何旎清 楊德衛(wèi) 鄭向華 黃鳳凰 程朝平 葉 寧

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所, 福建 福州 350018)

由稻瘟病菌引起的稻瘟病是一種世界性病害[1]，也是我國(guó)水稻新品種審定中實(shí)行“一票否決制”的水稻病害，近年來(lái)其危害性和蔓延面積呈不斷上升的趨勢(shì)。稻瘟病不僅會(huì)引起水稻大幅減產(chǎn)(10%～35%)[2]，嚴(yán)重時(shí)甚至顆粒無(wú)收[3]，而且能影響稻米品質(zhì)。國(guó)內(nèi)外研究者利用不同的研究方法和不同的遺傳定位群體，已鑒定了500多個(gè)稻瘟病相關(guān)基因，這些基因分別位于水稻12條不同的染色體上[2]。其中，研究者利用圖位克隆等方法，已從水稻中克隆了Pit、Pi2、Pi9、Piz-t、Pigm、Pib和Pita等25個(gè)稻瘟病抗性R基因[2]。

谷梅4號(hào)是起源于我國(guó)農(nóng)家品種的育種材料。近期，何祖華研究團(tuán)隊(duì)從起源于我國(guó)農(nóng)家品種的育種材料谷梅4號(hào)中鑒定了1個(gè)廣譜持久的抗瘟性新位點(diǎn)Pigm[3]。Pigm是包含多個(gè)NBS-LRR(nucleotide binding site-leucine rich repeat)類抗病基因的基因簇，含有PigmR和PigmS，PigmR表達(dá)導(dǎo)致水稻千粒重降低、產(chǎn)量下降；與PigmR相反，PigmS受表觀遺傳的調(diào)控，僅在水稻花粉中特異高表達(dá)，從而提高水稻的結(jié)實(shí)率，抵消PigmR對(duì)產(chǎn)量的影響[3]。進(jìn)一步研究表明新型轉(zhuǎn)錄因子PIBP1與PigmR以及其他類似的抗病蛋白Pizt、Pi9特異性互作，促進(jìn)自身細(xì)胞核蛋白的累積，從而激活下游防御反應(yīng)[4]。本研究前期利用圖位克隆的方法，從雙抗77009中克隆了一廣譜抗稻瘟病基因Pigm-1，Pigm-1包含Pigm-1R和Pigm-1S，Pigm-1S與PigmS序列完全一樣，而Pigm-1R與PigmR存在3個(gè)堿基的差異，是Pigm新的等位基因；抗性鑒定表明Pigm-1對(duì)來(lái)自我國(guó)不同稻作區(qū)的多個(gè)稻瘟病生理小種均表現(xiàn)抗病性[5]。

目前防治稻瘟病最有效、最經(jīng)濟(jì)、最根本的方法是選育和推廣抗病品種[3]，而廣譜抗病R基因介導(dǎo)的抗性高效且可操作性強(qiáng)。利用廣譜、抗性持久的抗稻瘟病R基因，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，是培育抗稻瘟病水稻品種最有效的手段之一。目前已有利用分子標(biāo)記輔助技術(shù)將水稻抗病基因轉(zhuǎn)入水稻材料的報(bào)道，倪大虎等[6]利用分子標(biāo)記技術(shù)將抗稻瘟病基因Pi9和抗白葉枯基因Xa21和Xa23同時(shí)聚合到了水稻中；Jiang等[7]應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，育成了同時(shí)攜帶Pi1和Pi2的不育系金23A；趙國(guó)超等[8]利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，育成了同時(shí)攜帶Pi9、Pita、Pib和Pigm基因的兩系不育系2179S。

水稻三系恢復(fù)系R20是福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所種質(zhì)創(chuàng)制研究室通過(guò)常規(guī)雜交技術(shù)育成的優(yōu)質(zhì)秈型恢復(fù)系，但其稻瘟病抗性弱。在滿足高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和廣適應(yīng)性等育種目標(biāo)的基礎(chǔ)上，提高水稻品種的稻瘟病抗性水平，已成為廣大水稻育種追求的目標(biāo)。鑒于此，本研究以雙抗77009 為抗性基因Pigm-1的供體親本，以感病恢復(fù)系R20為受體親本，通過(guò)雜交與回交的方法，并利用Pigm-1基因的功能分子標(biāo)記，開(kāi)展分子標(biāo)記輔助選擇育種實(shí)踐，定向改良優(yōu)質(zhì)水稻恢復(fù)系R20的稻瘟病抗性，旨在為稻瘟病抗稻瘟病基因Pigm-1的分子育種研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供體Pigm-1親本：雙抗77009為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所種資資源研究室保存的一個(gè)抗性品種，在安徽省黃山、福建省上杭、江西省井岡山和湖北省宜昌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的稻瘟病抗性[5]。受體親本：R20是福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所種質(zhì)創(chuàng)制研究室通過(guò)常規(guī)雜交技術(shù)育成的優(yōu)質(zhì)秈型恢復(fù)系。

