭科植物廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，具有豐富的多樣性[3-4]。在植物系統(tǒng)發(fā)育中，蘭科植物的進(jìn)化程度較高，尤其是花的形態(tài)和結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜[5-6]。蘭科植物的有性生殖很特殊，其雌雄配子體、胚柄和胚型呈現(xiàn)多樣性[7],但是，他們都有一個共同特征，即每朵花只有1個花藥，其中的花粉聚集成塊發(fā)育，這與其他被子植物的分散花粉有很大不同。雖然許多學(xué)者特別是國外學(xué)者對蘭科植物的花粉塊有較多研究，但對花粉塊的發(fā)育特征很少報(bào)道。

石斛是中國《神農(nóng)本草經(jīng)》文獻(xiàn)中最早記載的藥用蘭科植物之一，長期以來一直被列為中藥上品。野生石斛對于生長環(huán)境要求嚴(yán)格，適合在高溫高濕的熱帶雨林環(huán)境中生長、繁殖。鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)植物，為傳統(tǒng)名貴的中藥材，具有益胃生津，滋陰清熱，潤肺止咳，增強(qiáng)免疫活性的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)其主要成分石斛多糖及石斛堿具有增強(qiáng)免疫力、促消化、抗衰老、保肝利膽、抗風(fēng)濕、降血糖血脂、抗腫瘤等功效[8]。由于鐵皮石斛的藥用功能顯著，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，社會需求量逐年增加。在自然條件下，野生鐵皮石斛種子發(fā)芽率不超過5%[9]，主要以側(cè)芽的方式進(jìn)行繁殖，繁殖系數(shù)低。另外，人們對野生鐵皮石斛掠奪性采挖，使其野生資源日益減少，早在20世紀(jì)80年代，鐵皮石斛就被國家列為重點(diǎn)保護(hù)的珍稀瀕危藥用植物[10]。目前國內(nèi)鐵皮石斛的繁殖多數(shù)采用組培苗方法，外植體來源復(fù)雜，種源純度差，這造成了鐵皮石斛種質(zhì)嚴(yán)重退化。生產(chǎn)中迫切需要培育優(yōu)良的鐵皮石斛品種，然而鐵皮石斛的有性繁殖研究很少報(bào)道。本試驗(yàn)對鐵皮石斛雄性器官—花藥的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，探索其花藥的發(fā)育過程。

1 材料和方法

野生鐵皮石斛在中國南方花期為12月至次年春季3～4月，在花期根據(jù)花蕾的大小取不同時期的花藥固定?；ㄋ幭仍?%(v/v)戊二醛(0.1 mol/L磷酸緩沖液配制，pH 7.0)固定3 h，然后用相同緩沖液換洗3次，每次20 min。再用1%(v/v)鋨酸(0.1 mol/L磷酸緩沖液配制，pH 7.0)在室溫下固定4 h，或在4 ℃固定12 h。固定后的花藥經(jīng)過3次換洗，每次20 min，用10%～90%丙酮逐級脫水、置換、包埋在Embed 812樹脂。包埋的花藥被切成1 μm厚的半薄切片貼在載玻片上。切片采用高碘酸-席夫(Petiodic acid-shiff，PAS)反應(yīng)標(biāo)記多糖物質(zhì)，多糖和淀粉粒呈紅色。多糖染色后的切片再用蘇丹黑(Sudan Black B)復(fù)染，檢測花藥細(xì)胞中的中性脂類物質(zhì)，中性脂類物質(zhì)呈黑色；染色后的切片用Leica DMR顯微鏡觀察、拍照，為了進(jìn)一步確定減數(shù)分裂時期，用高倍鏡觀察染色體的變化，并追蹤其分布特征。

取開花時的成熟花粉塊進(jìn)行離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)基為15%蔗糖溶液附加0.01%無水氯化鈣、0.01%硼酸和0.01%磷酸二氫鉀，pH 6.5，觀察花粉管萌發(fā)情況。

