王月，趙彥巧，李建穎（天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134）

紫蘇（Perilla frutescent（L.）Britt），是一種具有特殊香氣的藥食同源植物[1]，又名蘇子[2]，其紫蘇葉、紫蘇子、紫蘇梗均被《中國藥典》所收錄[3]。紫蘇葉含有許多營養(yǎng)物質(zhì)，如酚類、氨基酸、花色苷、維生素和礦物質(zhì)[4]，其莖、葉、根和種子等均可直接或加工后食用。研究表明，紫蘇具有良好的抗氧化性[5]、抗菌性[6]、抗過敏性[7]、止嘔[8]等多種生物學功能?；ㄉ兆鳛橐环N天然色素，廣泛存在于葉片、花、果實等器官中并賦予其紅、橙、紫等不同顏色。目前已知的花色苷有二十多種，大量的研究結(jié)果表明，花色苷類化合物有一定的營養(yǎng)和藥理作用，具有良好的抗氧化[9]、抗癌[10]、抗腫瘤、抗炎殺菌、降血糖[11]等活性。目前，食品安全問題備受關(guān)注，花色苷作為一種安全性高、色澤鮮艷的天然可食用色素，廣泛應(yīng)用于食品、藥品以及化妝品等行業(yè)。

目前，國內(nèi)外對紫蘇葉花色苷提取及抗氧化活性的研究已有報道。Meng等[12]測定了從廣州、遼寧等地采集到的不同品種花色苷的含量為6 mg/g干重～7 mg/g干重。崔麗霞[13]采用超聲波輔助提取法提取紫蘇葉中的花色苷和多酚類化合物，提取量分別為6.44mg CGE/g和63.11mgGAE/g。此外 Gül?in 等[14]對紫蘇葉花色苷的活性研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇葉花色苷對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基等有很強的清除能力。超聲輔助作為提取天然物質(zhì)的輔助手段，比傳統(tǒng)方法更節(jié)約時間，對遇熱不穩(wěn)定的成分有保護作用，有利于節(jié)約能源[15-16]。本研究以紫蘇葉為原料，以酸化乙醇為溶劑采用超聲輔助提取紫蘇葉花色苷，分析多個因素對紫蘇葉花色苷提取量的影響，通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化得到最佳提取工藝，并對紫蘇葉花色苷的體外抗氧化活性進行分析，為紫蘇葉花色苷的理論研究及其工業(yè)化運用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇葉：河北祁州中藥材種植園。

無水乙醇、濃鹽酸、無水乙酸鈉、氯化鉀（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（純度＞97.0%）：東京化成工業(yè)株式會社；Trolox（純度＞97.0%）：源葉生物科技有限公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS]（純度＞98.0%）：上海易恩化學技術(shù)有限公司；過氧化氫（30%）：天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平（AX224ZH）、pH 計（ST3100）：奧豪斯儀器有限公司；真空冷凍干燥機（LGJ-1A-50）：科儀創(chuàng)智（北京）科技發(fā)展有限公司；紫外可見分光光度計（UV-2600）：島津儀器有限公司；多功能粉碎機（YB-2500A）：永康市速鋒工貿(mào)有限公司；高速冷凍離心機（CL5R）：湘儀離心機儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV10DIGITAL）：艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫蘇葉前處理

取新鮮干紫蘇葉放入烘箱40℃烘6 h。取出干燥后的紫蘇葉，用多功能粉碎機打碎后過60目篩，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 紫蘇花色苷提取工藝

紫蘇葉前處理→超聲輔助提取→離心取上清液→pH示差法測定上清液吸光度→計算提取量。

1.3.3 紫蘇葉花色苷提取量的測定

pH示差法[17]測定花色苷含量。

式中：ΔA=（A520nm(pH1.0)-A700nm(pH1.0)）-（A520nm(pH4.5)-A700nm(pH4.5)）；V為體積，mL；F為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊素葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside）的分子量，449.2g/mol；ε 為摩爾消光系數(shù)26 900 L/（mol·cm）；l為比色皿厚度，cm；W為樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗設(shè)計

準確稱量1 g的紫蘇葉粉，加入不同濃度不同體積的酸化乙醇（pH2）進行超聲提取。以紫蘇葉花色苷的提取量為衡量指標，分別考察4個因素對花色苷提取量的影響：提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）、超聲時間（10、20、30、40、50 min）、乙醇體積分數(shù)（25%、30%、35%、40%、45%）和液料比[5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）]。每個處理做 3 個平行。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法（BBD模型）篩選出花色苷提取的最佳提取工藝條件，因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels for response surface design

