郭常川, 譚會(huì)潔, 劉 琦, 鞏騰飛, 王 雪,王程霖,3, 徐玉文*

(1. 山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院， 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東省仿制藥一致性評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心, 山東 濟(jì)南 250101; 2. 威海市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,山東 威海 264299; 3. 山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院, 山東 濟(jì)南 250012)

二氫吡啶類鈣拮抗劑是一類降壓作用強(qiáng)、臨床應(yīng)用廣、上市品種多的心血管疾病治療藥[1,2],主要包括硝苯地平、氨氯地平、樂卡地平、尼莫地平、尼卡地平、尼群地平、非洛地平、拉西地平等在臨床中常用的藥物。硝苯地平是一種常見的第一代二氫吡啶類鈣拮抗劑,可選擇性地抑制鈣離子進(jìn)入心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),抑制鈣離子從細(xì)胞內(nèi)釋放,且不改變血漿中鈣離子濃度,對(duì)心血管平滑肌鈣通道有阻滯作用,干擾肌肉的興奮收縮,有較強(qiáng)的擴(kuò)張血管作用,臨床上主要用于高血壓、心絞痛、心律失常及其他心血管疾病的治療[3,4]。 當(dāng)前,對(duì)于硝苯地平雜質(zhì)的研究主要集中在非致突變性雜質(zhì)[5-10],而對(duì)其基因毒性雜質(zhì)的調(diào)查鮮有報(bào)道。硝苯地平雜質(zhì)2、6、12的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示,雜質(zhì)2和雜質(zhì)12含有的硝基基團(tuán)、雜質(zhì)6含有的氮雜芳基N-氧基團(tuán)均屬于基因毒性警示結(jié)構(gòu)，應(yīng)按照致突變性雜質(zhì)的要求制定雜質(zhì)限值[11]。

圖 1 硝苯地平及雜質(zhì)2、6和12的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of nifedipine and the impurities 2, 6 and 12

目前已報(bào)道的硝苯地平雜質(zhì)的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[5,7,8]、超高效液相色譜法(UHPLC)[10]和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[6]。近年來,靜電場(chǎng)軌道阱(Orbitrap)高分辨質(zhì)譜技術(shù)憑借其超高質(zhì)量精度、高靈敏度和高選擇性的優(yōu)勢(shì),在藥品雜質(zhì)分析方面的應(yīng)用逐漸增多[12-15]。本研究建立了UHPLC-Orbitrap HRMS測(cè)定硝苯地平原料藥中基因毒性雜質(zhì)2、6和12的方法,并進(jìn)行了詳細(xì)的方法學(xué)驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Thermo Q Exactive PlusTM超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)包括Ultimate 3000三元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器以及Orbitrap高分辨質(zhì)譜部分,Tune2.9軟件用于質(zhì)譜儀的調(diào)諧和質(zhì)量軸的校正,XCaliburTM4.0軟件用于設(shè)置儀器方法、編輯序列和處理數(shù)據(jù),以上均購(gòu)于Thermo公司(德國(guó)); Mettler XS205型電子天平(Mettler Toledo公司,瑞士)用于精密稱量。

硝苯地平原料藥由山東省某醫(yī)藥公司提供;雜質(zhì)2對(duì)照品購(gòu)自STD公司(美國(guó)),批號(hào)為196132N-SL-01,純度為98.7%;雜質(zhì)6對(duì)照品購(gòu)自QCC公司(美國(guó)),批號(hào)為29-APR-19-32,純度為99.98%;雜質(zhì)12對(duì)照品購(gòu)自STD公司(美國(guó)),批號(hào)為1656312B-SL-01,純度為99.6%;質(zhì)譜級(jí)甲醇(純度99.9%)、甲酸(純度>99%)均購(gòu)自Fisher公司(美國(guó));實(shí)驗(yàn)用18.2 MΩ·cm純水由Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(Millipore公司,美國(guó))制得。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取雜質(zhì)2、6和12對(duì)照品10.07、10.20和10.26 mg,分別以甲醇作為稀釋劑,制成質(zhì)量濃度分別為397.56、407.92和408.76 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,加甲醇稀釋得質(zhì)量濃度約為20 μg/mL的單一對(duì)照品溶液。精密移取20 μg/mL各單一對(duì)照品溶液適量,加甲醇逐步稀釋,得到質(zhì)量濃度約為0.05、0.2、0.5、2、5、10、20、50、100 ng/mL的雜質(zhì)2、6、12混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2樣品前處理

