曹榮凱, 張 敏, 于 浩, 秦建華*

(1. 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

作為液體活檢的重要標(biāo)志物之一,循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)在外周血中的含量可以用來(lái)輔助判斷患者的癌癥病發(fā)狀況[1-3]。除此以外,CTCs對(duì)于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移行為等基礎(chǔ)研究也具有非常重要的意義[4,5]。然而人體血液中的CTCs含量極其稀少,通常僅有0～10個(gè)/mL,與之相對(duì),紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板的含量則分別達(dá)到5×109個(gè)/mL、4×106個(gè)/mL和3×108個(gè)/mL,而且腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過(guò)程中可以通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)來(lái)不斷地改變自身的特征[6]。正是由于其稀缺性和異質(zhì)性,以及血液中復(fù)雜基質(zhì)的干擾,CTCs的精準(zhǔn)檢測(cè)成為巨大的難題。

由于常規(guī)的光學(xué)分析手段在檢出限和靈敏度上均難以達(dá)到直接檢測(cè)的要求,因此通常在進(jìn)行外周血中CTCs的檢測(cè)之前,要通過(guò)一些樣品前處理方法來(lái)實(shí)現(xiàn)其分離和富集。常采用的樣品前處理方法可以分為物理法和化學(xué)法[7],物理法主要根據(jù)細(xì)胞在物理特征上的差異來(lái)進(jìn)行分離,例如膜過(guò)濾分離[8-10]和密度梯度離心[11,12],就是分別依據(jù)細(xì)胞的大小和密度來(lái)完成篩選?；瘜W(xué)法則主要依靠生物大分子的特異性識(shí)別作用[13-15],例如抗原抗體相互作用,核酸適配體與靶標(biāo)的選擇性結(jié)合。

上述樣品前處理方法雖然能夠在不同程度上實(shí)現(xiàn)CTCs的分離富集,但也存在著一定的缺陷。由于這些方法都是非連續(xù)性的,在吸附、洗脫和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中難免會(huì)造成細(xì)胞的丟失,加之CTCs本身的稀缺性,很容易導(dǎo)致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。利用微流控芯片功能集成的特點(diǎn)則可以很好地解決這一問(wèn)題,CTCs的捕獲、釋放、計(jì)數(shù)及檢測(cè)等操作均可在芯片上完成,連續(xù)的自動(dòng)化處理可以有效減少人為誤差的干擾[16]。此外,微流控芯片所需要的進(jìn)樣量非常小,可以大大減少珍貴樣品和試劑的消耗,降低檢測(cè)成本。并且在微尺度下表面力的作用會(huì)明顯放大,可以有效提高物質(zhì)混合和反應(yīng)的效率,實(shí)現(xiàn)快速高效的分離分析。因此,近年來(lái)多項(xiàng)研究嘗試?yán)梦⒘骺匦酒脚_(tái)開(kāi)展CTCs分離檢測(cè)工作,取得了良好的效果[17]。本文對(duì)微流控芯片技術(shù)用于CTCs分離檢測(cè)的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述,將采用的分離方法主要分為物理篩選和生物親和兩大類(lèi),同時(shí)囊括正向富集和反向富集兩種策略。此外,對(duì)于近期發(fā)展的芯片原位檢測(cè)CTCs新方法也進(jìn)行了介紹。

1 CTCs分離芯片研究進(jìn)展

作為商品化較為成功的CTCs分離檢測(cè)系統(tǒng),強(qiáng)生公司的CellSearch產(chǎn)品采用的是基于上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)抗體特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的方法[18],類(lèi)似的方法在CTCs分離芯片中也被廣泛使用,可以視作利用生物親和作用進(jìn)行CTCs分離富集的代表。另一方面,依據(jù)細(xì)胞在物理性質(zhì)方面的差異,無(wú)須生物標(biāo)志物的條件下即可實(shí)現(xiàn)CTCs的篩選,其中有無(wú)外力介入的被動(dòng)分離方法,例如利用微尺度下流體力學(xué)中的慣性效應(yīng)[19-21]和黏彈性效應(yīng)[22,23]來(lái)進(jìn)行篩分。也有外加物理場(chǎng)的主動(dòng)分離方法,諸如介電泳[24-26]、表面聲波[27,28]和光鑷技術(shù)[29]等。除了直接對(duì)CTCs進(jìn)行特異性識(shí)別實(shí)現(xiàn)正向富集外,也可以通過(guò)選擇性結(jié)合諸如白細(xì)胞等干擾,再將其排除,從而達(dá)到反向富集的效果[30-32]。