1.2 抗性鑒定

室內(nèi)稻瘟病抗性鑒定：接菌參照Yang等[5]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)修改。將帶有Guy11孢子的濾紙片放置到完全(complete medium, CM)培養(yǎng)基中，然后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)一周后，轉(zhuǎn)接到米糠培養(yǎng)基中，在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直到菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基，將菌絲輕輕刮去，放于28℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行產(chǎn)孢。5～7 d后將孢子刮下，并用0.2%的Tween-20將孢子濃度調(diào)整為1×105個(gè)·mL-1，均勻地噴霧到生長(zhǎng)15 d左右的水稻葉片表面，將噴菌后的幼苗放置在26℃條件下黑暗培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)移至長(zhǎng)日照接菌室6～7 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病表型。

田間稻瘟病抗性表型鑒定：受體親本R20和改良系R20-1、R20-2、R20-3和R20-4經(jīng)室內(nèi)催芽后于2020年5月18日播種于福建省上杭縣茶地鄉(xiāng)農(nóng)技站天然病圃，期間進(jìn)行常規(guī)管理，不打農(nóng)藥。同年6月5日對(duì)每個(gè)株系進(jìn)行苗期稻瘟病抗性調(diào)查和統(tǒng)計(jì)。

1.3 稻瘟病抗性基因Pigm-1的功能標(biāo)記

抗性基因Pigm-1的功能標(biāo)記參考Yang等[5]開(kāi)發(fā)的標(biāo)記Pigm-1F: T T A T T T C G T T T G C T A T G C; Pigm-1R: G G A C T A T G T G A T C G G T T A。

1.4 性狀調(diào)查

2020年7月，將供試材料種植于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)。雙抗77009、R20、R20-1、R20-2、 R20-3和R20-4分別種植1個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)種植3行，每行種20 株，每個(gè)小區(qū)設(shè)置 3個(gè)重復(fù)，常規(guī)管理。

水稻株高、穗長(zhǎng)和分蘗數(shù)等相關(guān)性狀的調(diào)查和分析參考Yang等[9]的方法；稻谷粒長(zhǎng)和粒寬等測(cè)定參照Tan等[10]的方法。

1.5 水稻DNA的提取及電泳檢測(cè)

水稻葉片DNA提取、樣品PCR擴(kuò)增以及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)分析參照楊德衛(wèi)等[11]的方法。

1.6 改良恢復(fù)系R20稻瘟病抗性方法

以親本R20為母本，抗稻瘟病親本雙抗77009為父本，雜交后，再以R20為回輪親本進(jìn)行回交，回交過(guò)程中跟蹤分子標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙親水稻的稻瘟病抗性分析

本研究利用稻瘟病菌Guy11對(duì)雙抗77009和R20進(jìn)行室內(nèi)稻瘟病接種，結(jié)果表明雙抗77009表現(xiàn)抗病，R20表現(xiàn)感病(圖1)。

2.2 利用分子標(biāo)記改良恢復(fù)系R20的稻瘟病抗性

為了改良恢復(fù)系R20稻瘟病抗性，本研究以受體親本R20為母本，以供體親本雙抗77009為父本進(jìn)行雜交，接著用親本R20為父本進(jìn)行連續(xù)回交，回交過(guò)程中跟蹤分子標(biāo)記，選擇含有Pigm-1基因的單株為母本繼續(xù)回交，直到BC3F1，后再自交得到BC3F2，繼續(xù)跟蹤分子標(biāo)記，并綜合農(nóng)藝性狀，獲得8份含有Pigm-1基因的單株，將這些單株連續(xù)種植兩代并跟蹤分子標(biāo)記，在綜合株高、抽穗期和結(jié)實(shí)率等相關(guān)農(nóng)藝性狀情況下，最終獲得4份農(nóng)藝性狀優(yōu)良與R20性狀相似的穩(wěn)定材料，分別命名為R20-1、R20-2、R20-3和R20-4，分子標(biāo)記檢測(cè)均含有稻瘟病抗性基因Pigm-1。

圖1 雙抗77009和R20室內(nèi)接種稻瘟菌Guy11抗性表現(xiàn)Fig.1 Resistance performance of Shuangkang77009and R20 with rice blast fungus Guy11