1.3.6 DPPH自由基清除能力的測定

參考石雪萍等[18]的方法并稍作改動。取1 mL 0.1 mmol/L DPPH+1.5 mL無水乙醇+0.5mL不同濃度花色苷溶液于比色皿中混合均勻，置于25℃避光的環(huán)境中 30 min，測 A（517nm），計算公式如下。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為用等量無水乙醇代替DPPH溶液的樣品的吸光度；A0為用等量無水乙醇代替花色苷溶液即空白對照溶液的吸光度。樣品的對照組為與其濃度相同的Trolox，每份處理做3個平行。

1.3.7 ABTS+自由基清除能力的測定

參考宋思圓等[19]的方法并稍作改動。配制ABTS母液：將245 μL（100 mmol/L）過硫酸鉀溶液置于10 mL容量瓶中，加入9.5 mL的7 mmol/L ABTS溶液，用超純水補齊至刻度，混合均勻，用錫紙包裹容量瓶在黑暗中靜置16 h。向pH7.4的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中滴加 ABTS 母液，測得 A（734nm）=0.7±0.02，即得ABTS工作液。取3mLABTS工作液和0.03mL不同濃度花色苷溶液于比色皿中，混合均勻在黑暗環(huán)境中反應(yīng) 6 min，測 A（734nm），計算公式如下。

ABTS+自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為用等量無水乙醇代替ABTS工作液的樣品的吸光度；A1為用等量無水乙醇代替花色苷溶液即空白對照溶液的吸光度。樣品的對照組為與其濃度相同的Trolox，每份處理做3個平行。

1.3.8 羥基自由基清除能力的測定

參考張玲等[20]的方法并稍作改動。分別配制4.5 mmol/L水楊酸、4 mmol/L FeSO4和8.8 mmol/L H2O2備用。反應(yīng)體系為1 mL FeSO4+1 mL水楊酸+1 mL H2O2+1 mL不同濃度花色苷溶液，將溶液添加至比色皿中，混合均勻置于黑暗環(huán)境中 30 min，測 A（510nm），計算公式如下。

羥基自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為用等量蒸餾水代替H2O2溶液的樣品的吸光度；A0為用等量蒸餾水代替花色苷溶液即空白對照溶液的吸光度。樣品的對照組為與其相同濃度的Trolox，每份處理做3個平行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果表示成平均值±標準差；用Origin 2019b作圖；用SPSS 25進行數(shù)據(jù)分析；響應(yīng)面試驗用Design Expert 10.0分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果

2.1.1 提取溫度對花色苷提取量的影響

提取溫度對花色苷提取量的影響見圖1。

圖1 提取溫度對花色苷提取量的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of anthocyanin

由圖1可知，在30℃～50℃內(nèi)隨著提取溫度的升高，紫蘇葉花色苷的提取量從626.54 mg/100 g增加到725.62 mg/100 g；再繼續(xù)升溫至70℃，花色苷的提取量又下降至655.71 mg/100 g，表明溫度對花色苷的溶解有一定的影響。升溫能加快分子運動[21]，提高溶液擴散速度，有助于提高乙醇對花色苷的溶解度；但花色苷耐熱性較差，提取溫度過高，花色苷結(jié)構(gòu)受到破壞,降低花色苷得率。因此提取溫度選擇45、50、55℃進一步優(yōu)化。

2.1.2 超聲時間對花色苷提取量的影響

超聲時間對花色苷提取量的影響見圖2。

圖2 超聲時間對花色苷提取量的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time on the yield of anthocyanin

由圖2可知，10 min～40 min隨著超聲時間的延長，紫蘇葉花色苷的提取量從511.65 mg/100 g增加到714.04 mg/100 g，并在40 min時達到最大。表明一定范圍內(nèi)延長超聲時間對紫蘇葉中花色苷成分的溶出有一定的促進作用。但是時間延長到40min～50min，提取量不升反降，這可能是由于超聲波作用時間過長花色苷結(jié)構(gòu)遭到破壞，花色苷被氧化降解使提取量呈下降趨勢。因此超聲時間選擇35、40、45 min進一步優(yōu)化。

2.1.3 乙醇體積分數(shù)對花色苷提取量的影響

乙醇體積分數(shù)對花色苷提取量的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分數(shù)對花色苷提取量的影響Fig.3 Effects of ethanol volume fraction on the yield of anthocyanin