1.1 基于生物親和作用的正向富集

由于利用EpCAM抗體來(lái)特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的方法取得了不錯(cuò)的成效,許多研究者就采用該方法構(gòu)建微流控芯片來(lái)篩選CTCs[33-35]。通過(guò)將EpCAM抗體修飾在芯片通道表面上,即可利用抗原抗體的結(jié)合作用來(lái)捕獲CTCs。但由于微通道中的流體通常呈低雷諾數(shù)的層流流動(dòng),物質(zhì)的混合僅能依靠橫向擴(kuò)散,且只有接觸通道表面上的CTCs才可能被捕獲,擴(kuò)散速率低和接觸面積小的問(wèn)題導(dǎo)致CTCs的凈捕獲率較低。

為了解決這些問(wèn)題,一般采用在芯片上增加微結(jié)構(gòu)或?qū)νǖ佬螤钸M(jìn)行特殊設(shè)計(jì)的方法。Stott等[36]設(shè)計(jì)了一種人字形脊芯片,即在芯片通道上表面增添了長(zhǎng)短臂交錯(cuò)的魚(yú)骨狀槽道。根據(jù)流體力學(xué)模擬,這種結(jié)構(gòu)能夠使流體通過(guò)溝槽附近時(shí)產(chǎn)生側(cè)向的二次流,由此引起的渦流可以明顯增大混合效率,促使細(xì)胞與通道及溝槽表面充分接觸,從而提高對(duì)CTCs的捕獲率。采用人字形脊芯片進(jìn)行全血樣分析,在1.2 mL/h的流量下得到的CTCs加標(biāo)回收率為91.8%±5.2% (n=6),與直通道樣式的芯片相比有了顯著的提高。Sun等[37]采用微柱陣列結(jié)構(gòu)的芯片,構(gòu)建流動(dòng)域和捕獲域的功能化分區(qū),并在捕獲域微柱上修飾EpCAM抗體,即便在整體流速較高的情況下,依然能保證CTCs的高捕獲率,大大提高了芯片在實(shí)際應(yīng)用時(shí)的通量。

然而芯片結(jié)構(gòu)的改善涉及加工工藝的問(wèn)題,對(duì)于微結(jié)構(gòu)和微槽道的精密刻蝕,需要昂貴設(shè)備與專(zhuān)業(yè)技能的支持。為了避開(kāi)這一難題,同時(shí)又能保證CTCs的捕獲率,以聚合物分子鏈或天然生物膜取代微結(jié)構(gòu)的方法被提出。Yu等[38]采用靜電紡絲技術(shù)在玻璃芯片基底上制備了呈隨機(jī)排列形貌的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)納米纖維(見(jiàn)圖1a), PLGA具有良好的生物相容性,利用其帶有末端羥基的性質(zhì),可以很方便地通過(guò)縮合反應(yīng)連接上生物素,再借助生物素與親和素的相互作用,即可修飾上EpCAM抗體。隨機(jī)排列的PLGA納米纖維構(gòu)成了復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),不僅可以有效防止因直接碰觸通道表面而導(dǎo)致的非特異性吸附,也大大提高了反應(yīng)接觸面積,從而增加了CTCs的凈捕獲率。通過(guò)加標(biāo)回收的方式,測(cè)得該芯片對(duì)人體全血樣本中CTCs的捕獲率可達(dá)到90%。Jan等[39]利用相似原理,采用修飾有抗體的雜化硅納米線(xiàn)結(jié)構(gòu)來(lái)捕獲CTCs,并先后結(jié)合激光捕獲顯微分離技術(shù)、溫度控制及免疫競(jìng)爭(zhēng)等方法研發(fā)了4代CTCs分離芯片,實(shí)現(xiàn)了CTCs捕獲后的單細(xì)胞分析和可控釋放。Sun等[40]則以帶有目標(biāo)腫瘤細(xì)胞印跡的聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜為模板,通過(guò)在印跡區(qū)域修飾EpCAM抗體來(lái)捕獲目標(biāo)CTCs(見(jiàn)圖1b),細(xì)胞印跡的引入可以提高捕獲的特異性,減少假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生,改變印跡數(shù)目還可以控制芯片的捕獲容量。Wu等[41]采用EpCAM適配體功能化的白細(xì)胞納米囊泡來(lái)修飾芯片,構(gòu)建了多價(jià)納米流體界面(見(jiàn)圖1c),相較于普通的適配體功能化芯片,不僅捕獲效率提高了7倍,而且由于天然生物膜可減少對(duì)血細(xì)胞的非特異性吸附,捕獲純度也顯著提升。Cheng等[42]將帶有金納米顆粒涂層的3D導(dǎo)電支架集成在微流控芯片中,Au-S作用便于抗體功能化修飾和電化學(xué)釋放,支架的大孔結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)流體混合,高密度的納米金顆粒界面則能夠提高與細(xì)胞的相互作用。該系統(tǒng)不僅能夠可逆捕獲/釋放CTCs,還可以通過(guò)非特異性吸附損耗白細(xì)胞,提高回收的CTCs純度。