2 觀察結(jié)果

2.1 鐵皮石斛花器官特征

鐵皮石斛的莖為圓柱形，不分枝，具有明顯的節(jié)?？偁罨ㄐ騻?cè)生或頂生在莖節(jié)上，具2～6朵花。開花前，花蕾的花萼合生成囊狀的萼囊，外形呈辣椒狀，綠色(圖版Ⅰ，A)。開花后，花萼變?yōu)槲辶讶~，呈黃綠色，類似花冠，花形呈海星狀(圖版Ⅰ，B)。在萼片內(nèi)為雄蕊著生的合蕊柱，其中分布一些平行排列紫色斑紋。在合蕊柱頂部兩側(cè)各具1個紫點(diǎn)，雄蕊由花藥(箭頭)和花絲組成(圖版Ⅰ，C)，且具白色藥帽。將白色藥帽(花藥壁)由基部剝離后其中的花粉塊顯露出(箭頭)(圖版Ⅰ，D)。用解剖針將花藥壁剝離后，2個花粉塊釋放出(箭頭)(圖版Ⅰ，E)。在高倍鏡下可看到由2長條形花粉塊組成。在幼期花藥的橫切圖像中，可看到縱向一半的花藥由2個藥室組成(圖版Ⅰ，F(xiàn))，但隨著花藥的發(fā)育，兩藥室之間的藥隔組織(箭頭)溶解，兩個藥室貫通，2個花粉塊粘在一起。開花時鐵皮石斛的藥帽開裂，成熟花粉塊常已彈出。因此，鐵皮石斛的雄蕊具1個花藥、4個藥室和4個花粉塊。

2.2 小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂特征

減數(shù)分裂是花粉由二倍體的孢子母細(xì)胞向單倍體雄配子體的轉(zhuǎn)變過程。鐵皮石斛花藥中央的小孢子母細(xì)胞在沒有特殊變化前兆就開始減數(shù)分裂過程，其他被子植物在減數(shù)分裂前，常在小孢子母細(xì)胞表面有1層厚厚的胼胝質(zhì)壁。但是鐵皮石斛小孢子母細(xì)胞在分裂時沒有胼胝質(zhì)壁合成，未見胼胝質(zhì)壁結(jié)構(gòu)，這時小孢子母細(xì)胞(MMC)中央出現(xiàn)顆粒狀結(jié)構(gòu)的染色體，確定其減數(shù)分裂時期(圖版Ⅰ，G)。在絨氈層和小孢子母細(xì)胞之間也沒有異常的細(xì)胞壁增厚現(xiàn)象，顯示鐵皮石斛小孢子母細(xì)胞壁的特殊性。減數(shù)分裂Ⅰ結(jié)束后，染色體移向細(xì)胞的兩極，在小孢子母細(xì)胞內(nèi)形成了二個細(xì)胞核，在二核之間沒有細(xì)胞壁的形成(圖版Ⅰ，H)。在減數(shù)分裂Ⅱ結(jié)束后，在四個細(xì)胞核之間形成細(xì)胞壁，構(gòu)成不定型的四分體(圖版Ⅰ，I)。由此可見，鐵皮石斛小孢子發(fā)生為同時型。

在減數(shù)分裂時期，花藥壁的細(xì)胞結(jié)構(gòu)沒有明顯的差異，但四層藥壁細(xì)胞已可明顯區(qū)分：由外向內(nèi)分別是1層表皮細(xì)胞、2層藥室內(nèi)壁細(xì)胞、1層中層細(xì)胞、1層絨氈層細(xì)胞(圖版Ⅰ，J)。在4層藥壁細(xì)胞中，表皮和藥室內(nèi)壁細(xì)胞已高度液泡化，細(xì)胞中的大液泡占據(jù)了大部分細(xì)胞空間，將細(xì)胞核擠到細(xì)胞周緣區(qū)域。這些細(xì)胞染色很淺。中層細(xì)胞此時的體積很小，沒有明顯的細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。藥壁最內(nèi)層為絨氈層細(xì)胞，液泡化程度低，顯示細(xì)胞質(zhì)的染色較深。小孢子母細(xì)胞時期的絨氈層細(xì)胞中沒有特殊的結(jié)構(gòu)物質(zhì)(圖版Ⅰ，J)，但在減數(shù)分裂結(jié)束后的四分體時期，絨氈層細(xì)胞中出現(xiàn)許多體積較大的脂滴(圖版Ⅰ，I)，顯示此時絨氈層細(xì)胞中活躍的脂代謝。

2.3 花粉發(fā)育特征

鐵皮石斛小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂后，形成的四個小孢子并不分開，而是以四分體(四合花粉)狀態(tài)繼續(xù)發(fā)育。與之前(圖版Ⅰ，I)相比，四個小孢子之間的細(xì)胞壁明顯增厚，但各個四分體的輪廓依然清晰。在花藥壁中，4層細(xì)胞沒有明顯的變化，絨氈層細(xì)胞中仍有一些大的脂滴分布在其外切向面，而內(nèi)切向面沒有，呈現(xiàn)出極性分布(圖版Ⅱ，A)。在小孢子時期，?？煽吹叫℃咦蛹?xì)胞核比較明顯，位于細(xì)胞中央，但核的外形不規(guī)則，有表面突起。小孢子細(xì)胞核的不規(guī)則外形是否代表了小孢子生理代謝的特異結(jié)構(gòu)需要深入研究。在鐵皮石斛小孢子發(fā)育時期，一個顯著結(jié)構(gòu)變化是在花粉塊表面開始形成了1層厚厚的花粉外壁結(jié)構(gòu)，但在花粉塊內(nèi)部，四合花粉的表面上沒有花粉外壁結(jié)構(gòu)(圖版Ⅱ，B)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的染色結(jié)果，花粉塊表面上的花粉外壁為脂質(zhì)性質(zhì)，與大多數(shù)植物的孢粉素花粉外壁性質(zhì)相同。

