張朵朵，朱婷偉，陳復(fù)生*，殷麗君

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

我國是小麥生產(chǎn)大國，每年因小麥制粉約產(chǎn)生2 000萬噸麥麩。目前，大部分麥麩僅用于動物飼料，造成資源的巨大浪費[1]。麥麩中主要的非淀粉多糖因具有降血糖、增強(qiáng)免疫力、高生物相容性等重要生理活性而受到越來越多的關(guān)注[2-4]。阿拉伯木聚糖（arabinoxylan，AX）是麥麩中主要的非淀粉多糖，約占麥麩的20%，具有高黏度、高親水性等性質(zhì)，在穩(wěn)定乳液時，可以增大乳液的黏度，通過空間位阻來阻止液滴間的碰撞和聚集[5-7]。在功能性食品開發(fā)中，乳液可作為生物活性物質(zhì)的遞送體系，在飲料及乳制品開發(fā)中作為食品配方基料，近年來已成為食品中的研究熱點[8-10]。因此，開展小麥麩皮阿拉伯木聚糖（wheat bran arabinoxylan，WBAX）在乳液中的應(yīng)用研究對提高小麥麩皮附加值、促進(jìn)谷物加工副產(chǎn)品的綜合利用具有重要意義。目前，在乳液穩(wěn)定性的研究進(jìn)展中發(fā)現(xiàn)，多糖可作為制備乳液的穩(wěn)定粒子，但大多數(shù)植物多糖的表面活性主要是由于其含有蛋白質(zhì)或者是結(jié)構(gòu)中親水性和疏水性基團(tuán)的組合，表面活性較弱，不是良好的乳化劑，因此需要對多糖粒子進(jìn)行進(jìn)一步處理從而穩(wěn)定乳液[11]。其中，多糖與蛋白質(zhì)之間通過靜電或共價相互作用形成多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物穩(wěn)定乳液時，可以抵抗環(huán)境應(yīng)力（pH值、溫度和離子強(qiáng)度等），更好地提高乳液的穩(wěn)定性[12-14]。豌豆分離蛋白（pea protein isolate，PPI）具有均衡的氨基酸組成，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源[15]。此外，與大豆蛋白相比，其致敏性較低，營養(yǎng)價值相對較高，且未經(jīng)過基因改性[16]。因此，本研究利用豌豆分離蛋白改性小麥麩皮阿拉伯木聚糖并將其應(yīng)用在乳液體系中，對其乳化性能進(jìn)行研究。

基于此，本文以小麥麩皮為原料，通過堿溶醇沉法提取得到WBAX，對其進(jìn)行組成成分分析及鑒定。并對WBAX分別進(jìn)行加熱、添加PPI及添加PPI后加熱處理，得到4種乳化劑樣品，對各樣品的乳化特性進(jìn)行研究，同時通過熒光光譜、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）深入分析不同處理條件對WBAX乳化特性的影響及WBAX與PPI間的相互作用。最后，通過粒度儀及激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）研究乳液粒徑、Zeta-電位及微觀結(jié)構(gòu)變化，對WBAX作為粒子制備穩(wěn)定乳液應(yīng)用效果進(jìn)行初探，以期擴(kuò)大WBAX的應(yīng)用，開發(fā)性能優(yōu)良的乳液穩(wěn)定粒子。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

小麥麩皮（周麥27）：河南農(nóng)業(yè)科學(xué)院；PPI（蛋白含量86%）：西安維珍生物科技有限公司；α-淀粉酶（3 700 U/g）：北京索萊寶科技有限公司；D-木糖：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；金龍魚玉米油：益海嘉里糧油有限公司；三氟乙酸、甲醇、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、氯仿：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為色譜純。

LGJ-25C型冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；FM200型高速剪切分散乳化機(jī)：上海弗魯克科技發(fā)展有限公司；Nano-ZS90型激光粒度儀：英國Malvern公司；激光共聚焦掃描電鏡：日本OLYMPUS公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 WBAX的提取