圖 1 基于生物親和原理的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離芯片F(xiàn)ig. 1 Microfluidics for separation of circulating tumor cells (CTCs) with biological property-based methods a. microfluidics with epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibody-modified nanofibers[38]; b. microfluidics with cancer cell-replicated surface[40]; c. microfluidics with fluidic multivalent membrane nanointerface[41]. PLGA: poly lactic-co-glycolic acid; PEG: polyethylene glycol; CellRePDMS: cell-replicated topological structure on the surface of polydimethylsiloxane; PBMC: peripheral blood mononuclear cell.

然而單純依賴(lài)EpCAM抗體的特異性識(shí)別作用來(lái)進(jìn)行CTCs捕獲具有一個(gè)較大的缺陷,由于高度轉(zhuǎn)移性的CTCs可能經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,引發(fā)EpCAM表達(dá)明顯下調(diào),最終導(dǎo)致這部分CTCs被忽略,從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。Liao等[43]為了精確篩選出這部分EpCAM表達(dá)下調(diào)的CTCs,結(jié)合免疫捕獲芯片和光誘導(dǎo)介電泳(ODEP)技術(shù)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)探究。首先采用EpCAM抗體來(lái)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞、CD45抗體標(biāo)記白細(xì)胞以及鈣黃綠素乙酰氧基甲酯(Calcein AM)標(biāo)記所有活細(xì)胞,則正常的CTCs表達(dá)為Calcein AMpos/EpCAMpos,干擾最大的白細(xì)胞表達(dá)為Calcein AMpos/CD45pos,經(jīng)歷了EMT的CTCs表達(dá)為CD45neg/EpCAMneg。然后利用ODEP技術(shù),根據(jù)熒光顯色情況的差異,即可在芯片主干通路與分支通路的交叉口實(shí)現(xiàn)CD45neg/EpCAMneg細(xì)胞的分選,且分離純度高達(dá)100%。該方法不僅可以用于捕獲因經(jīng)歷過(guò)EMT而被遺漏的CTCs,同時(shí)也為研究低EpCAM表達(dá)的腫瘤細(xì)胞提供了有效的手段。Wu等[44]在PLGA纖維化基底上同時(shí)修飾了EpCAM和N-鈣黏蛋白兩種適配體,在確保捕獲EpCAM表達(dá)正常的CTCs同時(shí),也能夠減少EpCAM低表達(dá)CTCs的遺漏,可以提高整體捕獲率并減少假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。

1.2 基于物理篩選方法的正向富集

物理篩選法依據(jù)的主要是細(xì)胞本身物理性質(zhì)的差異,相較于生物親和法而言,實(shí)驗(yàn)操作往往更加簡(jiǎn)單,無(wú)須進(jìn)行化學(xué)修飾和生物標(biāo)記,因此對(duì)細(xì)胞活性影響較小。效仿宏觀體系下的物理分離方法,微流控芯片上的物理篩選法通常依賴(lài)于外加物理場(chǎng)的誘導(dǎo),或是直接依據(jù)孔篩原理利用細(xì)胞大小差異來(lái)分離。Jahangiri等[45]依據(jù)不同種細(xì)胞間電極化常數(shù)的差異,通過(guò)在芯片上施加低頻交流電場(chǎng),完成了對(duì)不同種乳腺癌CTCs和血細(xì)胞的分離。Gascoyne等[46]則在外加交流電場(chǎng)的條件下,利用介電場(chǎng)流分離(depFFF)的方法對(duì)血液中的CTCs進(jìn)行分離篩選,依據(jù)細(xì)胞介電特性等的差異實(shí)現(xiàn)了CTCs的富集,細(xì)胞捕獲率超過(guò)90%,且對(duì)10 mL的臨床樣本進(jìn)行處理僅需15 min,分離效率遠(yuǎn)高于生物親和法。Wu等[47]利用表面聲波分離原理,通過(guò)外加聲場(chǎng)和表面聲波傳感器,依據(jù)大小、密度和形狀不同的細(xì)胞在駐波場(chǎng)中的排列分離,實(shí)現(xiàn)了外周血中CTCs的分選(見(jiàn)圖2a),在7.5 mL/h的通量下可得到86%以上的回收率。