隨著小孢子的分裂，四合花粉塊中的花粉進(jìn)入二胞時期。小孢子分裂時染色體集中在細(xì)胞中央，并沒有呈現(xiàn)出極性分布(圖版Ⅱ，C)。然而在小孢子分裂完成后，二胞花粉則呈現(xiàn)出特異的分布：在四合花粉中，小的透鏡狀生殖細(xì)胞位于花粉的外側(cè)，而內(nèi)側(cè)絕大部分空間為大的營養(yǎng)細(xì)胞(圖版Ⅱ，D)。以后，二胞花粉中的生殖細(xì)胞一直保持在原位不變(圖版Ⅱ，E、F)。接近開花時，花藥壁的藥室內(nèi)壁細(xì)胞形成了縱向加厚的纖維壁。臨近成熟花粉中，生殖細(xì)胞仍在四合花粉的外側(cè)分布(圖版Ⅱ，G)。與其他被子植物成熟花粉中積累大量淀粉或脂滴營養(yǎng)物質(zhì)不同，鐵皮石斛成熟花粉中既沒有淀粉也沒有脂滴營養(yǎng)儲存物質(zhì)，這是鐵皮石斛花粉的一個特征。

雖然在藥室中發(fā)育花粉的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化不顯著，但藥壁絨氈層細(xì)胞發(fā)生了顯著的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。在小孢子分裂前，絨氈層細(xì)胞中出現(xiàn)較多的大脂滴；小孢子分裂后，絨氈層細(xì)胞中的脂滴明顯減少(圖版Ⅱ，C、D)。隨著花粉塊發(fā)育，絨氈層細(xì)胞中的脂滴徹底消失，絨氈層細(xì)胞膨大，并在原位分解(圖版Ⅱ，E)。但是隨著絨氈層細(xì)胞的降解、退化，藥壁的中層(ML)細(xì)胞沒有退化，其細(xì)胞體積增大，細(xì)胞染色變深暗示其中的脂類物質(zhì)增加(圖版Ⅱ，F(xiàn))。臨近開花時的成熟花藥中，藥室內(nèi)壁細(xì)胞(En)形成纖維狀細(xì)胞壁，中層細(xì)胞也沒有退化，依然保留著(圖版Ⅱ，G)，這與其他植物不同。鐵皮石斛花藥壁細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化特點(diǎn)是絨氈層細(xì)胞中途退化，但中層細(xì)胞沒有退化，保留到花藥成熟，其結(jié)構(gòu)變化與花粉塊外壁的形成有關(guān)。

2.4 花粉塊中花粉的萌發(fā)

鐵皮石斛花粉塊表面有一層典型的花粉外壁結(jié)構(gòu)，但在該外壁上沒有萌發(fā)孔結(jié)構(gòu)。另外在花粉塊內(nèi)部的四合花粉沒有花粉外壁結(jié)構(gòu)。因此，鐵皮石斛花粉塊中花粉的萌發(fā)是一個有趣的問題。為此，我們進(jìn)行了花粉塊離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，探索其花粉萌發(fā)過程。在含15%蔗糖、0.01%無水氯化鈣、0.01%硼酸和0.01%磷酸二氫鉀的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～15 h，花粉塊長出了花粉管。顯微觀察顯示花粉管由花粉表面形成，而在花粉塊表面有花粉外壁的地方?jīng)]有花粉管形成(圖版Ⅱ，H)。在培養(yǎng)前的花粉塊很結(jié)實(shí)，四合花粉不易分開，經(jīng)過人工培養(yǎng)后，花粉塊變得很松散，但仍保持四合花粉狀態(tài)，萌發(fā)的花粉管由花粉的外側(cè)部位形成。