2.3 改良恢復(fù)系的稻瘟病抗性鑒定分析

室內(nèi)抗性鑒定結(jié)果表明，4份改良系均表現(xiàn)出抗病(圖2-A)。進(jìn)一步在自然條件下進(jìn)行抗性鑒定。結(jié)果表明對(duì)照親本R20表現(xiàn)出感病，4份改良系均表現(xiàn)出抗病(圖2-B)。

圖2 受體親本R20與4個(gè)改良系室內(nèi)接菌(A)和田間抗性鑒定(B)比較Fig.2 Comparison of indoor inoculation (A) and field resistance identification (B) between R20 and four improved lines

2.4 改良恢復(fù)系的主要農(nóng)藝性狀分析

對(duì)4份改良系和受體親本R20在成熟期進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查。結(jié)果表明，受體親本R20與R20-1、R20-2、 R20-3相比，其株高、穗長(zhǎng)、有效穗、每穗穎花數(shù)、結(jié)實(shí)率、粒長(zhǎng)、粒寬和千粒重等性狀無(wú)顯著差異(表1)；R20與R20-4相比，株高、穗長(zhǎng)、有效穗、每穗穎花數(shù)、結(jié)實(shí)率和粒寬等性狀無(wú)顯著差異，而粒長(zhǎng)(圖3)和千粒重表現(xiàn)出極顯著差異(表1)。

表1 受體親本R20與4個(gè)改良系株高、穗長(zhǎng)和千粒重等主要農(nóng)藝性狀比較Table 1 Comparison of main agronomic traits for plant height, panicle length and thousand seeds weight between R20 and four improved lines

2.5 改良恢復(fù)系遺傳背景分析

利用 326 對(duì)均勻分布于水稻12條染色體上的SSR標(biāo)記對(duì)雙抗77009和R20兩個(gè)親本進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果表明有89對(duì)SSR引物在雙親之間能檢測(cè)多態(tài)性。利用這89對(duì)SSR引物對(duì)R20-1、R20-2、R20-3 和R20-4這4個(gè)穩(wěn)定的純合材料進(jìn)行遺傳背景檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。株系R20-1在第1號(hào)染色體上的標(biāo)記RM5496為純合基因型，在第6號(hào)染色體上的標(biāo)記RM3498為雜合基因型；株系R20-2在第3號(hào)染色體上的標(biāo)記RM6832為純合基因型，在第8號(hào)染色體上的標(biāo)記RM3496為純合基因型；株系R20-3在第7號(hào)染色體上的標(biāo)記RM11為純合基因型；株系R20-4 在第1號(hào)染色體上的標(biāo)記RM5496為純合基因型，在第12號(hào)染色體上的標(biāo)記RM17為純合基因型。這4個(gè)株系都基本恢復(fù)了受體親本的背景，其中有3個(gè)株系含有供體的2個(gè)片段，有1個(gè)株系含有供體的1個(gè)片段。

圖3 受體親本R20與改良系R20-4的粒長(zhǎng)差異比較Fig.3 Comparison of main agronomic traits for grain length between R20 and R20-4

圖4 4個(gè)改良系遺傳背景分析Fig.4 Genetic background analysis of four improved lines

3 討論

水稻稻瘟病是水稻的重要病害之一，給我國(guó)甚至全世界水稻的安全生產(chǎn)帶來(lái)了巨大隱患[12-14]。傳統(tǒng)水稻抗病育種是通過(guò)接種或在發(fā)病區(qū)進(jìn)行抗性鑒定等方式，然后通過(guò)人工表型選擇，再進(jìn)行抗性鑒定，工作量大、耗時(shí)；同時(shí)受外界環(huán)境影響大，鑒定不準(zhǔn)確，導(dǎo)致抗性選擇的效率低。而利用抗性基因的功能標(biāo)記，再借助于分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，可以減少或消除這些不利因素，是培育水稻抗病品種的最有效途徑之一[15]。

