沈亞琦 蔣文翔 項圓圓 王聯(lián)紅 張秋云 劉家林 賀浩華 胡麗芳

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實驗室/江西省超級稻工程技術(shù)研究中心/雙季稻現(xiàn)代化生產(chǎn)協(xié)同中心，江西 南昌 330045)

植物的雄性不育現(xiàn)象廣泛存在于自然界中，對植物雜種優(yōu)勢的利用具有重要作用?；ㄋ幾鳛樗?OryzasativaL.)重要的生殖器官，研究水稻花藥發(fā)育的相關(guān)過程對闡明其雄性生殖發(fā)育機(jī)制及調(diào)控途徑具有重要的理論意義與應(yīng)用價值[1]。水稻花藥發(fā)育起始于花芽中的雄蕊原基頂端，首先由花藥原表皮下方四個角隅處分化出孢原細(xì)胞，孢原細(xì)胞隨后經(jīng)過一系列發(fā)育過程分化為由表皮、內(nèi)皮層、中層和絨氈層組成的四層壁細(xì)胞和小孢子[2]。絨氈層和花粉壁的正常發(fā)育對花藥的形成至關(guān)重要，參與其發(fā)育過程的基因一直是水稻花藥發(fā)育的研究重點(diǎn)[3-4]。

目前分離出參與水稻花藥絨氈層發(fā)育過程的基因包括TDR(TapetumDegenerationRetardation)[5]、TIP2(TDRInteractingProtein2)[6]、TIP3(TDRInteractingProtein3)[7]、OsAGO2(ARGONAUTE2)[8]、EDT1(EarlierDegradedTapetum1)[9]和DTC1(DefectiveTapetumCellDeath1)[10]等。tdr突變體中絨氈層降解遲緩，小孢子無法正常發(fā)育；tip2突變體絨氈層細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)中斷；tip3突變體中絨氈層程序性死亡延遲，導(dǎo)致無成熟花粉粒形成；rms2突變體花藥絨氈層降解延遲；OsAGO2基因的敲除導(dǎo)致活性氧的過度積累并引起絨氈層細(xì)胞程序化死亡提前發(fā)生。分離出的參與花粉外壁發(fā)育相關(guān)的基因包括CYP703A3[11]、CYP704B2[12]、Wda1(Wax-deficientanther1)[13]、PDA1(Post-meioticDeficientAnther1)[14-15]和OsGPAT3(Glycerol-3-PhosphateAcyltransferase3)[16]和DPW3(defectivepollenwall3)[17]等。細(xì)胞色素P450基因家族成員CYP703A3和CYP704B2基因的突變植株都會表現(xiàn)出發(fā)育缺陷的花藥表面角質(zhì)層和花粉外壁；wda1突變體無法形成花藥角質(zhì)層的蠟質(zhì)，花粉外壁的形成有缺陷；pda1突變體花藥內(nèi)表面的烏氏體減少，表面的蠟質(zhì)明顯降低；osgpat3突變體表現(xiàn)出明顯的花藥角質(zhì)層缺陷和花粉外壁缺陷。分離出的一些參與其他花藥發(fā)育過程相關(guān)的基因，如PAIR2[18]和PAIR3[19]基因的缺失或突變使得同源染色體在減數(shù)分類過程中不能正常配對，AID1(antherindehiscence1)[20]和OsFTIP7(FT-INTERACTINGPROTEIN7)[21]基因突變導(dǎo)致水稻花藥不開裂。

水稻花藥的發(fā)育是一個極其復(fù)雜的過程，盡管目前已克隆了一系列相關(guān)基因，但相關(guān)分子機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍有待研究，大量未知新基因有待進(jìn)一步挖掘。本研究通過輻射誘導(dǎo)松香早粳種子獲得一個穩(wěn)定遺傳的雄性不育突變體dtp1，并對此材料進(jìn)行初步的表型鑒定、細(xì)胞學(xué)觀察和基因定位，旨在為進(jìn)一步完善水稻的花藥發(fā)育分子機(jī)制及創(chuàng)制新的水稻不育系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用水稻材料松香早粳和日本晴為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實驗室保存品種，利用60Co-γ射線對粳稻松香早梗種子進(jìn)行輻射誘變，在其后代中獲得一個穩(wěn)定遺傳的雄性不育突變體dtp1材料。松香早粳屬早熟常規(guī)粳稻，全生育期113～115 d，于每年5月25日前后播種。

