于文杰，楚天舒，宋 麗，葛婧怡，秦 嶺，邢 宇

(北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

板栗(Castaneamollissima)原產(chǎn)于中國(guó)，廣泛分布于中國(guó)26個(gè)省份，且栽培種植歷史悠久，具有較強(qiáng)的抗逆性和環(huán)境適應(yīng)性[1]。板栗作為中國(guó)木本糧食樹(shù)種之一，果實(shí)富含淀粉、可溶性糖、礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中栗仁的干物質(zhì)中淀粉占46%～64%[2]。板栗淀粉屬于高檔淀粉，可以代替主糧食用，可制成高級(jí)糕點(diǎn)，支鏈淀粉是板栗淀粉的主要成分，占總淀粉的70%左右[3]。支鏈淀粉和直鏈淀粉的比例對(duì)板栗的糯性影響較大，對(duì)板栗品質(zhì)和食用口感有著較大的影響，因此研究板栗淀粉的合成機(jī)理對(duì)于品種的改良具有重要意義。

淀粉的生物合成需要幾種酶的協(xié)同作用，包括可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase, SSS)、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、顆粒結(jié)合淀粉合成酶(granule bound starch synthase, GBSS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBE)、淀粉去分支酶(starch debranching enzyme, DBE)等。所有已知的SSS類酶都在質(zhì)體基質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)，并被認(rèn)為是支鏈淀粉合成的主要原因[4]。目前已鑒定出四類SSS類酶：SSⅠ(soluble starch synthase Ⅰ)、SSⅡ(soluble starch synthase Ⅱ)、SSⅢ(soluble starch synthase Ⅲ)和SSⅣ(soluble starch synthase Ⅳ)[5-6]，每一類在淀粉的生物合成中都有特定的作用，而且每一類的活性不能被剩余的一個(gè)或多個(gè)完全補(bǔ)充[7]。這些酶普遍存在于淀粉合成細(xì)胞中,但是根據(jù)植物種類和組織的不同而活性不同[8]。在水稻胚乳發(fā)育中，SSⅠ的活性高于SSⅢ，而SSⅡ和SSⅢ在馬鈴薯(Solanumtuberosum)塊莖[9]和豌豆(Pisumsativum)胚[10]中的活性高于SSⅠ。SSⅠ在谷類植物淀粉的生物合成中也起著重要作用，并且沒(méi)有亞型[11]。在板栗中，CmSSⅠ 和CmSSⅢ 在板栗堅(jiān)果發(fā)育時(shí)期表達(dá)上調(diào)，是參與淀粉積累的重要基因。但是這些基因?qū)Π謇踔辨湹矸酆椭ф湹矸酆铣捎绊懙难芯繄?bào)道較少[12]，該研究通過(guò)驗(yàn)證CmSSⅠ 在板栗淀粉合成中所起的作用，以期完善板栗淀粉合成過(guò)程中的分子積累機(jī)理。

基因功能的研究需要良好的遺傳體系，在栗屬植物中國(guó)板栗、美洲栗(Castaneadentata)、歐洲栗(Castaneasativa)中都已建立以胚性愈傷組織為受體的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系[13-15]，但胚性愈傷組織的誘導(dǎo)難度大，誘導(dǎo)數(shù)量少，而且在胚性愈傷組織生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段還需要更換不同種類的培養(yǎng)基(E1胚啟動(dòng)培養(yǎng)基→E4胚萌發(fā)培養(yǎng)基)，操作復(fù)雜且實(shí)驗(yàn)時(shí)期較長(zhǎng)。蘋果(Malusdomestica)、柑橘(Citrusreticulata)和荔枝(Litchichinensis)等建立的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系中，同樣存在轉(zhuǎn)化效率低、時(shí)間成本高等問(wèn)題[16-19]。對(duì)于需要簡(jiǎn)單、高效、快捷基因功能的研究工作而言，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化能夠更加快速地進(jìn)行基因功能初步驗(yàn)證和相應(yīng)的表型鑒定。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于葡萄(Vitisvinifera)、甘草(Glycyrrhizauralensis)和黃芪(Astragalusmongholicus)等多種植物[20-21]。本課題組已初步建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的板栗愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系[22]，由于體系不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率低(26.86%)，需要多次試驗(yàn)才能獲得轉(zhuǎn)基因材料。因此，本研究?jī)?yōu)化板栗愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，并利用該體系對(duì)板栗淀粉合成酶基因功能進(jìn)行鑒定，以期提高板栗愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率的穩(wěn)定性，并為板栗淀粉合成機(jī)理的探究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)材料為北京市懷柔區(qū)板栗技術(shù)試驗(yàn)與推廣站的板栗品種‘燕山紅栗’，愈傷組織由花后45～54 d未成熟的子葉胚尖誘導(dǎo)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 板栗愈傷組織的誘導(dǎo)及培養(yǎng)板栗愈傷組織的誘導(dǎo)參考Lu等的方法[23]，將板栗胚尖接種到IMM(2.3 g/L WPM + 0.109 g/L Vitamins + 30 g/L蔗糖+ 0.002 g/L 2,4-D+ 0.5 g/L L-glu)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)成功的材料接種至固體E1培養(yǎng)基(2.3 g/L WPM + 109 mg/L Vitamins + 1 g/L水解酪蛋白+ 1.8 μmol/L 2,4-D+ 1.1 μmol/L 6-BA+30 g/L蔗糖+3 g/L植物凝膠)上，在溫度23～25 ℃上暗培養(yǎng)14 d。