抗性基因常常與不良性狀緊密連鎖，盡管目前利用分子標(biāo)記輔助選擇抗稻瘟病基因來(lái)改良水稻稻瘟病抗性的研究已取得一定進(jìn)展，但存在無(wú)法同時(shí)保證產(chǎn)量的缺點(diǎn)[16-17]。例如劉文強(qiáng)等[18]研究表明Pi25(t)與水稻結(jié)實(shí)率和每穗實(shí)粒數(shù)等性狀之間存在連鎖累贅；向小嬌等[19]研究表明pi21可能與水稻產(chǎn)量性狀之間存在連鎖累贅；Zhou等[20]研究表明Pi2與水稻抽穗期Hd1緊密連鎖，導(dǎo)入Pi2后水稻抽穗期將推遲；Patroti等[21]研究表明Pi1、Pi2和Pi54與不良性狀的連鎖阻力在0.2～2 Mb之間。本研究利用前期克隆廣譜抗稻瘟病基因Pigm-1[5]， 通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，獲得4份穩(wěn)定的R20抗稻瘟病改良系，除了株系R20-4外，其余株系農(nóng)藝性狀與受體親本均無(wú)顯著差異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，改良系R20-4除表現(xiàn)抗稻瘟病外，其粒長(zhǎng)和千粒重均顯著高于受體親本R20。綜上所述，本研究不僅獲得了抗稻瘟病的改良系R20-1、R20-2和R20-3，還獲得了抗病和產(chǎn)量均得到提高的改良系R20-4。此外，大部分已鑒定和克隆的稻瘟病抗性基因抗譜較窄，難以應(yīng)用于水稻抗病育種實(shí)踐[3，22-23]，且長(zhǎng)期使用單一類別的稻瘟病抗性基因，會(huì)促進(jìn)稻瘟病菌產(chǎn)生新的優(yōu)勢(shì)生理小種，導(dǎo)致原有抗病基因效果減弱或完全失效[24]。本研究利用的抗病基因Pigm-1具有良好的廣譜抗病性[5]，可用于豐富抗病基因資源。由此可知，稻瘟病抗性基因Pigm-1在水稻抗稻瘟病育種方面可能具有良好的應(yīng)用前景。

分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)是作物遺傳改良應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，對(duì)作物分子育種具有極其重要的作用[25]。在育種研究中，可以根據(jù)育種材料的實(shí)際情況，利用新技術(shù)、新方法及種業(yè)體制改革和品種審定的多元化條件，對(duì)分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，其中供體親本是分子標(biāo)記輔助育種的核心。但利用常規(guī)雜交法將有利基因從野生稻等原始材料中轉(zhuǎn)入改良品種耗時(shí)較長(zhǎng)，同時(shí)存在雜種不育、與不利性狀基因連鎖及株葉形態(tài)不理想等問(wèn)題[26-27]。例如，前期水稻優(yōu)異基因的挖掘和利用課題組通過(guò)構(gòu)建近等基因系，將漳浦野生稻中qHD19導(dǎo)入到栽培稻中，雖然獲得了相對(duì)理想的水稻新材料，但耗時(shí)近4～5年[9, 28]。因此，開(kāi)發(fā)有利基因的功能標(biāo)記，利用分子標(biāo)記輔助法篩選含有目標(biāo)基因且在生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛的水稻材料作為供體親本，以待改良的材料作為受體親本，通過(guò)雜交定向改良水稻品種的目標(biāo)性狀，將解決野生稻等原始材料的優(yōu)良基因難以利用的困擾。Pigm是從谷梅4號(hào)中克隆的水稻廣譜抗稻瘟病基因[3]，但谷梅4號(hào)是地方秈稻品種，農(nóng)藝性狀一般，且與粳稻雜交親和力差、后代分離大，直接利用谷梅4號(hào)進(jìn)行改良育種較難[27]。在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)的三系不育系谷豐A中也含有Pigm基因。因此，谷豐A比谷梅4號(hào)更適用于水稻育種研究。利用谷豐A或其對(duì)應(yīng)的保持系谷豐B來(lái)改良相應(yīng)的不育系和保持系，將有效縮短育種進(jìn)程、提高育種效率。本研究選擇不良性狀少且生產(chǎn)利用率高的雙抗77009作為供體親本，以應(yīng)用廣泛的優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系R20為母本，在較短時(shí)間內(nèi)獲得了改良的抗病恢復(fù)系材料，大大縮短了育種時(shí)間，節(jié)約了育種成本。

4 結(jié)論

本研究以雙抗77009 為抗性基因Pigm-1的供體親本，感病恢復(fù)系R20為受體親本，通過(guò)雜交和回交，并借助于分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，定向改良優(yōu)質(zhì)水稻恢復(fù)系R20的稻瘟病抗性，得到了4個(gè)R20的抗病近改良系，這4個(gè)改良系均表現(xiàn)抗病。進(jìn)一步農(nóng)藝性狀分析表明，改良系R20-4的粒長(zhǎng)和千粒重與R20存在極顯著差異。本研究利用分子標(biāo)記輔助技術(shù)，改良了恢復(fù)系R20的稻瘟病抗性，并發(fā)現(xiàn)改良系R20-4在抗病的同時(shí)產(chǎn)量有所提高。