1.2 試驗方法

1.2.1 突變體表型觀察及花粉育性鑒定 植株與花藥均取自2020年江西農(nóng)業(yè)大學(xué)南昌科技園實驗基地，隨機(jī)選取野生型(wild type, WT)與突變體成熟時期植株進(jìn)行拍照觀察。田間隨機(jī)選取野生型和突變體的成熟穎花，在解剖鏡下觀察雌雄蕊的數(shù)量與形態(tài)并拍照。于適宜氣候的穎花開花時間，隨機(jī)選取野生型和突變體穎花各8～10穗，取花藥放置于載玻片上，用鑷子搗碎壓片，然后用1% I2-KI溶液對其進(jìn)行染色，選取合適的視野觀察花粉粒的形態(tài)和染色情況。

1.2.2 石蠟切片 在實驗基地選取松香早粳野生型和dtp1突變體材料不同時期的小穗，根據(jù)穎花的長度將小花劃分為不同的發(fā)育時期的花藥，于FAA固定液(V50%乙醇∶V冰乙酸∶V40%甲醛=90∶5∶5)中固定保存，用切片機(jī)將材料切成厚度為8.0 μm的薄片，選取符合要求的切片用甲苯胺藍(lán)染色，利用中性樹膠封固后用光學(xué)顯微鏡觀察拍照。

1.2.3 遺傳分析 2019年夏季種植于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技園試驗基地，用dtp1突變體做母本，松香早粳做父本進(jìn)行雜交得到F1；同年冬季在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)海南南繁育種基地種植，收獲成熟種子；2020年夏季于科技園試驗基地種植親本和F2群體，觀察統(tǒng)計F1的育性、F2可育株與不育株分離比并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.4 基因定位 用CTAB法提取野生型、dtp1突變體以及F2群體中突變型單株的DNA。利用江西農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實驗室保存的簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)標(biāo)記篩選松香早粳和日本晴之間的多態(tài)性，選取平均分布于水稻12條染色體上的152對多態(tài)引物進(jìn)行染色體連鎖分析，進(jìn)一步利用72個突變性單株進(jìn)行突變位點(diǎn)初步定位。根據(jù)重測序的松香早粳和日本晴的全基因組序列，對初定位區(qū)間內(nèi)的基因組序列進(jìn)行對比，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計新的InDel(insertion-deletion)分子標(biāo)記，對突變基因進(jìn)行精細(xì)定位，利用mapmaker 3.0軟件對分離群體的標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型觀察

通過不同時期的田間觀察發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)生殖期間dtp1突變體植株整體及抽穗情況與正常植株無明顯差異，表1為2019—2020年松香早粳與dtp1突變體相關(guān)性狀的詳細(xì)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步對小花解剖觀察發(fā)現(xiàn)，dtp1突變體具有發(fā)育完全的雌蕊和數(shù)目正常的雄蕊。野生型花藥長勢飽滿呈黃色，野生型花藥飽滿呈現(xiàn)正常的黃色，而突變體的花絲伸長，花藥瘦小顏色淺黃(圖1)。

注：A：野生型(左)和dtp1突變體(右)的植株；B：野生型的花；C: dtp1突變體的花。比例尺為2 mm。Note: A: Plants with wild-type (left) and dtp1 mutant (right). B: Flowers of wild type plants. C: Flowers of a dtp1 mutant. Bars=2 mm.圖1 野生型和dtp1突變體表型比較Fig.1 Comparison of wild type and dtp1 mutant

2.2 花粉育性

為進(jìn)一步了解dtp1突變體花藥的育性情況，進(jìn)行碘染試驗。取突變體與野生型的成熟花藥分別置于載玻片上，1% I2-KI溶液染色后在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)野生型花藥內(nèi)大量的飽滿圓形正常成熟花粉粒被染成深黑色，而突變體花藥中未發(fā)現(xiàn)花粉粒(圖2)，表明dtp1突變體屬于無花粉型雄性不育突變體。