取硝苯地平約25 mg,精密稱定,置于50 mL離心管中,精密加入甲醇25 mL,渦旋使其完全溶解,搖勻即得。

1.2.3色譜條件

色譜柱為ACE EXCELTM3 C18-AR柱(150 mm×4.6 mm, 3 μm),柱溫為35 ℃,自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為8 ℃,流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸水溶液(65∶35, v/v),等度洗脫,流速為0.6 mL/min,分析時(shí)間為18 min，進(jìn)樣量為5 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm。

六通閥切換設(shè)置:保留時(shí)間為7.5～11.6 min時(shí),流動(dòng)相進(jìn)入廢液,其余保留時(shí)間,流動(dòng)相進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。

1.2.4質(zhì)譜條件

電噴霧電離源,正離子模式,噴霧電壓3.5 kV;毛細(xì)管溫度350 ℃,輔助氣加熱器溫度400 ℃;鞘氣流量60 arb,輔助氣流量20 arb。采用平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(PRM)質(zhì)譜掃描模式,分辨率設(shè)為35 000 FWHM,隔離窗口(isolation window)設(shè)為m/z1.5,微掃描(microscans)設(shè)為3,自動(dòng)增益控制(AGC target)設(shè)為2×105,最大離子注入時(shí)間(maximum IT)設(shè)為100 ms。雜質(zhì)2、6、12的具體質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 雜質(zhì)2、6、12的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of the impurities 2, 6 and 12

2 結(jié)果和討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件考察

2.1.1質(zhì)譜條件優(yōu)化

目前尚無硝苯地平雜質(zhì)2、6、12的毒理學(xué)數(shù)據(jù),可采用ICH M7 R1推薦的毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC)來計(jì)算可接受攝入量,即單個(gè)雜質(zhì)的可接受攝入量為1.5 μg/d[16]。硝苯地平每日最大用量為80 mg,故硝苯地平中雜質(zhì)2、6、12限值的計(jì)算公式[11]為雜質(zhì)限值=雜質(zhì)可接受攝入量÷藥物每日最大用量=18.75 ng/mg。此限值比硝苯地平有關(guān)物質(zhì)的限度(0.1%或0.2%)[11]低2個(gè)數(shù)量級(jí),對(duì)儀器靈敏度要求較高,宜采用LC-MS進(jìn)行測(cè)定。

本研究所使用的Thermo Q Exactive PlusTM超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)的質(zhì)譜部分串聯(lián)了四極桿和Orbitrap兩個(gè)質(zhì)量分析器,擁有多樣化的質(zhì)譜掃描模式。在開發(fā)質(zhì)譜方法時(shí),考察了目標(biāo)物選擇性離子監(jiān)測(cè)(Targeted SIM)、全掃描-數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)掃描(Full MS/dd MS2)、PRM等不同的質(zhì)譜掃描模式,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在雜質(zhì)2、6、12質(zhì)量濃度≥10 ng/mL時(shí),3種掃描模式靈敏度相當(dāng),而當(dāng)雜質(zhì)2、6、12質(zhì)量濃度低于10 ng/mL時(shí),在Targeted SIM或Full MS/dd MS2模式下采集的總離子流色譜圖中無法提取雜質(zhì)的色譜峰,但PRM模式下雜質(zhì)2、6、12質(zhì)量濃度為0.05～10 ng/mL時(shí)依然能夠獲得較好的提取離子色譜圖。因此,本研究采用PRM質(zhì)譜掃描模式。采用Tune2.9軟件優(yōu)化雜質(zhì)2、6、12的碰撞能量,選擇合適的提取碎片離子,并對(duì)離子源氣流速、溫度、電壓進(jìn)行了精細(xì)調(diào)節(jié)和逐級(jí)優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)了雜質(zhì)2、6、12的痕量檢測(cè),最佳質(zhì)譜條件如1.2.4節(jié)所示,3種雜質(zhì)的高分辨二級(jí)質(zhì)譜圖及碎片離子預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)式如圖2所示。

圖 2 雜質(zhì)2、6、12的二級(jí)質(zhì)譜圖及碎片離子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 2 MS2 spectra and predicted structures of fragment ions of the impurities 2, 6 and 12