1.2.2 板栗愈傷轉(zhuǎn)化板栗愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法參考美洲栗轉(zhuǎn)化方法[24]。以不同狀態(tài)的板栗愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，將4種空載體的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，挑取攜帶目的基因的根癌農(nóng)桿菌單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中(0.05 g/L利福平+0.05 g/L壯觀霉素或0.05 g/L卡那霉素)，28 ℃、220 r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)至菌液濃度OD600為0.8～1.2，取50 mL菌液于離心管中，3 500 r/min集菌15 min，倒掉上清液，將離心好的菌塊重懸浮于Vir緩沖液(2.3 g/L MES + 1.98 g/L WPM + 2 g/L蔗糖，0.05 g/L AS)中。將重懸浮液放置于恒溫?fù)u床，在22 ℃、75 r/min的條件下培養(yǎng)3 h。稱取不同狀態(tài)愈傷0.3 g于15 mL離心管,加5 mL重懸浮液沒(méi)過(guò)愈傷，封口膜纏緊后綁在360°垂直旋轉(zhuǎn)混合儀上，35 r/min，混合時(shí)間為1 h。將侵染后的愈傷在滅菌干燥濾紙上吸干菌液，后將愈傷堆成豌豆粒大小的球形，放置于E1培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2～3 d。

1.2.3 不同載體瞬時(shí)表達(dá)差異的比較將表達(dá)載體pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277、pBI121、Super1300、pCAMBIA1304分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株GV3101中，以上述轉(zhuǎn)化方法對(duì)板栗愈傷組織進(jìn)行侵染，侵染結(jié)束后以非轉(zhuǎn)基因板栗愈傷組織作為對(duì)照，分別在共培養(yǎng)7 和14 d時(shí)于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況并統(tǒng)計(jì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率，比較不同載體瞬時(shí)表達(dá)的差異，從而篩選同等侵染條件下瞬時(shí)表達(dá)最好的載體。每次試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.4 板栗淀粉合成酶基因CmSSⅠ 沉默載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)CmSSⅠ 基因特異性片段上游引物(5′-CTCTTCTCTGCTCGTCTC-3′)和下游引物(5′-TTGTTTGGGTTCTCATCTTTAG-3′)，引物退火溫度為56 ℃。通過(guò)gateway體系[25]，構(gòu)建pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277-CmSSⅠ 沉默載體。

1.2.5CmSSⅠ 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)愈傷中RNA提取試劑盒為Plant RNA Kit(Omega)，cDNA合成使用Reverse transcriptase M-MLV(TaKaRa)，使用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)儀器為CFX96(BIO-RAD)。通過(guò)軟件Primer5設(shè)計(jì)CmSSⅠ 熒光定量上游引物(5′-CTCTTCTCTGCTCGTCTC-3′)和下游引物(5′-GAACCAGAGCCATAGCCATCCAAC-3′)，退火溫度為58 ℃。內(nèi)參基因使用的是CmActin。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.6 板栗愈傷組織淀粉積累觀察及淀粉含量測(cè)定取微量板栗愈傷組織平鋪于載玻片上。在體式熒光顯微鏡下觀察到目標(biāo)愈傷組織后向愈傷組織中緩慢滴加0.5%碘溶液，20 s后用吸水紙吸去多余液體后，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)的淀粉經(jīng)碘液染色變?yōu)樯钭厣Ｓ鷤矸酆客ㄟ^(guò)改良后的硝酸鈣浸提法提取[26]。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，Excel 2010作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織狀態(tài)篩選