圖2 野生型(A)和dtp1突變體(B)花藥碘染Fig.2 Wild type(A) and dtp1 mutant(B) pollen grains stained by I2-KI

2.3 石蠟切片

通過觀察野生型和突變體水稻不同發(fā)育時期花藥的石蠟切片，進(jìn)一步了解dtp1突變體不育性產(chǎn)生的細(xì)胞學(xué)差異。水稻花藥的發(fā)育時期參照馮九煥等[22]劃分的8個時期，通過觀察分析發(fā)現(xiàn)，突變體花藥發(fā)育過程中小孢子母細(xì)胞能正常進(jìn)入減數(shù)分裂時期(圖3-A、G)，絨氈層細(xì)胞開始發(fā)育，胞質(zhì)濃縮，花粉母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂(圖3-B、C、H、I)；進(jìn)入小孢子時期，野生型釋放出近圓球形的小孢子，絨氈層濃縮且染色加深，但dtp1突變體花藥絨氈層染色淺，開始降解，小孢子形狀不規(guī)則(圖3-D、J)；在花藥發(fā)育的液泡化時期，野生型花藥中小孢子已形成大液泡，體積增大，絨氈層繼續(xù)退化，此時dtp1突變體的絨氈層膨大凸起，小孢子發(fā)育異常(圖3-E、K)；在成熟時期，野生型中的花粉顆粒已經(jīng)形成，絨氈層完全降解，但dtp1突變體中小孢子細(xì)胞降解僅?？涨?圖3-F、L)。

注：A～F：野生型花藥石蠟切片；G～L：dtp1突變體花藥石蠟切片；A和B：小孢子母細(xì)胞時期；B、C和H、I：減數(shù)分裂時期；D和J：小孢子時期；E和K：液泡化時期；F和L：花粉成熟時期。T:絨氈層；Msp：小孢子；圖中比例尺為10 μm。Note: A-F: The paraffin sections of anthers wild type. G-L: The paraffin sections of anthers dtp1 mutant. A and B:Microspore mother cell stage. B,C,H and I: The meiotic period. D and J: Microspore stage. E and K: Vacuolation. F and L: Pollen maturity stage. T: Tapetum. Msp: Microspore. Bars=10 μm.圖3 野生型與dtp1突變體花藥的石蠟切片F(xiàn)ig.3 Paraffin sections from anthers of wild type and dtp1 mutants

2.4 遺傳分析

松香早粳經(jīng)60Co-γ輻射誘變獲得的1個性狀穩(wěn)定的雄性不育突變體dtp1，以dtp1突變體作為母本與松香早粳回交，調(diào)查F1群體發(fā)現(xiàn)所有種植的F1植株表型性狀均與野生型松香早粳一致，但在F1自交獲得的F2群體中出現(xiàn)育性性狀的分離，表明育性性狀受核基因控制，不育性狀為隱性性狀。在獲得的F2群體中，正常植株和突變植株育性性狀的分離符合3∶1的分離規(guī)律(表2)，表明該不育性狀為單個核基因控制的隱性突變。

表2 突變體性狀的在群體中的分離Table 2 Isolation of mutant traits in populations

2.5 基因定位

為定位控制dtp1突變體無花粉性狀的雄性不育基因，以雄性不育突變體dtp1和日本晴雜交的F2群體為定位群體(表2)。用均勻分布在水稻12條染色體上的360對SSR引物對親本松香早粳和日本晴DNA進(jìn)行多態(tài)性篩選(圖4)，利用篩選出的152對具有多態(tài)性SSR引物對親本松香早粳和日本晴以及F2單株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，染色體連鎖分析發(fā)現(xiàn)位于水稻第7染色體上的兩個SSR標(biāo)記7-2d和7-3h與目的基因存在連鎖關(guān)系(圖5)。為了在初定位結(jié)果上進(jìn)一步實現(xiàn)目的基因的精細(xì)定位，根據(jù)重測序結(jié)果中親本松香早粳品種和日本晴品種之間的基因組序列差異性，在初定位結(jié)果上進(jìn)一步利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計了10對新的引物，其中5對引物具有多態(tài)性(表3)，最終將不育目的基因定位在SYrbC7-2680809和SYrbC7-2832575標(biāo)記之間(圖6)，染色體區(qū)間的物理距離151.7 kb(圖7)。

