李 超, 王 琪, 張召香

(光電傳感與生命分析教育部重點實驗室, 青島科技大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院, 山東 青島 266042)

二甲雙胍為口服類降血糖藥,主要用于治療II型糖尿病。三聚氰胺和雙氰胺是合成二甲雙胍的中間體和前驅(qū)體,在二甲雙胍合成工藝中,不可避免地會引入三聚氰胺和雙氰胺,二者毒性較大,必須嚴(yán)格控制其在藥物中的含量。目前檢測三聚氰胺和雙氰胺的方法主要有液相色譜-質(zhì)譜法[1-3]、磁性表面分子印跡-色譜法[4]、毛細(xì)管電泳法(CE)[5]等。CE以其分離效率高、樣品用量少等特點,在復(fù)雜樣品的分離檢測中有著不可替代的優(yōu)勢,但CE-紫外(UV)檢測的靈敏度受待測物濃度的限制。通過在線濃縮富集技術(shù)可以提高檢測靈敏度[6-8]。

近年來,隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展,磁性納米材料[9,10]、金納米粒子[11-13]等作為標(biāo)記、富集或分離介質(zhì),已廣泛用于分析檢測中。石墨烯量子點(graphene quantum dots, GQDs)是一類有獨特光電子性能的納米材料,具有優(yōu)良的熒光特性,且有毒性低、易于化學(xué)修飾等特點,常被用于傳感器、生物成像、光催化等領(lǐng)域[14-17]。Li等[18]合成了硫摻雜的GQDs作為熒光探針高靈敏檢測Fe3+。Chen等[19]通過切割氮摻雜氧化石墨烯合成了具有雙電位電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)的氮摻雜GQDs,并通過對比不同激發(fā)電位下電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的比值實現(xiàn)對Co2+的定量檢測。Chen等[20]通過電解法合成了硼摻雜的GQDs作為熒光傳感器高靈敏檢測水中的Fe3+。Anh等[21]合成了尺寸可調(diào)的金硫摻雜GQDs高靈敏檢測硝基苯酚,檢出限達(dá)8.4 nmol/L。摻雜型GQDs富含多種官能團(tuán),水溶性好,比表面積大,可以與多種物質(zhì)相互作用,但迄今為止,摻雜型GQDs主要用于光學(xué)分析,對其負(fù)載能力的研究還未見文獻(xiàn)報道。

本文利用硫摻雜石墨烯量子點(sulfur-doped graphene quantum dots, S-GQDs)做載體,結(jié)合電堆積富集技術(shù),發(fā)展了一種基于場放大進(jìn)樣(field-amplified sample injection, FASI)和S-GQDs放大的雙重富集CE分離檢測三聚氰胺和雙氰胺。S-GQDs表面富含羥基、羧基和磺酸基,通過靜電作用對正電荷有很強(qiáng)的捕獲能力,結(jié)合FASI技術(shù),使檢測信號得到極大的提高。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

HP毛細(xì)管電泳儀(Agilent公司);熔融石英毛細(xì)管(內(nèi)徑50 μm,外徑365 μm,河北永年銳灃色譜器件有限公司); H7100透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司);紫外可見光譜儀(美國Perkin Elmer公司); FT-IR 6600傅里葉變換紅外光譜儀(江蘇天瑞儀器有限公司); pHSJ-4A型酸度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

三聚氰胺和雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)品(日本東京化成工業(yè)株式會社);鹽酸二甲雙胍(山東齊都藥業(yè)有限公司);檸檬酸、3-巰基丙酸(阿拉丁試劑有限公司);磷酸二氫鈉、NaOH、HCl(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)。所用試劑均為分析純,實驗用水為去離子水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

0.01 mol/L三聚氰胺和雙氰胺儲備液:分別稱取31.5 mg三聚氰胺和21.0 mg雙氰胺,加入5 mL甲醇溶解,然后加入去離子水使其完全溶解后轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中,定容,搖勻。使用時用50 mmol/L pH 4.6的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至所需濃度。