根據(jù)胚啟動(dòng)的難易程度將板栗愈傷組織分為胚性愈傷組織(EC_E)和胚性愈傷組織早期階段(EC_D)。根據(jù)顏色和質(zhì)地對(duì)胚性愈傷組織早期階段(EC_D)進(jìn)行分類(圖1)，分別為淺褐色且質(zhì)地粘稠(Ⅰ)、乳白至淺黃色且質(zhì)地處于前兩者間(Ⅱ)、白色且質(zhì)地相對(duì)分散(Ⅲ)，分別命名為EC_D(Ⅰ)、EC_D(Ⅱ)、EC_D(Ⅲ)。比較4種狀態(tài)的愈傷得知，EC_D(Ⅲ)更為松散白嫩，可能更利于農(nóng)桿菌的侵染。

2.2 不同狀態(tài)的愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率的比較

用攜帶報(bào)告基因DsRed的空載體pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，侵染胚性愈傷組織(EC_E)和胚性愈傷組織早期階段EC_D(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，分別在共培養(yǎng)7 和14 d時(shí)在熒光倒置顯微鏡下觀察其熒光表達(dá)情況，結(jié)果如圖2顯示：EC_D(Ⅲ)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率最佳。共培養(yǎng)7 d時(shí)，4種不同狀態(tài)的愈傷組織均有熒光表達(dá)，EC_E的熒光表達(dá)效果較EC_D(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)的熒光表達(dá)效果弱，EC_D(Ⅲ)的熒光表達(dá)效果最強(qiáng)。在共培養(yǎng)14 d時(shí)，4種愈傷組織所表達(dá)的熒光有所加強(qiáng)，對(duì)照組EC_E表達(dá)的熒光弱于EC_D(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，熒光表達(dá)效果最好的仍然是EC_D(Ⅲ)，說(shuō)明這4種愈傷組織在相同侵染條件下，EC_D(Ⅲ)的熒光表達(dá)效果最好(圖2)。

2.3 不同載體對(duì)板栗愈傷瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率的影響

為進(jìn)一步優(yōu)化瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，選取帶有報(bào)告基因的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化侵染。RNAi沉默載體選擇攜帶報(bào)告基因DsRed的pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277。過(guò)表達(dá)載體選擇帶有GFP報(bào)告基因的pBI121及帶有eGFP報(bào)告基因的Super1300和pCAMBIA1304，pCAMBIA1304屬于pCAMBIA系列載體，具有高拷貝和多克隆位點(diǎn)且酶切位點(diǎn)較多等特點(diǎn)。轉(zhuǎn)化結(jié)果(圖3)顯示，在侵染條件相同的情況下，沉默載體pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277的瞬時(shí)表達(dá)效果最好。在3種過(guò)表達(dá)載體Super1300、pCAMBIA1304、pBI121的侵染實(shí)驗(yàn)中，共培養(yǎng)14 d時(shí)，只有攜帶報(bào)告基因eGFP的空載體Super1300轉(zhuǎn)化侵染愈傷組織表達(dá)的綠色熒光相對(duì)明顯。在本試驗(yàn)所用的4種載體中，pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，能夠最早(7 d)表達(dá)相應(yīng)的報(bào)告基因(DsRed)，在共培養(yǎng)時(shí)間相同的條件下，能觀察到其所表達(dá)的熒光最為明亮。由圖4可知，受體材料均為EC_D(Ⅲ)時(shí)，4種載體在14 d的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率由高到低依次為：沉默載體pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277(87.67%)>Super1300(78.31%)>pCAMBIA1304(61.10%)>pBI121(43.16%)。綜上所述，在侵染條件相同的情況下，瞬時(shí)表達(dá)效果好的載體為RNAi沉默載體pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277。

2.4 利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的驗(yàn)證淀粉合成基因CmSSⅠ 的功能