采用堿溶醇沉法提取 WBAX[17]。以料液比 1∶4（g/mL）向小麥麩皮中加入蒸餾水后沸水浴加熱40 min，待溫度降低至80℃加入α-淀粉酶以除去淀粉，沸騰蒸餾水沖洗5次，于烘箱中75℃干燥4h，冷卻至室溫（25℃）后于4℃保存?zhèn)溆?。向去淀粉后的麥麩中加?倍體積的0.25mol/L NaOH溶液，180 r/min避光旋轉(zhuǎn)堿提4 h后離心（6 000 r/min，20 min），將上清液 pH 值調(diào)至 4，再次離心（6 000 r/min，20 min），取上清液，按 1∶3 的體積比加入無水乙醇，收集沉淀，凍干，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 WBAX鑒定

1.2.2.1 組成成分分析

水分、灰分、粗蛋白含量測定分別參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》、GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》、GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》；AX含量根據(jù)間苯三酚-鹽酸法測定，木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=0.446 5x+0.135 2，R2=0.992 5，AX的含量計算公式如下。

式中：C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的木糖含量，μg/mL；0.88為AX與木糖的比例系數(shù)；m為WBAX質(zhì)量，mg。

1.2.2.2 單糖組成

取0.1 mL 5 mg/mL的WBAX溶液與0.1 mL 4 mol/L三氟乙酸溶液混合于安瓿瓶中，熱封后110℃保持5 h后氮氣吹干，然后加入等體積甲醇氮氣吹干3次后溶于0.2mL超純水中，取0.1mL上述溶液與等體積0.5mol/L NaOH溶液及0.2 mL 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液混合，于70℃反應(yīng)100 min，再用0.3 mol/L HCl溶液調(diào)至中性，加等體積氯仿萃取3次后過0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。色譜柱 ZORBAX Eclipse XDB-C18，流動相0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液-乙腈（體積比為 83∶17），流速 1 mL/min，柱溫 30 ℃。

1.2.3 樣品制備

稱取一定量的WBAX和PPI分別分散于去離子水中使之濃度均為10 mg/mL，室溫（25℃）攪拌使WBAX和PPI充分分散后于4℃冰箱中水化過夜。將上述溶液pH值調(diào)至10后取一定量的WBAX溶液和PPI溶液等體積混合，之后將WBAX溶液、WBAX和PPI的混合液于90℃加熱3 h，所得樣品分別命名為WBAX-3及WBAX/PPI-3。未加熱的WBAX溶液、未加熱的WBAX和PPI混合液分別命名為WBAX-0、WBAX/PPI-0。

1.2.4 乳化性和乳化穩(wěn)定性

將濃度為5 mg/mL的WBAX-0、WBAX-3、WBAX/PPI-0、WBAX/PPI-3分別與大豆油按體積比3∶1混合，以13 500 r/min高速剪切1 min后倒入50 mL小燒杯中。分別于0、10 min從燒杯底部0.5 cm處取50 μL乳化液，將乳化液與5 mL 0.1%SDS混合，測定其在500 nm處的吸光度值。根據(jù)以下公式計算其乳化活力指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）。

式中：A0為0 min的吸光度值；N為稀釋倍數(shù)（100）；C為樣品濃度，g/mL；θ為油相體積（0.75）；ΔT為時間差，min；ΔA為ΔT內(nèi)的吸光值差。

1.2.5 熒光光譜分析

用去離子水分別將 WBAX-0、WBAX-3、WBAX/PPI-0、WBAX/PPI-3稀釋至1 mg/mL，用熒光分光光度計在激發(fā)波長280 nm、發(fā)射波長300 nm～500 nm、激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度5 nm下，測定樣品的熒光發(fā)射光譜。

1.2.6 SDS-PAGE分析

將 WBAX-0、WBAX-3、WBAX/PPI-0、WBAX/PPI-3分別與樣品緩沖液按1∶1的體積比混合（混合后樣品濃度為5 mg/mL），將上述混合物在100℃下煮沸3 min，冷卻至室溫（25℃），各取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.7 乳液的制備

將 WBAX-0、WBAX-3、WBAX/PPI-0、WBAX/PPI-3分別與大豆油以9∶1的體積比進(jìn)行混合（加入0.01%的疊氮鈉抑制微生物生長），高速剪切分散機(jī)以13500 r/min剪切3min，然后在超聲功率500W的條件下超聲3min制備乳液。