1.3 S-GQDs的制備

如圖1a所示,通過熱解法制備S-GQDs[21]:將2.0 g檸檬酸和0.3 mL 3 mmol/L 3-巰基丙酸置于5 mL四氟乙烯為內(nèi)襯的不銹鋼反應(yīng)釜中,密封后置于烘箱,于200 ℃反應(yīng)45 min,取上清液用1 000 Da的透析袋純化處理1天,即得純化的S-GQDs。

圖 1 (a)S-GQDs的制備和(b)三聚氰胺和雙氰胺在S-GQDs上的吸附Fig. 1 (a) Preparation of sulfur-doped graphene quantum dots (S-GQDs) and (b) adsorption of melamine and dicyandiamide on the S-GQDs

1.4 CE分離條件及檢測原理

基于FASI和S-GQDs的雙重富集CE分離檢測原理如圖2和圖1b所示,毛細(xì)管內(nèi)充滿50 mmol/L pH 4.6的磷酸鹽緩沖溶液(含25%的S-GQDs), 10 kV電動進(jìn)樣450 s,帶正電荷的三聚氰胺和雙氰胺快速向毛細(xì)管遷移,并在毛細(xì)管入口端進(jìn)行FASI預(yù)富集(見圖2a);同時緩沖溶液中帶負(fù)電荷的S-GQDs向陽極遷移,由于S-GQDs表面存在大量的羧基和磺酸基,在毛細(xì)管入口端通過靜電作用吸附樣品離子(見圖2b和圖1b),由于S-GQDs的表面積/體積比大,其吸附容量很高,能將大量樣品粒子吸附到其表面,低電滲流和S-GQDs的高吸附容量使進(jìn)樣時間達(dá)450 s,檢測信號得到極大程度的放大;吸附了樣品離子的S-GQDs表面帶上大量正電荷,使其電泳淌度轉(zhuǎn)向陰極端,在電泳和電滲流的共同作用下,S-GQDs載帶著樣品離子向陰極遷移,進(jìn)行分離檢測(見圖2c),檢測波長210 nm。

圖 2 基于場放大進(jìn)樣和石墨烯量子點雙重富集的 CE分離檢測示意圖Fig. 2 Schematic diagrams of CE separation based on field-amplified sample injection and graphene quantum dot dual preconcentration a. field-amplified sample injection preconcentration; b. preconcentration of S-GQDs as multianalyte carriers; c. CE separation. Veo: velocity of electroosmotic flow; Vep: velocity of electrophoresis.

圖 3 S-GQDs的(a)TEM圖、(b)粒徑分布圖和(c)XRD譜圖Fig. 3 (a) Transmission electron microscopy (TEM) image, (b)particle size distribution, and (c) X-ray diffraction (XRD) pattern of the as-prepared S-GQDs

圖 4 (a) S-GQDs的XPS全譜圖和(b)S 2p的高分辨XPS譜圖Fig. 4 (a) Full-range X-ray photoelectron spectrum (XPS) of S-GQDs and(b) high resolution XPS of S 2p

1.5 樣品處理

將二甲雙胍藥片研磨,過60目(0.25 mm)篩,稱取0.05 g藥品粉末置于10 mL具塞塑料管中,加入5 mL乙醇溶解,超聲30 min后,13 000 r/min離心10 min,取上清液,置于100 mL容量瓶中,定容,備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 S-GQDs的表征

S-GQDs的透射電鏡(TEM)圖(見圖3a)和粒徑分布圖(見圖3b)表明,所制備的S-GQDs呈球形,分散度好,粒徑均勻,平均粒徑4.7 nm; X射線衍射譜(XRD)圖(見圖3c)中2θ在23.3°附近的衍射峰對應(yīng)于石墨烯結(jié)構(gòu)[22]。

圖4a為S-GQDs的X射線光電子能譜(XPS)圖,在160、225、290和540 eV處觀測到4個初級峰,分別對應(yīng)于S 2p、S 2s、C 1s和O 1s, S 2s峰和S 2p峰表明硫原子成功摻雜到GQDs中。圖4b為S 2p的高分辨XPS譜,162.4 eV的峰值表明存在C-S(O2)-C單元。對XPS能譜分析可得S-GQDs中各元素含量百分比,S元素的含量達(dá)到16.25%,說明該制備方法能高效摻雜硫。XPS結(jié)果表明,S-GQDs富含磺酸基、羧基和羰基等官能團(tuán),這不僅使S-GQDs水溶性好,也為其作為載體通過靜電作用吸附陽離子提供可能。

圖 5 緩沖溶液中S-GQDs的體積分?jǐn)?shù)對三聚氰胺和雙氰胺富集分離的影響Fig. 5 Effect of the volume fraction of S-GQDs in the buffer on the analysis of melamine and dicyandiamideVolume fraction of S-GQDs: a. 0; b. 10%; c. 20%; d. 25%. Peak 1: melamine; peak 2: dicyandiamide.