構(gòu)建板栗淀粉合成酶基因CmSSⅠ 的沉默載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化到愈傷組織中，提取DNA，利用pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277所帶的卡那霉素(Kana)的抗性基因進(jìn)行陽(yáng)性鑒定，通過(guò)凝膠電泳圖得知(圖5，A)，利用該體系獲得陽(yáng)性愈傷組織材料?；虮磉_(dá)檢測(cè)表明，實(shí)驗(yàn)組愈傷CmSSⅠ的表達(dá)量下降，沉默效率為82%(圖5，B)。用0.5%的碘-碘化鉀溶液對(duì)陽(yáng)性愈傷組織進(jìn)行染色，觀察淀粉積累情況，相對(duì)轉(zhuǎn)化空載體pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277愈傷組織而言，干擾CmSSⅠ 表達(dá)后的陽(yáng)性愈傷組織顏色變淺(圖5，C)。淀粉含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，沉默CmSSⅠ 后，總淀粉含量下降為61%，有極顯著性變化(P<0.01)，支鏈淀粉含量下降為68%，直鏈淀粉的含量變化不明顯。淀粉測(cè)定結(jié)果表明，沉默CmSSⅠ 后顯著抑制了總淀粉和支鏈淀粉的合成，對(duì)直鏈淀粉沒(méi)有顯著影響(圖5，D)。

3 討 論

瞬時(shí)轉(zhuǎn)化受體材料的狀態(tài)和載體是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素。在葡萄和蘋果中，篩選得到的最適瞬時(shí)轉(zhuǎn)化受體材料均為淡黃色且緊實(shí)致密的胚性愈傷組織[20,27]。本研究發(fā)現(xiàn)，白色且質(zhì)地相對(duì)分散的胚性愈傷早期狀態(tài)更適用于板栗的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，說(shuō)明不同樹(shù)種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的材料存在差異，因此篩選合適的愈傷組織可提高轉(zhuǎn)化效率。此外，使用不同的載體也對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率有重要影響[28]，楸樹(shù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系選用的載體為PBI121[29]，蘋果和葡萄中選用PCAMBIA0390載體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率最佳[20,26]。本研究發(fā)現(xiàn)沉默載體pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277激發(fā)的RFP能夠更快速的表達(dá)，通常轉(zhuǎn)化7 d內(nèi)能進(jìn)行鑒定篩選；過(guò)表達(dá)載體激發(fā)的GFP或EGFP需要7～14 d表達(dá)周期才能進(jìn)行鑒定篩選，過(guò)表達(dá)載體Super1300具有更高的轉(zhuǎn)化效率。本研究?jī)?yōu)化后的板栗瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率高達(dá)87.63%，較之前相比[22]，提高了60.77%，形成了以白色且質(zhì)地相對(duì)分散的胚性愈傷早期狀態(tài)為受體材料及載體為pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277的最佳體系，為進(jìn)一步驗(yàn)證基因的功能提供較好的平臺(tái)。

利用淀粉遇碘形成淀粉碘絡(luò)合物并且會(huì)產(chǎn)生顏色變化的原理[30]，可用于檢測(cè)淀粉合成相關(guān)基因在愈傷組織中的轉(zhuǎn)化效果。SSS 作為淀粉合成關(guān)鍵酶，在淀粉合成過(guò)程中起著重要作用[31-32]。在板栗基因組中，4個(gè)淀粉合成關(guān)鍵酶基因(CmSSⅠ、CmSSⅡ、CmSSⅢ、CmSSⅣ)在板栗果實(shí)的發(fā)育過(guò)程中表達(dá)差異顯著[33]，且發(fā)現(xiàn)基因CmSSⅠ 的表達(dá)與板栗堅(jiān)果發(fā)育過(guò)程中淀粉的累積規(guī)律較為一致[34]。碘液染色后，被干擾CmSSⅠ 的愈傷組織著色變淺，通過(guò)對(duì)淀粉含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，支鏈淀粉和總淀粉含量顯著性降低，直鏈淀粉含量變化不明顯，證實(shí)了CmSSⅠ 促進(jìn)板栗淀粉的合成，尤其是支鏈淀粉的合成，這與前人對(duì)SSⅠ 基因功能的研究相吻合[35-36]。以愈傷組織為轉(zhuǎn)化材料還可以鑒定乙烯代謝以及花色苷合成基因的功能，在蘋果愈傷中過(guò)表達(dá)MdAC01后，乙烯代謝速率提升，過(guò)表達(dá)花青苷調(diào)控基因MdERF109后，愈傷顏色加深，且花青苷含量顯著提高[27,37]。證明了該體系更適用表型容易檢測(cè)的基因功能驗(yàn)證。該體系有利于板栗淀粉合成基因功能的快速鑒定和篩選，為分子輔助育種奠定了基礎(chǔ)。