然而外加場(chǎng)源在芯片上的集成化是比較困難的,因此Lin等[48]根據(jù)孔篩過(guò)濾原理設(shè)計(jì)了一種非常簡(jiǎn)單的CTCs分離芯片。通過(guò)調(diào)控濾孔的大小,依據(jù)細(xì)胞尺寸的差異即可完成CTCs的分離,實(shí)驗(yàn)所得回收率超過(guò)90%。Chen等[49]基于仿生脾竇微結(jié)構(gòu)構(gòu)建了孔篩式芯片系統(tǒng),裂隙結(jié)構(gòu)的濾孔相對(duì)于傳統(tǒng)的圓形結(jié)構(gòu)具有更低的流動(dòng)阻力,通過(guò)流速和狹縫寬度的優(yōu)化,可以在實(shí)現(xiàn)高效分離的同時(shí),保證CTCs的高細(xì)胞活性。但是由于白細(xì)胞與CTCs在大小上基本相當(dāng),該方法篩選精度較低,可能產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。此外,在細(xì)胞流動(dòng)通路上設(shè)置濾孔容易因堵塞導(dǎo)致負(fù)壓增大,從而影響分離效率。為了解決上述問(wèn)題,同時(shí)保留方法的便利性,研究人員對(duì)依據(jù)細(xì)胞尺寸實(shí)現(xiàn)CTCs篩選的方法進(jìn)行了優(yōu)化,將起過(guò)濾作用的微柱結(jié)構(gòu)或捕獲腔室設(shè)置在側(cè)向,來(lái)避免由于細(xì)胞堵塞所引起的主干通路負(fù)壓過(guò)大的問(wèn)題。Ren等[50]依據(jù)細(xì)胞尺寸和變形性的差異設(shè)計(jì)了一種高通量的CTCs捕獲芯片(見(jiàn)圖2b)。該芯片具有多條通道,且通道間由多排微型收縮管相連通,微型收縮管中有依據(jù)CTCs尺寸設(shè)計(jì)的捕獲腔。血液在流經(jīng)主通道與微型收縮管交匯處時(shí),由于表面張力所產(chǎn)生的毛細(xì)作用會(huì)驅(qū)使流體通過(guò)收縮管,此時(shí)CTCs會(huì)被困在捕獲腔中,血液中其他組分則能順利通過(guò),繼而進(jìn)入相鄰?fù)ǖ?。為了保證較高的CTCs捕獲率,該過(guò)程可在多條通道間重復(fù)進(jìn)行。采用該芯片對(duì)每毫升含有50個(gè)前列腺癌細(xì)胞的小鼠全血樣品進(jìn)行處理,當(dāng)通道數(shù)達(dá)到6條時(shí),CTCs捕獲率可超過(guò)95%。Liu等[51]將過(guò)濾的概念與確定性側(cè)向位移原理(DLD)相結(jié)合,設(shè)計(jì)了級(jí)聯(lián)DLD微柱陣列芯片,能夠在1 mL/min的高通量下實(shí)現(xiàn)96%的CTCs回收率,同時(shí)能夠剔除99.99%的白細(xì)胞。

圖 2 基于物理篩選方法的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離芯片F(xiàn)ig. 2 Microfluidics for separation of circulating tumor cells with physical property-based methods a. acoustic CTC separation chip[47]; b. sequential size-based chip[50]; c. inertial force-based straight chip[52]. WBC: white blood cell; SAW: surface acoustic wave; PDMS: polydimethylsiloxane.

依據(jù)細(xì)胞尺寸進(jìn)行CTCs篩選的芯片中通常會(huì)有許多起物理阻隔作用的微結(jié)構(gòu),這些精密結(jié)構(gòu)的加工往往是比較困難的。隨著微尺度下流體力學(xué)理論的發(fā)展,基于微流體中顆粒運(yùn)動(dòng)規(guī)律的研究,出現(xiàn)了無(wú)須任何微結(jié)構(gòu),僅僅通過(guò)對(duì)流體的調(diào)控便可實(shí)現(xiàn)CTCs分離富集的方法。Kulasinghe等[52]依據(jù)微尺度下的慣性效應(yīng)設(shè)計(jì)了一種結(jié)構(gòu)十分簡(jiǎn)單的方形通道芯片(見(jiàn)圖2c)。在方形管道中由于Dean渦與慣性升力的共同作用,在管道長(zhǎng)邊中點(diǎn)附近會(huì)產(chǎn)生平衡位點(diǎn),直徑大的細(xì)胞會(huì)優(yōu)先在該位點(diǎn)中心聚集。因此CTCs會(huì)富集在靠近通道中心處,其他組分則排布在外側(cè)。該芯片中沒(méi)有微結(jié)構(gòu)或捕獲腔來(lái)增加負(fù)壓,因此在處理通量上能有更高的突破,此外,由于無(wú)任何其他外部作用的影響,細(xì)胞能夠更好地保留其生理活性和形態(tài)特征。Lim等[53]同樣依據(jù)慣性效應(yīng),通過(guò)在T形通道處引入切向流,篩去靠近管壁側(cè)的血細(xì)胞,從而實(shí)現(xiàn)CTCs的分離。Zhang等[54]與Tian等[55]則利用非牛頓流體中的黏彈性效應(yīng)完成了對(duì)CTCs的分選,當(dāng)采用低黏度、無(wú)剪切稀化的流體時(shí)可達(dá)到與慣性效應(yīng)相近的效果。而且該方法的理論匯聚模式較為簡(jiǎn)單,便于進(jìn)行更為準(zhǔn)確的數(shù)值模擬分析。Zhu等[56]以聚合物薄膜為材料,通過(guò)拼圖技術(shù)構(gòu)建了梯形通道的螺旋狀微流控芯片,利用梯形通道中的慣性力和Dean渦流綜合作用,可以在3 mL/min的高通量下實(shí)現(xiàn)CTCs的分選,實(shí)驗(yàn)回收率為90%～94%。Lu等[57]設(shè)計(jì)的微流控芯片系統(tǒng)將微尺度流體力學(xué)和孔篩原理相結(jié)合,先通過(guò)慣性效應(yīng)完成對(duì)血細(xì)胞的初步分離,再利用三角微柱陣列實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs的捕獲,該方法在保證94.8%的高捕獲率的基礎(chǔ)上,通量可以達(dá)到40 mL/h。