2.2 S-GQDs富集

圖 6 進(jìn)樣時間對三聚氰胺和雙氰胺的 峰高和分離效率的影響Fig. 6 Effect of injection time on peak height and separation efficiency of melamine and dicyandiamide

2.3 緩沖溶液的選擇

三聚氰胺和雙氰胺都是堿性化合物,在pH小于8時帶正電荷。研究了不同濃度和pH的磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽等緩沖溶液對分離三聚氰胺和雙氰胺的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),用磷酸鹽緩沖溶液分離效果最好。改變磷酸鹽緩沖溶液的濃度(10～80 mmol/L),發(fā)現(xiàn)在50 mmol/L時三聚氰胺和雙氰胺的分離度最大,分離效率最高。

緩沖溶液的pH對三聚氰胺和雙氰胺的富集和分離效果影響顯著。電動進(jìn)樣時,帶正電荷的樣品離子與S-GQDs迎面相遇,由于靜電作用被吸附到S-GQDs表面,使S-GQDs表面帶上正電荷;吸附的三聚氰胺和雙氰胺離子越多,S-GQDs表面的正電荷就越多,從而導(dǎo)致S-GQDs向陽極方向的遷移速率減小,甚至停止或轉(zhuǎn)向。如果富集界面在進(jìn)樣過程中快速向檢測端遷移,為留出足夠長的毛細(xì)管進(jìn)行后續(xù)分離,進(jìn)樣時間就受到限制。S-GQDs的遷移速率(VS-GQDs)與其電泳速率(Vep,S-GQDs)及電滲流速率(Veo)的關(guān)系為:

VS-GQDs=Veo+Vep,S-GQDs

(1)

在界面處S-GQDs與三聚氰胺和雙氰胺作用后,形成的復(fù)合粒子的遷移速率(VR-N-S-GQDs)可表示為:

VR-N-S-GQDs=Veo+Vep,R-N-S-GQDs

(2)

從式(2)可以看出,減小電滲流速率Veo,可使復(fù)合粒子的遷移速率減小,允許較長的進(jìn)樣時間,增大檢測靈敏度。研究了緩沖溶液的pH(3.0～7.0)對檢測靈敏度、分離效率及遷移時間的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),pH在3.0～4.6范圍內(nèi),可以允許較長的進(jìn)樣時間,檢測靈敏度高,且隨著pH的增大,遷移時間減小,分離效率增大;當(dāng)pH在4.6～7.0范圍內(nèi)時,隨著pH的增大,允許的進(jìn)樣時間縮短,檢測靈敏度降低。綜合考慮靈敏度和分離效率,選擇緩沖溶液的pH為4.6。

2.4 進(jìn)樣時間的選擇

S-GQDs的吸附容量限制了FASI時間,如圖6所示,隨著進(jìn)樣時間的增大,三聚氰胺和雙氰胺峰高增大,當(dāng)進(jìn)樣時間超過450 s后,峰高增大的趨勢變小,分離效率降低。同時,在電泳譜圖中發(fā)現(xiàn),當(dāng)進(jìn)樣時間為450 s時,從進(jìn)樣開始到分離檢測結(jié)束,未檢測到游離的三聚氰胺和雙氰胺,說明450 s的進(jìn)樣時間引入的三聚氰胺和雙氰胺峰未超出S-GQDs的吸附容量,進(jìn)入毛細(xì)管的三聚氰胺和雙氰胺經(jīng)FASI預(yù)富集后全部被S-GQDs吸附,有效增大了檢測靈敏度,因此,選擇進(jìn)樣時間為450 s。