1.2.8 乳液粒徑和電位的測定

采用Malvern激光粒度儀測定乳液的粒徑和Zeta-電位。為避免多重散射的影響，將乳液稀釋200倍。粒徑參數(shù)設(shè)置為顆粒折射率1.450、顆粒吸收率0.001、分散劑為水、分散劑折射率1.330。

1.2.9 乳液的微觀結(jié)構(gòu)觀察

向1 mL乳液中加入20 μL尼羅紅溶液（1 mg/mL）和20 μL異硫氰酸熒光素（10 mg/mL二甲亞砜），染色1 h。將染色后的乳液置于載玻片上，蓋上蓋玻片后倒置于CLSM載物臺上。利用Leica軟件采集和分析樣品的CLSM圖像。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0和SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)，每個指標(biāo)至少重復(fù)測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 WBAX的成分分析與表征

2.1.1 WBAX成分分析

WBAX的基本成分如表1所示。

表1 WBAX的基本成分Table 1 Basic components of WBAX

WBAX中主要成分為AX，其含量為68.21%，水分及灰分含量分別為6.57%及8.59%，這也與呂丁陽等[18]、張梅紅[19]的結(jié)果相似。此外，WBAX中存在少量蛋白質(zhì)（7.68%），一部分蛋白可能是提取過程中pH值調(diào)節(jié)至4.0～4.3，未能使WBAX中游離蛋白質(zhì)全部沉淀析出；另一部分蛋白可能是通過阿魏酸連接到WBAX的結(jié)合蛋白。盡管WBAX中蛋白含量較少，但對WBAX的乳化特性具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)WBAX作為乳化劑穩(wěn)定乳液時，WBAX中的蛋白可以吸附到油水界面處，從而使WBAX也遷移至油水界面處，而WBAX糖鏈延伸至水相中，通過空間位阻、范德華力等作用阻礙油滴聚集，進(jìn)而提高乳液穩(wěn)定性[6]。

2.1.2 WBAX單糖組成

單糖標(biāo)樣和WBAX的高效液相色譜圖如圖1所示。

圖1 單糖標(biāo)樣和WBAX的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of standard monosaccharide and WBAX

根據(jù)圖1各單糖標(biāo)樣與WBAX樣品的保留時間確定其單糖的種類，通過峰面積確定WBAX樣品中各單糖的物質(zhì)的量比，得到WBAX的單糖組成如表2所示。

表2 WBAX的單糖組成成分Table 2 Composition of monosaccharide of WBAX

WBAX中木糖（Xyl）與阿拉伯糖（Ara）含量最高，分別為51.74%和38.37%，且兩者單糖含量之和大于85%，這與WBAX結(jié)構(gòu)（Xyl為主鏈、Ara為側(cè)鏈）相對應(yīng)。Ara/Xyl的比值可反應(yīng)WBAX的分支程度，有研究表明，Ara/Xyl比值高、分子量低的AX具有良好生理功能[20-21]。其它幾種單糖中，葡萄糖含量相對較高，為5.66%，這可能與提取過程中使用乙醇使其析出有關(guān)[22]。

綜合上述WBAX的組成及表征分析結(jié)果可知，堿溶醇沉法提取得到的WBAX符合木糖為主鏈、阿拉伯糖為側(cè)鏈的典型結(jié)構(gòu)；且WBAX中含有少量的蛋白質(zhì)，可作為潛在的乳化劑應(yīng)用于乳液中。

2.2 乳化特性分析

為了進(jìn)一步考察堿溶醇沉法提取得到的WBAX作為乳化劑在乳液中的應(yīng)用效用，對不同處理條件下的WBAX乳化特性進(jìn)行研究。而乳化特性一般通過EAI和ESI來評價。其中，EAI是指樣品形成乳液的能力；ESI是指樣品在一定時間內(nèi)保持液滴分散，防止脂肪上浮、絮凝和凝結(jié)，從而防止乳液出現(xiàn)相分離的能力。因此研究樣品的乳化特性對其在乳液中的應(yīng)用具有重要作用。不同處理條件下的WBAX乳化特性見圖2。

圖2 不同條件下WBAX的乳化特性Fig.2 Emulsifications characteristics of WBAX under different conditions