2.1.2色譜條件的優(yōu)化

在本研究中,雜質(zhì)2和雜質(zhì)12與硝苯地平為同分異構(gòu)體,3者分子式、準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)、提取離子質(zhì)量數(shù)均完全相同,因此雜質(zhì)2、12及硝苯地平色譜峰必須達(dá)到基線分離才能夠進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。另一方面,由于供試品溶液中含有高質(zhì)量濃度的藥品主成分硝苯地平(約1.0 mg/mL),如果高濃度硝苯地平進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng),會(huì)污染離子源并產(chǎn)生嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng),影響痕量雜質(zhì)2、6、12的準(zhǔn)確測(cè)定。因此,應(yīng)充分優(yōu)化色譜條件,盡可能提高雜質(zhì)2、6、12與硝苯地平的色譜分離度,再通過在線六通閥將硝苯地平色譜峰切換到廢液,避免高濃度硝苯地平進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)考察了島津Shim-pack GISTTM苯基-己基柱(150 mm×4.6 mm, 3 μm)和ACE EXCELTM3 C18-AR柱(150 mm×4.6 mm, 3 μm)等兩種不同類型色譜柱的分離效果。當(dāng)采用島津Shim-pack GISTTM苯基-己基柱時(shí),雜質(zhì)2與硝苯地平色譜峰保留時(shí)間相隔太近(<1 min),閥切換很難將硝苯地平主成分徹底切換,對(duì)其準(zhǔn)確測(cè)定造成影響。采用ACE EXCELTM3 C18-AR色譜柱(150 mm×4.6 mm, 3 μm)時(shí),雜質(zhì)6、硝苯地平、雜質(zhì)2、雜質(zhì)12的保留時(shí)間分別為6.25、10.74、14.26和15.91 min。硝苯地平與3種雜質(zhì)均實(shí)現(xiàn)了良好的色譜分離,通過六通閥控制將保留時(shí)間為7.5～11.6 min時(shí)的流動(dòng)相切入廢液,有效避免了高濃度硝苯地平的基質(zhì)干擾,保護(hù)了質(zhì)譜離子源,降低了雜質(zhì)2和雜質(zhì)12的基線噪音,使雜質(zhì)測(cè)定更加準(zhǔn)確可靠。

2.1.3樣品前處理方法優(yōu)化

中國(guó)藥典載明:硝苯地平在丙酮或三氯甲烷中易溶,在乙醇中略溶,在水中幾乎不溶[11]。然而,丙酮和三氯甲烷溶解性太強(qiáng),會(huì)對(duì)液相色譜柱和液相色譜管路造成嚴(yán)重影響,同時(shí)也會(huì)使色譜圖上出現(xiàn)一些干擾峰。此外,考慮到甲醇與流動(dòng)相的兼容性明顯優(yōu)于乙醇。藥典載明,硝苯地平以甲醇作為溶劑可配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液[11]。因此,綜合以上考慮,本研究選用甲醇作為提取溶劑,硝苯地平樣品含量定為1 mg/mL。結(jié)果表明,硝苯地平與雜質(zhì)2、6、12均能完全溶于甲醇,形成澄清透明的溶液,前處理簡(jiǎn)單。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1專屬性

將甲醇溶劑和雜質(zhì)2、6、12混合對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖。甲醇溶劑的圖譜如圖3a所示,通過與對(duì)照品溶液提取離子色譜圖(見圖3b)對(duì)比可知，雜質(zhì)2、6、12相同保留時(shí)間處無干擾峰存在，表明本方法專屬性良好。

2.2.2線性范圍

分別取0.2、0.5、2、5、10、20、50、100 ng/mL的雜質(zhì)2、6、12混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定,以峰面積作為y、分析物質(zhì)量濃度(ng/mL)作為x,不加權(quán)重?cái)M合線性校正曲線,建立回歸方程,計(jì)算相關(guān)系數(shù)(r),如表2所示。結(jié)果表明,雜質(zhì)2、6、12峰面積與其質(zhì)量濃度分別在0.2～100 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,r均≥0.999 8。