由于FASI過程中富集界面向檢測端的遷移速率很慢,因此可使進(jìn)樣時間達(dá)到450 s而不影響后續(xù)分離;同時,堆積在界面上的樣品離子與迎面而來的S-GQDs相互作用后,其向檢測端的遷移速率很慢,樣品離子與S-GQDs有足夠的時間相互作用,使樣品離子在S-GQDs表面得到最大程度的吸附,檢測信號得到極大程度的提高。如圖7所示,同常規(guī)電動進(jìn)樣(10 kV×10 s)相比,采用FASI與S-GQDs雙重放大技術(shù)可使檢測靈敏度提高1.6×105倍(峰高比×樣品稀釋因子)。

圖 7 富集前后對比Fig. 7 Comparison of electropherograms without (a) and with (b) FASI and S-GQDs dual preconcentration a. 50 mmol/L phosphate buffer solution; pH 4.6. The concentrations of both melamine and dicyandiamide were 1.0×10-6mol/L. Sample injection volume: 10 kV×10 s. b. Buffer solution (50 mmol/L phosphate+25% (v/v) S-GQDs). The concentrations of both melamine and dicyandiamide were 1.0×10-10mol/L. FASI volume: 10 kV×450 s. Peaks: 1. melamine; 2. dicyandiamide.

表 1 三聚氰胺和雙氰胺的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和精密度(n=5)Table 1 Regression equations, correlation coefficients (r2), linear ranges, LODs, and precisions (RSDs) of melamine and dicyandiamide (n=5)

2.5 方法學(xué)考察

在50 mmol/L pH 4.6的磷酸鹽緩沖溶液(含25%的S-GQDs)、10 kV電動進(jìn)樣450 s條件下,研究了三聚氰胺和雙氰胺的工作曲線、線性范圍、檢出限和精密度(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,RSD),如表1所示。以三聚氰胺和雙氰胺的濃度(c, mol/L)的負(fù)對數(shù)(x=-logc)為橫坐標(biāo),對應(yīng)的峰高(y)為縱坐標(biāo)繪制工作曲線,結(jié)果表明,兩種化合物在1.0×10-14～1.0×10-8mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.999,濃度檢出限(LOD,S/N=3)分別為2.6×10-15和5.7×10-15mol/L。

比較了文獻(xiàn)報道的不同方法檢測三聚氰胺和雙氰胺的檢出限,如表2所示,通過表中數(shù)據(jù)可以看出,本文方法具有最低的檢出限。

2.6 實際樣品檢測

將三聚氰胺和雙氰胺的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入二甲雙胍樣品中,按1.5節(jié)將樣品處理好后進(jìn)行回收率測定,如表3所示,三聚氰胺和雙氰胺的回收率分別為95.9%～102.4%和92.0%～106.0%,其RSD均小于5%。對每個加標(biāo)樣品進(jìn)行精密度試驗,日內(nèi)連續(xù)測定6次,連續(xù)測量5天,日內(nèi)和日間回收率的RSD小于12%,重復(fù)性良好。

表 3 鹽酸二甲雙胍樣品中三聚氰胺和雙氰胺的加標(biāo)回收率及其RSD(n=5)Table 3 Spiked recoveries of melamine and dicyandiamide and their RSDs in metformin hydrochloride samples (n=5)

3 結(jié)論

本文制備了易與陽離子結(jié)合的S-GQDs,以其為載體,結(jié)合FASI技術(shù),發(fā)展了一種雙重富集的CE分析技術(shù)同時分離檢測三聚氰胺和雙氰胺。通過控制緩沖溶液的pH,使進(jìn)樣時間延長至450 s,不僅增大了進(jìn)樣量,同時使樣品離子與S-GQDs有充足的時間相互作用,使樣品離子在S-GQDs表面得到最大程度的吸附。該雙重富集技術(shù)使靈敏度提高1.6×105倍,對三聚氰胺和雙氰胺的檢出限達(dá)2.6×10-15和5.7×10-15mol/L。該法成功用于二甲雙胍樣品中三聚氰胺和雙氰胺的高靈敏檢測,對實際樣品中三聚氰胺和雙氰胺的檢測有良好的應(yīng)用前景。