由圖3可知，在25%～40%范圍內(nèi)，紫蘇葉花色苷的提取量隨著乙醇體積分數(shù)增大呈逐步上升的趨勢，在乙醇體積分數(shù)40%時花色苷提取量達到最大，為712.93 mg/100 g。這種情況可能是因為水分含量過多，乙醇含量過少，水溶性雜質(zhì)在此體系中的溶解性較好，使花色苷溶出比例降低。隨著乙醇體積分數(shù)的增加，溶劑對細胞的滲透作用也會增大，有利于將花色苷從細胞中溶解釋放出來，但乙醇體積分數(shù)過大，提取液極性過低，花色苷溶出度和得率就會大幅下降[22]，導致花色苷含量不升反降。所以選擇35%、40%、45%的乙醇溶液進一步優(yōu)化。

2.1.4 液料比對花色苷提取量的影響

液料比對花色苷提取量的影響見圖4。

圖4 液料比對花色苷提取量的影響Fig.4 Effects of liquid to material ratio on the yield of anthocyanin

由圖4可知，溶劑用量從5 mL增加到15 mL，紫蘇葉花色苷提取量增加了一倍，表明一定范圍內(nèi)溶劑用量增加有利于原料中花色苷的傳質(zhì)與擴散，提高花色苷溶出率，提升提取率。當液料比為15∶1（mL/g）時，提取量為 696.68 mg/100 g，液料比繼續(xù)增加到 25∶1（mL/g）時，提取量增幅不大。考慮到增加液料比會增加溶劑消耗，使提取液的體積太大，不利于后續(xù)濃縮步驟的進行。因此在優(yōu)化試驗中選擇 10∶1、15∶1、20∶1（mL/g）進一步優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

依據(jù)2.1的試驗結(jié)果，利用響應(yīng)面軟件Design Expert 10.0設(shè)計四因素三水平的試驗，考察提取溫度（A）、超聲時間（B）、乙醇體積分數(shù)（C）和液料比（D）對結(jié)果的影響。試驗方案和結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Results of response surface test

2.2.2 模型方程的建立與顯著性試驗

采用Design-Expert 10.0軟件對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行擬合回歸分析，得出花色苷提取量為目標函數(shù)的二次回歸方程Y=716.04-1.63A+1.80B-2.48C+4.53D+2.75AB-0.05AC-0.65AD-1.2BC-10.65BD-9.5CD-9.65A2-7.87B2-14.27C2-15.44D2?；貧w模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance in regression model

由表3可知，模型F=148.27，表明該模型具有很高的精準度。模型P＜0.000 1，表明該模型達到高度顯著水平。在此情況下，一次項C、D是影響模型的重要參數(shù)，A、B是影響模型的參數(shù)；二次項BD、CD對模型影響很大，AB對模型有一定的影響，AC、AD、BC對模型的影響不顯著。各因素對花色苷提取量影響順序為D＞C＞B＞A。失擬項P＞0.05不顯著，說明該響應(yīng)面模型存在的誤差較小，因此二次模型較合理。綜上表明，該模型設(shè)計的參數(shù)可以進行花色苷提取。

2.2.3 因素間交互作用的響應(yīng)面分析結(jié)果

各因素交互作用對花色苷提取量影響的響應(yīng)面圖見圖5。

等高線和3D響應(yīng)曲面圖能比較直觀地反映4個因素對花色苷提取量的影響。等高線的形狀可以反映出交互作用的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反；從3D曲面圖來看，曲面越陡峭表明試驗因素對花色苷提取量影響越大，交互作用越顯著。由圖 5（b）、（c）、（d）可知 3D 響應(yīng)曲面圖坡度平緩，等高線接近圓形，表明溫度和乙醇濃度、溫度和液料比、時間和乙醇濃度間的交互作用不顯著。圖5（a）、（e）、（f）等高線接近橢圓，3D 響應(yīng)曲面圖陡峭，表明溫度和時間、時間和液料比、乙醇濃度和液料比間交互作用顯著。

圖5 各因素交互作用對花色苷提取量的影響Fig.5 The influence of the interaction of various factors on the extraction amount of anthocyanins