圖 3 基于綜合作用的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離芯片F(xiàn)ig. 3 Microfluidics for separation of circulating tumor cells using integrated methods a. microfluidics integrating lateral filter arrays with immunoaffinity[62]; b. antibody-functional microsphere-integrated filter chip with inertial microflow[63]; c. deterministic lateral displacement (DLD)-patterned chip modified with multivalent aptamer-functionalized nanospheres[65]. AP: aptamer; GSH: glutathione.

上述CTCs分離芯片大都只關(guān)注于單個(gè)細(xì)胞,并沒(méi)有針對(duì)CTCs簇設(shè)計(jì)專(zhuān)門(mén)的選擇性分離方法。考慮到CTCs簇的研究對(duì)于腫瘤學(xué)也具有非常重要的意義,Sarioglu等[58]設(shè)計(jì)了含有三角形微柱結(jié)構(gòu)的芯片對(duì)CTCs簇進(jìn)行高精度分選。當(dāng)CTCs簇流經(jīng)三角微柱時(shí),由于胞間連接作用會(huì)在其頂點(diǎn)處被捕獲,單個(gè)細(xì)胞則會(huì)直接沿著微柱側(cè)腰面通過(guò),該方法要求流速不能過(guò)高,否則較大的剪切力會(huì)破壞CTCs簇的結(jié)構(gòu)致使捕獲失敗。采用該芯片對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行分離,確定了CTCs簇的異質(zhì)性,并發(fā)現(xiàn)其中可能含有腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs),該發(fā)現(xiàn)對(duì)TAMs與CTCs間相互作用的研究具有重要意義。

1.3 生物親和與物理篩選相結(jié)合的正向富集

總體而言,基于生物親和作用和物理篩選方法的CTCs分離芯片各有其優(yōu)勢(shì)。前者選擇特異性更強(qiáng),后者分離效率更高。同時(shí)二者也都存在不足之處,例如生物親和法依賴(lài)于外源性標(biāo)記,往往會(huì)影響CTCs細(xì)胞活性,物理篩選法分離精度較低,容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。因此研究人員嘗試將兩種方法相結(jié)合[59-61],取長(zhǎng)補(bǔ)短以實(shí)現(xiàn)更好的分離效果。Chen等[62]采用側(cè)向微柱陣列結(jié)構(gòu)的芯片,在微柱上修飾了EpCAM抗體,結(jié)合孔篩原理與免疫親和作用來(lái)提高CTCs的捕獲效率,同時(shí)由于主流場(chǎng)方向無(wú)阻塞,可以保證較高的通量(見(jiàn)圖3a)。Su等[63]利用相同的原理,在此基礎(chǔ)上引入表面功能化修飾的氧化鋅微球,大大提高了有效捕獲面積(見(jiàn)圖3b)。相似地,Chen等[64]先利用修飾了EpCAM抗體的磁珠去特異性結(jié)合CTCs,再讓樣品流經(jīng)橢圓微柱陣列區(qū),吸附了磁珠的CTCs變形性減弱,且由于外加磁場(chǎng)的作用不能通過(guò)窄間隙陣列,從而達(dá)到分離效果。利用該方法對(duì)11例不同癌癥臨床樣本進(jìn)行分析,捕獲率超過(guò)90%,且即便在高流速下,細(xì)胞存活率也能達(dá)到96%。Song等[65]則結(jié)合確定性側(cè)向位移原理設(shè)計(jì)了多價(jià)核酸適配體納米微球(AuNP-SYL3C)修飾的芯片(見(jiàn)圖3c),尺寸和彈性不同的細(xì)胞在流經(jīng)轉(zhuǎn)角三角形微柱陣列區(qū)時(shí),會(huì)因與微柱的碰撞選擇不同的路徑,通過(guò)調(diào)控微柱大小和間距,可使CTCs碰撞微柱時(shí)產(chǎn)生側(cè)向位移,其他血細(xì)胞則沿原路徑流出。此外,微柱上修飾有AuNP-SYL3C,通過(guò)核酸適配體多價(jià)效應(yīng)可以大大增強(qiáng)結(jié)合力,從而顯著提高對(duì)CTCs的捕獲性能,與單價(jià)核酸適配體修飾芯片相比,該方法的捕獲效率提高了3倍以上。