WBAX-0、WBAX-3、WBAX/PPI-0、WBAX/PPI-3的 EAI和 ESI分別為 28.30、28.37、28.93、30.80 m2/g和61.30、155.14、72.53、240.05 min。與 WBAX-0 相比，WBAX-3的ESI顯著提高，WBAX-3的ESI提高可能是由于加熱提高了WBAX的溶解性或者是加熱使WBAX與其所包含的少量蛋白質(zhì)發(fā)生了美拉德反應(yīng)。與WBAX-0相比，WBAX/PPI-0的EAI顯著提高，這說明添加PPI后改善了WBAX乳液的EAI。與WBAX/PPI-0相比，WBAX/PPI-3的EAI和ESI均顯著提高，推測可能是在加熱條件下WBAX與PPI發(fā)生了糖基化反應(yīng)使WBAX/PPI-3粒子緊密地吸附在油/水界面處，形成穩(wěn)定的黏彈性膜，降低界面張力并穩(wěn)定油滴以防止聚結(jié)，從而極大地提高了乳液的EAI和ESI[23]。適當(dāng)對WBAX進(jìn)行熱處理或添加PPI均可以提高WBAX的乳化特性，特別是熱處理協(xié)同添加PPI的WBAX/PPI-3具有良好的乳化特性，可以作為潛在的穩(wěn)定粒子用于乳液中。

2.3 結(jié)構(gòu)特性分析

為了深入研究不同處理條件對WBAX乳化特性的影響及WBAX與PPI間的相互作用，進(jìn)行了熒光光譜、SDS-PAGE結(jié)構(gòu)特性分析。

2.3.1 熒光光譜分析

一般情況下，蛋白質(zhì)的酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）殘基可以在280 nm處激發(fā)出一定的熒光強(qiáng)度，且對所處環(huán)境極性的改變非常敏感。因此，可以通過對比不同樣品間熒光光譜的差異來表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化及蛋白質(zhì)和環(huán)境之間相互作用[24]。各樣品的熒光光譜如圖3所示。

圖3 各乳化劑的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of emulsifiers

由于WBAX中含有少量蛋白質(zhì)（7.68%），因此WBAX-0和WBAX-3在激光波長300 nm～500 nm存在較弱的熒光吸收。WBAX/PPI-0、WBAX/PPI-3的最大發(fā)射波長（λmax）分別為 340、345 nm。與 WBAX/PPI-0相比，WBAX/PPI-3的λmax往長波方向移動，即發(fā)生了紅移，說明其色氨酸殘基趨向于親水性的微環(huán)境，這是由于WBAX/PPI-3中的PPI與WBAX在加熱條件下發(fā)生了共價結(jié)合使得復(fù)合物的微環(huán)境的極性增強(qiáng)[25]。

2.3.2 SDS-PAGE分析

SDS-PAGE是分析蛋白質(zhì)組成和分子量分布的重要方法。當(dāng)?shù)鞍着c糖發(fā)生相互作用時，其電泳條帶會發(fā)生變化，因此通常使用SDS-PAGE來表征蛋白-糖共價復(fù)合物的形成。各樣品的SDS-PAGE如圖4所示。

圖4 各乳化劑的SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE of emulsifiers

WBAX（泳道1、泳道2）雖然含有少量蛋白質(zhì)（7.68%），但是由于一部分蛋白通過共價作用連接至WBAX上，而多糖分子量較大不能進(jìn)入泳道，其次，WBAX中的游離蛋白含量過低，因此不能在SDSPAGE圖譜上顯示出蛋白電泳條帶。相較于WBAX/PPI-0（泳道 3）而言，WBAX/PPI-3（泳道 4）的電泳條帶均變淺且部分條帶消失，電泳條帶有明顯上移現(xiàn)象，此外分離膠頂部的條帶略微加深且凝縮膠進(jìn)樣孔處藍(lán)色染色帶加深，濃縮膠與分離膠的交界處拖尾現(xiàn)象明顯，說明在加熱條件下，WBAX與PPI之間發(fā)生了美拉德反應(yīng)，形成了高分子量的共價復(fù)合物。