3 討 論

多數(shù)植物小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂后的四分體小孢子分開，隨后單個花粉獨(dú)自發(fā)育。有些植物的小孢子四分體不分散，4個小孢子結(jié)合成整體發(fā)育，即四合花粉。有些植物更多花粉聚集成花粉小塊(massulae)；也有些植物的花粉小塊再聚集成團(tuán)發(fā)育，稱為花粉塊(pollinium)[11]。各種植物花粉聚集狀態(tài)不同，花粉發(fā)育各有其特征，主要表現(xiàn)在花粉表面的壁結(jié)構(gòu)差異。對分散的單花粉發(fā)育的結(jié)構(gòu)特征已經(jīng)做了詳細(xì)研究，常常根據(jù)花粉發(fā)育結(jié)構(gòu)特征分為7～8個發(fā)育時期：造孢細(xì)胞、小孢子母細(xì)胞、四分體、早期小孢子、晚期小孢子、早期二胞花粉、晚期二胞花粉或三胞花粉[11]。每個時期花粉中都經(jīng)歷了特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，以適應(yīng)花粉發(fā)育中的生理功能轉(zhuǎn)變。經(jīng)過一系列程序性的發(fā)育變化，花粉形成結(jié)構(gòu)高度簡單但生理代謝極其復(fù)雜的三細(xì)胞雄配子體，具備了受精的功能。然而，花粉塊的發(fā)育過程研究較少，特別是蘭科植物小孢子發(fā)生類型尚未見報(bào)道，本研究首次報(bào)道了蘭科植物鐵皮石斛的小孢子發(fā)生為同時型。

3.1 鐵皮石斛花粉母細(xì)胞的胼胝質(zhì)壁

在被子植物有性生殖中，胼胝質(zhì)壁的形成是孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂前的一個特征。胼胝質(zhì)壁含有β-1,3-葡聚糖，易于合成和降解。胼胝質(zhì)壁只發(fā)生在減數(shù)分裂前的孢子母細(xì)胞和減數(shù)分裂后的四分體孢子表面，起著臨時分隔孢子母細(xì)胞和孢子的功能，防止這些細(xì)胞在減數(shù)分裂中發(fā)生細(xì)胞融合或遺傳物質(zhì)的不均等流動，確保后代的穩(wěn)定性。孢子母細(xì)胞形成胼胝質(zhì)壁也可能是啟動減數(shù)分裂的先決條件[11]，并作為小孢子外壁形成的模版。然而最近在金線蓮花粉塊發(fā)育研究中，發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂前在整個花粉塊的表面上形成了典型的胼胝質(zhì)壁，但在花粉塊內(nèi)部的小孢子母細(xì)胞沒有胼胝質(zhì)壁[12]；本實(shí)驗(yàn)中鐵皮石斛小孢子母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂時，花粉塊表面及內(nèi)部的小孢子母細(xì)胞也無胼胝質(zhì)壁(圖Ⅰ，G)。據(jù)此，胼胝質(zhì)壁啟動孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的功能和減數(shù)分裂的調(diào)控規(guī)律在具花粉塊的植物中還需要進(jìn)一步探索答案。

3.2 鐵皮石斛花粉塊的外壁

被子植物的花粉外壁是絨氈層分泌的脂類代謝物在花粉表面形成的特殊結(jié)構(gòu)，具有保護(hù)花粉和幫助傳粉的功能，其中包括花粉萌發(fā)時花粉管生長的萌發(fā)孔[13]。然而，在花粉塊植物中，花粉外壁及萌發(fā)孔情況又是如何呢？Passarelli和Rolleri[14]對南美Habenaria屬的4種小花粉塊進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)花粉壁結(jié)構(gòu)因其在四分體中的位置不同而有差異：花粉塊表面形成了完整的花粉外壁和具有小柱的內(nèi)壁，而花粉塊內(nèi)部的花粉缺乏外壁或僅發(fā)育出高度簡化的外壁。這些研究都注意到蘭科植物花粉塊中的花粉位置差異和壁層特征。本實(shí)驗(yàn)中，鐵皮石斛花粉塊表面也有1層顯著的花粉外壁結(jié)構(gòu)，但花粉塊內(nèi)部的四合花粉則無該結(jié)構(gòu)，這與許多蘭科植物的研究結(jié)果一致，顯示出花粉塊中花粉的位置差異。同時，本研究結(jié)果表明：第一，鐵皮石斛在花粉塊表面的花粉外壁上未觀察到萌發(fā)孔的結(jié)構(gòu)；第二，在花粉塊離體萌發(fā)實(shí)驗(yàn)中，未觀察到花粉塊表面花粉萌發(fā)，只觀察到內(nèi)部花粉萌發(fā)的現(xiàn)象。有關(guān)花粉塊的花粉萌發(fā)值得進(jìn)一步探討研究。