圖 4 基于反向富集策略的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離芯片F(xiàn)ig. 4 Microfluidics for negative enrichment of circulating tumor cells a. 3D-printed microfluidic device with immunocapture channels and microfiltration[66]; b. microfluidic chip integrated with DLD arrays and magnetic field[68]; c. CD45 antibody-based MACS combined with an inertial focusing chip[69]. MACS: magnetic activated cell sorting; RBC: red blood cell; PLT: platelet.

1.4 反向富集

由于白細(xì)胞與CTCs在尺寸上差別不大,在對(duì)血液中的CTCs進(jìn)行分選時(shí),白細(xì)胞往往是干擾最大的因素。因此可以通過(guò)選擇性分離白細(xì)胞,以達(dá)到CTCs富集的目的,也就是反向富集。采用反向富集的策略不僅能有效實(shí)現(xiàn)CTCs的分離,而且對(duì)于因EMT導(dǎo)致EpCAM表達(dá)下調(diào)的CTCs,甚至于非上皮性腫瘤細(xì)胞都可進(jìn)行富集,同時(shí)也能夠避免直接標(biāo)記對(duì)CTCs細(xì)胞活性產(chǎn)生影響。Chu等[66]利用3D打印構(gòu)建了功能化分區(qū)的微流控系統(tǒng)(見(jiàn)圖 4a),血液樣本先流經(jīng)修飾有CD45抗體的免疫捕獲區(qū),選擇性篩去白細(xì)胞,再通過(guò)3 μm孔徑的濾膜,除去小體積的紅細(xì)胞和血小板,從而實(shí)現(xiàn)CTCs的分離。Karabacak等[67]設(shè)計(jì)了集成雙芯片的分離體系,先通過(guò)DLD和慣性效應(yīng)兩種物理篩選法將白細(xì)胞和CTCs從血液中快速分離出來(lái),再用修飾了CD45和CD66b復(fù)合抗體的磁珠來(lái)選擇性結(jié)合白細(xì)胞,繼而在外加磁場(chǎng)的誘導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)白細(xì)胞與CTCs的精確篩分。該方法在保證高CTCs捕獲率的情況下,還能達(dá)到較高通量,處理8 mL血液樣本僅需2 h。Wang等[68]采用了相似的DLD-MACS(免疫磁珠分選)方法(見(jiàn)圖 4b)對(duì)肝癌患者臨床樣本進(jìn)行分析,在60 μL/min的流量下得到CTCs的捕獲率為85.1%±3.2%,且實(shí)驗(yàn)表明該方法對(duì)于EpCAM低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞依然有很好的分離效果。Mishra等[69]設(shè)計(jì)的CTC分離芯片將免疫磁分選與慣性效應(yīng)相結(jié)合(見(jiàn)圖 4c),利用修飾多種抗體的免疫磁珠來(lái)標(biāo)記白細(xì)胞,在外加強(qiáng)磁場(chǎng)和流體調(diào)控下可以實(shí)現(xiàn)CTCs和白細(xì)胞的高效分離,該芯片對(duì)CTCs的富集作用可以達(dá)到105倍,通量高達(dá)168 mL/h?；谖⒘骺丶夹g(shù)的各種CTCs分離方法匯總詳見(jiàn)表1。

2 芯片原位CTCs檢測(cè)