2.4 在乳液中的應(yīng)用

2.4.1 乳液粒徑及電位

乳液的平均粒徑及Zeta-電位如圖5所示。

圖5 乳液的平均粒徑及Zeta-電位Fig.5 Average particle size and Zeta-potential of emulsions

乳液粒徑及其所帶電荷是乳液的重要特征參數(shù)，一般來說，當(dāng)乳液粒徑較小時，乳滴間的布朗運動減弱，碰撞概率降低，有利于其穩(wěn)定性[26]。乳液Zeta-電位絕對值越高，乳滴間的排斥力越大，乳液穩(wěn)定性越好[27]。如圖 5 所示，WBAX-0、WBAX-3、WBAX/PPI-0、WBAX/PPI-3所穩(wěn)定的乳液的平均粒徑分別為1 461、1 018、1 109、735 nm。與 WBAX-0相比，WBAX-3所穩(wěn)定的乳液的平均粒徑顯著降低。推測原因是由于加熱提高了WBAX的溶解性，進(jìn)而降低其所穩(wěn)定的乳液的平均粒徑。與WBAX-0相比，WBAX/PPI-0所穩(wěn)定的乳液平均粒徑降低，這表明PPI的加入不僅沒有增加乳液液滴的粗糙度，反而降低了油滴的尺寸。與WBAX/PPI-0相比，WBAX/PPI-3所穩(wěn)定的乳液的平均粒徑顯著降低，這說明WBAX與PPI的共價復(fù)合物所穩(wěn)定的乳液具有較好穩(wěn)定性。WBAX-0、WBAX-3、WBAX/PPI-0、WBAX/PPI-3所穩(wěn)定的乳液的Zeta-電位絕對值分別為 16、18、27、28 mV，這說明添加 PPI后的WBAX所穩(wěn)定的乳液液滴所帶電荷增大。乳液液滴間靜電斥力增大，可以有效防止油滴聚集，因此形成的乳液更穩(wěn)定[28]。

2.4.2 乳液微觀結(jié)構(gòu)

利用CLSM可以更加直觀的觀察到乳液液滴的整體分布和結(jié)構(gòu)。圖6展示了不同粒子穩(wěn)定的乳液的微觀結(jié)構(gòu)，圖中綠色和紅色分別代表水相和油相。

圖6 乳液的激光共聚焦圖像Fig.6 CLSM images of emulsions

WBAX-0所穩(wěn)定的乳液的油滴粒徑較大且分布不均一，小油滴易附著在大油滴表面，進(jìn)而引起聚集現(xiàn)象。WBAX-3和WBAX/PPI-0所穩(wěn)定的乳液液滴尺寸降低，但形成的液滴大小分布不一。WBAX/PPI-3所穩(wěn)定的乳液油滴粒徑大幅度變小且分布相對均勻，表明WBAX/PPI-3所穩(wěn)定的乳液具有較好穩(wěn)定性。CLSM的結(jié)果與粒度儀測定的各樣品所穩(wěn)定的乳液的粒徑結(jié)果相一致。

綜上可得，利用不同條件處理后的WBAX粒子可制備得到具有一定穩(wěn)定性的乳液，特別是WBAX/PPI-3可作為穩(wěn)定粒子用于制備均一、穩(wěn)定的乳液。

3 結(jié)論

本試驗以小麥麩皮為原料，采用堿溶醇沉方法提取得到了WBAX，鑒定發(fā)現(xiàn)提取的WBAX符合木糖為主鏈、阿拉伯糖為側(cè)鏈的典型結(jié)構(gòu)，且WBAX中含有少量的蛋白質(zhì)，可作為乳化劑應(yīng)用于乳液中。進(jìn)一步對WBAX及添加PPI后的WBAX進(jìn)行熱處理（90℃，加熱3 h），得到WBAX-3和WBAX/PPI-3復(fù)合物樣品，結(jié)果表明WBAX/PPI-3的EAI和ESI顯著增強(qiáng)；WBAX/PPI-3的熒光光譜發(fā)生紅移，親水性增強(qiáng)；熱處理條件下WBAX與PPI發(fā)生了美拉德反應(yīng)，生成了大分子復(fù)合物；WBAX/PPI-3粒子所穩(wěn)定的乳液平均粒徑較小且分布相對較為均勻，電位絕對值較高，靜電斥力較大，所形成的乳液更穩(wěn)定。本研究利用豌豆分離蛋白改性小麥麩皮阿拉伯木聚糖并應(yīng)用在乳液體系中，擴(kuò)大了小麥麩皮阿拉伯木聚糖在食品中的應(yīng)用。