2.2.4 驗證試驗結(jié)果

經(jīng)過Design-Expert 10.0軟件分析得到了紫蘇葉花色苷最佳提取工藝為提取溫度49.52℃，超聲時間37.42min，乙醇體積分數(shù) 39.23%，液料比 16.03∶1（mL/g），紫蘇葉花色苷提取量的理論值為716.75 mg/100 g?？紤]實際操作修訂為提取溫度50℃，超聲時間37 min，乙醇體積分數(shù)40%，液料比16∶1（mL/g）。此條件下做驗證試驗，得到提取量為715.56 mg/100 g，與理論值716.75 mg/100 g相近，表明該模型有較好的預(yù)測作用，合理可行。

2.3 紫蘇葉花色苷對DPPH自由基清除能力的分析

紫蘇葉花色苷對DPPH自由基的清除能力見圖6。

圖6 紫蘇葉花色苷對DPPH自由基的清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging activity of Perilla leaves anthocyanins

DPPH自由基具有單一電子，可以與抗氧化劑提供的電子或氫原子結(jié)合，發(fā)生反應(yīng)使醇溶液從原來的紫色逐漸變淺，且與清除劑濃度呈一定的量效關(guān)系[23]。由圖6可知，隨著質(zhì)量濃度從0.04 mg/mL增加到0.09 mg/mL，紫蘇葉花色苷清除DPPH自由基的能力從33.42%上升到84.42%，且上升趨勢大于Trolox。兩者在0.09 mg/mL時清除率均達到最大，分別為84.42%和97.22%，表明紫蘇葉花色苷能較好地清除DPPH自由基。

2.4 紫蘇葉花色苷對ABTS+自由基清除能力的分析

紫蘇葉花色苷對ABTS+自由基的清除能力見圖7。

圖7 紫蘇葉花色苷對ABTS+自由基的清除能力Fig.7 ABTS+radical scavenging activity of Perilla leaves anthocyanins

從圖7可知，隨著質(zhì)量濃度增加，Trolox和紫蘇葉花色苷的清除率均上升，對照組的上升趨勢大于試驗組，且同一濃度下Trolox的清除率大于紫蘇葉花色苷。當質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL時紫蘇葉花色苷和Trolox對ABTS+自由基的清除效率均達到最大，分別為47.85%和99.74%，表明紫蘇葉花色苷有一定的ABTS+自由基清除能力，可作為抗氧化成分可與ABTS+反應(yīng)，使原本藍綠色的反應(yīng)體系褪色，終止自由基的連鎖反應(yīng)，從而清除或抑制ABTS+自由基生成。

2.5 紫蘇葉花色苷對羥基自由基清除能力的分析

紫蘇葉花色苷對羥基自由基的清除能力見圖8。

羥基自由基對人體危害較大，當羥基自由基產(chǎn)生與清除不平衡時，會影響機體正常生理功能[24]。由圖8可知，紫蘇葉花色苷和Trolox對羥基自由基的清除率與質(zhì)量濃度成正比，但紫蘇葉花色苷的清除能力低于Trolox。當質(zhì)量濃度為1.1 mg/mL時紫蘇葉花色苷和Trolox對羥基自由基的清除效率均達到最大，分別為51.27%和96.68%。表明紫蘇葉花色苷有一定的羥基自由基清除能力，紫蘇葉花色苷作為供氫體與氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基結(jié)合，從而保護機體免受羥基自由基的損壞。

圖8 紫蘇葉花色苷對羥基自由基的清除能力Fig.8 Hydroxyl radical scavenging activity of Perilla leaves anthocyanins

3 結(jié)論

采用超聲輔助提取紫蘇葉花色苷，用酸化乙醇作為提取溶劑，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗確定了最佳提取工藝條件。試驗結(jié)果表明，各因素對花色苷提取量的影響順序為料液比＞乙醇體積分數(shù)＞超聲時間＞提取溫度。最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù) 40%、液料比 16∶1（mL/g）、超聲時間 37 min、提取溫度50℃，此時紫蘇葉花色苷提取率最高，達到了715.56 mg/100 g。體外抗氧化活性試驗表明，紫蘇葉花色苷對3種自由基都具有良好的清除能力，且其抗氧化能力與紫蘇葉花色苷濃度總體呈正比，紫蘇葉花色苷對DPPH自由基、ABTS+自由基和羥基自由基的清除率分別達到84.42%，47.85%和51.27%。

綜上所述，超聲輔助提取對紫蘇葉花色苷的優(yōu)化工藝可行，試驗結(jié)果穩(wěn)定可靠，具有較強的體外抗氧化能力，試驗結(jié)果為紫蘇葉花色苷在食用藥用方面的開發(fā)提供了一定技術(shù)支持和理論數(shù)據(jù)參考。