對(duì)于CTCs的檢測(cè),通常采取先進(jìn)行細(xì)胞染色,再用熒光顯微鏡觀察的方法[70],但該方法在靈敏度上有待提高,且重現(xiàn)性較差,需要手動(dòng)操作和人工計(jì)數(shù)。近年來(lái)研究人員對(duì)芯片上的CTCs成像分析方法進(jìn)行了優(yōu)化改良,Pahattuge等[71]研發(fā)的SMART-Chip將CTCs分選、細(xì)胞計(jì)數(shù)和免疫熒光成像模塊集成于一體,實(shí)現(xiàn)了對(duì)血液中CTCs分離檢測(cè)的全自動(dòng)化操作,避免了人為干擾。Lee等[72]則通過(guò)多通道熒光成像,同時(shí)表征CTCs上的雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)表達(dá)狀況,完成對(duì)乳腺癌的快速診斷和分型。Wang等[73]在集成化的CTCs分離、免疫熒光染色和成像系統(tǒng)中引入了氣體驅(qū)動(dòng)裝置,大大縮減了時(shí)間和試劑的消耗,能夠在90 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)CTCs的捕獲和識(shí)別。Shi等[74]在集成化的微流控系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了CTCs的單細(xì)胞分離和免疫染色鑒定,以及細(xì)胞的裂解和單細(xì)胞內(nèi)容物的靶向收集,不僅在單細(xì)胞水平上完成了CTCs的檢測(cè),還為后續(xù)的單細(xì)胞RNA測(cè)序奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。Wang等[75]反其道而行之,采用修飾CD45抗體的免疫微球來(lái)標(biāo)記白細(xì)胞,通過(guò)楔形芯片完成血細(xì)胞初步分選后,可在明場(chǎng)顯微成像下直接區(qū)分出CTCs并通過(guò)圖像處理軟件實(shí)現(xiàn)自動(dòng)計(jì)數(shù)。

表 1 基于微流控技術(shù)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離方法Table 1 Separation methods of circulating tumor cells with microfluidics

此外,以熒光光譜為代表,一些常見(jiàn)的光譜檢測(cè)手段也被廣泛應(yīng)用在芯片上CTCs的檢測(cè)中。Wu等[76]用同時(shí)負(fù)載有抗體和熒光編碼的磁性納米顆粒來(lái)標(biāo)記CTCs上的靶標(biāo)蛋白,在外加磁場(chǎng)下利用芯片捕獲CTCs,并能通過(guò)熒光強(qiáng)度完成對(duì)單個(gè)CTC上表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、HER2和EpCAM含量的表征(見(jiàn)圖5a)。Dhar等[77]通過(guò)液滴微流控技術(shù),將慣性渦流分離后得到的CTCs包裹在含有基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)反應(yīng)體系的液滴中,由于目標(biāo)CTCs具有很高的MMP反應(yīng)活性,可由該酶促反應(yīng)體系產(chǎn)生的共振熒光轉(zhuǎn)移現(xiàn)象來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs的檢測(cè)和計(jì)數(shù)。Shen等[78]設(shè)計(jì)了一種以金膜為基底的芯片,通過(guò)免疫磁性分離的方法對(duì)CTCs進(jìn)行分選,之后采用基于表面等離子共振的近紅外熒光法實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs的觀察和檢測(cè),由于近紅外區(qū)生物樣品基體光吸收和自發(fā)熒光強(qiáng)度很小,且表面等離子體共振效應(yīng)大大增強(qiáng)了熒光信號(hào)強(qiáng)度,該方法的檢測(cè)靈敏度與普通的熒光分析方法相比提高了近10倍。Cho等[79]采用修飾有抗體和拉曼信號(hào)分子的金納米顆粒來(lái)標(biāo)記CTCs,通過(guò)表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)即可對(duì)芯片上被捕獲的CTCs進(jìn)行原位表征和檢測(cè)。該方法不僅具有高靈敏度,還可以依據(jù)拉曼信號(hào)峰的差異區(qū)分普通的CTCs以及循環(huán)腫瘤干細(xì)胞(CCSCs)。Reza等[80]結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼和微流控技術(shù),在單細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)了對(duì)CTCs多種蛋白標(biāo)志物的原位動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),CTCs在蛋白表達(dá)水平上的異質(zhì)性能夠反映更多的關(guān)鍵信息,為癌癥臨床診斷和治療提供判斷依據(jù)。