2.2.3檢出限和定量限

精密量取質(zhì)量濃度為0.2 ng/mL的雜質(zhì)2、6、12混合對(duì)照品溶液,用甲醇逐級(jí)稀釋,按照信噪比(S/N)≥3和≥10分別計(jì)算檢出限和定量限。結(jié)果表明,3種雜質(zhì)的檢出限均為0.05 ng/mL(即0.05 ng/mg),定量限均為0.20 ng/mL(即0.20 ng/mg)。3次定量限平行試驗(yàn)中雜質(zhì)2、6、12的平均信噪比分別為23、21和17,峰面積RSD分別為5.4%、4.9%和6.0%。定量限提取離子色譜圖如圖4所示。

圖 3 (a)空白溶劑及(b)對(duì)照品溶液的提取離子色譜圖Fig. 3 Extraction ion chromatograms of (a) blank solvent and (b) reference solutions

圖 4 定量限下雜質(zhì)2、6和12的提取離子色譜圖Fig. 4 Extraction ion chromatograms of the impurities 2, 6 and 12 under LOQ

表 2 雜質(zhì)2、6、12的線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equations and correlation coefficients (r) of the impurities 2, 6, and 12

y: peak area;x: mass concentration, ng/mL.

2.2.4回收率和精密度

取硝苯地平約25 mg(批號(hào)1911231),精密稱取9份(低、中、高水平各3份),先分別精密加入適量的雜質(zhì)2、6、12混合對(duì)照品溶液,后續(xù)操作按照1.2.2節(jié)描述處理,得到加標(biāo)回收試驗(yàn)用供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果如表3所示，雜質(zhì)2、6、12的加標(biāo)回收率為96.9%～105.0%, RSD為1.21%～5.12%,符合藥典規(guī)定,表明雜質(zhì)2、6和12回收率和精密度良好。

表 3 硝苯地平中雜質(zhì)2、6、12的加標(biāo)回收率(n=3)Table 3 Spiked recoveries of the impurities 2, 6 and 12 in nifedipine (n=3)

2.2.5穩(wěn)定性

將質(zhì)量濃度約為0.20 ng/mL的雜質(zhì)2、6、12混合對(duì)照品溶液保存于進(jìn)樣瓶中,在自動(dòng)進(jìn)樣器中按照實(shí)驗(yàn)條件放置0、8、12、24 h后進(jìn)樣測(cè)定,雜質(zhì)2、6、12峰面積的RSD值分別為4.3%、5.1%和4.5%,說明該條件下雜質(zhì)2、6、12在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6耐用性

微調(diào)分析條件,將柱溫分別調(diào)整為32 ℃和38 ℃、流速分別調(diào)整為0.55 mL/min和0.65 mL/min時(shí),雜質(zhì)的色譜峰形無變化,色譜保留時(shí)間和峰面積發(fā)生微小改變,各雜質(zhì)峰面積和保留時(shí)間RSD值均<10%。因此,測(cè)定條件輕微變動(dòng)不影響雜質(zhì)2、6、12的檢測(cè),方法耐用性良好。

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用已驗(yàn)證的方法,對(duì)3批硝苯地平原料處理后,進(jìn)樣測(cè)定,外標(biāo)法計(jì)算樣品中雜質(zhì)2、6、12含量,結(jié)果見表4,代表性提取離子色譜圖如圖5所示。3批樣品均未檢出雜質(zhì)6,但均檢出雜質(zhì)2和雜質(zhì)12,檢出含量分別為0.315～0.382 ng/mg和0.285～0.404 ng/mg,遠(yuǎn)低于限度規(guī)定(18.75 ng/mg)。因此,樣品中雜質(zhì)2、6、12的檢出量符合規(guī)定。

表 4 硝苯地平樣品檢測(cè)結(jié)果Table 4 Test results of nifedipine samples

圖 5 供試品提取離子色譜圖Fig. 5 Extraction ion chromatograms of the sample

3 結(jié)論

本研究建立了硝苯地平中痕量基因毒性雜質(zhì)2、6、12的UHPLC-Orbitrap HRMS檢測(cè)方法,并進(jìn)行了詳盡的方法學(xué)驗(yàn)證。本方法靈敏度高,專屬性好,回收率高,線性范圍寬,填補(bǔ)了該領(lǐng)域的研究空白,可為藥企對(duì)硝苯地平的質(zhì)量控制提供參考,并為藥監(jiān)部門的監(jiān)管提供有力的技術(shù)支持。