除了光學(xué)分析方法外,研究人員通過(guò)使用傳感元件實(shí)現(xiàn)了CTCs芯片檢測(cè)結(jié)果的數(shù)字化直讀或可視化分析。Chen等[81]以具有高電子遷移率的AlGaN/GaN為材料制作場(chǎng)效應(yīng)晶體管(FETs),在芯片上設(shè)置FETs傳感器陣列,并在其表面修飾上特異性識(shí)別EpCAM的核酸適配體,從而實(shí)現(xiàn)了CTCs的連續(xù)捕獲和計(jì)數(shù)。FETs的高跨導(dǎo)增益使得該生物電子傳感器具有很高的檢測(cè)靈敏度,實(shí)驗(yàn)表明該方法能夠在較寬的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)CTCs的快速自動(dòng)化檢測(cè),并能夠提供準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。Gao等[82]將采用復(fù)合免疫磁珠進(jìn)行篩選的CTCs芯片與液滴數(shù)字PCR芯片相結(jié)合,通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)提高檢測(cè)的靈敏度。Abate等[83]在待測(cè)血樣中加入修飾有核酸適配體的鉑納米粒子(PtNPs),通過(guò)免疫磁性分離得到結(jié)合有PtNPs的目標(biāo)CTCs,將其引入預(yù)載有H2O2和染料的檢測(cè)芯片中,由于Pt可以催化H2O2的分解,產(chǎn)生的氧氣會(huì)導(dǎo)致染料液柱的上升,根據(jù)液柱高度可以判斷血液中CTCs的含量(見(jiàn)圖5b)。Jian等[84]用修飾有葡萄糖氧化酶的磁性MOF納米顆粒來(lái)標(biāo)記CTCs,芯片上的TiO2納米管陣列借由磁力完成對(duì)CTCs的捕獲后,通過(guò)TiO2的光催化作用將MOF中的Fe2+/Fe3+還原為Fe0,利用微分脈沖伏安法得到電化學(xué)信號(hào),即可實(shí)現(xiàn)CTCs的定量檢測(cè)(見(jiàn)圖5c)。

圖 5 芯片原位檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞方法Fig. 5 On-chip analysis of circulating tumor cells a. optically combined encoding of single CTC on chip[76]; b. visual quantifiable detection of CTCs in a volumetric bar-chart chip[83]; c. electrochemical determination of iron ions leaking from CTCs by DPV technique[84]. BTC: bis(trichloromethyl)carbonate; magMOF: magnetic metal-organic framework; FITC-GOD: fluorescein isothiocyanate-glucose oxidase; CB: conduction band; VB: valence band.

3 總結(jié)與展望

本文對(duì)CTCs分離微流控芯片的技術(shù)原理、分離策略和研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。其技術(shù)原理主要分為物理篩選和生物親和兩大類(lèi),分離策略分為正向富集和反向富集兩個(gè)方向。同時(shí),介紹了CTCs芯片原位檢測(cè)的主要技術(shù)方法和優(yōu)化策略。隨著微流控芯片技術(shù)的快速發(fā)展,其微尺度流體操控、微結(jié)構(gòu)加工和集成傳感檢測(cè)能力得到極大提升,進(jìn)一步推動(dòng)了CTCs分離微流控芯片技術(shù)的發(fā)展。多項(xiàng)研究顯示,以微流控芯片為平臺(tái)來(lái)分離檢測(cè)外周血中的CTCs,可以充分發(fā)揮芯片本身微量、高效、易于自動(dòng)化和集成化的優(yōu)勢(shì),最終實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床血液中CTCs的快速精準(zhǔn)分析,在腫瘤早期診斷、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)以及抗腫瘤藥物評(píng)價(jià)等多個(gè)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用空間。

現(xiàn)階段,CTCs芯片在篩選精度和篩選效率方面仍存在較大的提升空間。針對(duì)這一挑戰(zhàn),由于精準(zhǔn)與高效二者難以兼得,未來(lái)的芯片設(shè)計(jì)應(yīng)該更專(zhuān)注于單個(gè)目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。一方面,針對(duì)基礎(chǔ)研究,應(yīng)當(dāng)注重于提高CTCs篩選的細(xì)胞純度及細(xì)胞活性?？梢韵壤脩T性效應(yīng)對(duì)血液進(jìn)行粗分離,篩分出尺寸較大的白細(xì)胞和CTCs。再采用液滴分選的方法,通過(guò)免疫磁性分離實(shí)現(xiàn)CTCs的精確篩選。液滴分選技術(shù)能夠達(dá)到單細(xì)胞分析的精度,利用液滴分選進(jìn)行腫瘤細(xì)胞篩選也已有文獻(xiàn)報(bào)道[85]。另一方面,針對(duì)臨床檢測(cè)領(lǐng)域,研究重點(diǎn)則在于實(shí)現(xiàn)臨床樣本的高通量分析?？梢圆捎秒姺治龇椒?依據(jù)不同種類(lèi)細(xì)胞的比膜電容和細(xì)胞質(zhì)電導(dǎo)率差異來(lái)設(shè)置恰當(dāng)?shù)拈撝?對(duì)流經(jīng)檢測(cè)窗口的CTCs實(shí)現(xiàn)快速分析[86]。此外,微流控芯片技術(shù)屬于多學(xué)科交叉領(lǐng)域,CTCs芯片的發(fā)展同時(shí)也受益于微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)、材料學(xué)、流體力學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域的技術(shù)突破。隨著相關(guān)領(lǐng)域研究技術(shù)的發(fā)展,CTCs芯片未來(lái)有望成為腫瘤基礎(chǔ)研究和癌癥早期臨床診斷的重要平臺(tái)。