表3 引物列表Table 3 List of primers

注：自左至右每2個孔道對應(yīng)一個引物，左為日本晴，右為松香早粳。Note:From left to right, each 2 channels corresponds to a primer, the left is Nipponicum, the right is Songxiangzaojing.圖4 親本多態(tài)篩選Fig.4 Seed-parent polymorphic screening

注：每3個孔道對應(yīng)一個引物，自左至右分別對應(yīng)為日本晴，松香早粳，F(xiàn)2群體混池。Note:There is a primer for every 3 pores，from left to right，correspond to Nipponicum, Songxiangzaojing and F2 population mixing pool respectively.圖5 BSA混池篩選Fig.5 BSA pooling screening

圖6 部分單株擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 Partial amplified results of single plant

圖7 突變基因定位及預(yù)測基因預(yù)測Fig.7 Mutant gene localization and prediction gene prediction

根據(jù)NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和國家水稻數(shù)據(jù)中心(https://www.ricedata.cn/)提供的水稻基因注釋信息，共包括14個注釋基因(表4)，其中LOC_Os07g05720參與活性氧代謝途徑、LOC_Os07g05740編碼RPK2(receptor-like protein kinase 2)前體、LOC_Os07g05800編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)以及LOC_Os07g05750編碼推測的Ty3-gypsy亞類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白，其余10個基因功能未知。

表4 預(yù)測基因列表Table 4 Predictive genes list

3 討論

水稻雄性生殖發(fā)生是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，其中花藥是研究雄性不育的良好對象。目前，參與花藥發(fā)育過程的一系列表達(dá)調(diào)控基因相繼被發(fā)現(xiàn)和鑒定[23-24]，但仍有大量未知的基因尚未被分離和克隆[25]。雄性不育突變體是研究水稻花藥生理功能、代謝途徑以及基因調(diào)控途徑的重要試驗材料[1]。

絨氈層作為花藥壁最內(nèi)層細(xì)胞，是向花粉母細(xì)胞運(yùn)輸物質(zhì)的樞紐，可分泌胼胝降解酶釋放小孢子，為小孢子發(fā)育提供營養(yǎng)，合成花粉壁所需的孢粉素以及花粉外殼的沉淀物，上述功能均對花粉母細(xì)胞和小孢子的正常發(fā)育至關(guān)重要。因此，絨氈層PCD的提前或延遲均會導(dǎo)致雄性不育[26-27]。本研究通過形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，dtp1突變體花絲伸長，花藥瘦小呈淺黃色，碘染實驗表明dtp1突變體屬于無花粉型雄性不育突變體。遺傳分析發(fā)現(xiàn)，控制dtp1突變體產(chǎn)生不育的性狀由單個核基因控制的隱性突變所引起。切片觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，dtp1突變體花藥最異常的表現(xiàn)發(fā)生在液泡化時期，絨氈層異常膨大且提前降解，同時小孢子與野生型的圓形相比呈現(xiàn)出不規(guī)則的現(xiàn)象，推測小孢子的異常發(fā)育可能是受到絨氈層發(fā)育的影響，DTP1是一個新的調(diào)控減數(shù)分裂后絨氈層和小孢子發(fā)育的重要基因。目前已報道的控制減數(shù)分裂后絨氈層和小孢子發(fā)育相關(guān)的突變體有dtc1、osago2和edt1等，與dtp1突變體的表型具有相似性。后期可通過轉(zhuǎn)錄組分析、代謝組分析以及酵母雙雜交等方法來研究DTP1與DTC1、OsAGO2和EDT1等基因之間可能的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

DTP1基因定位于水稻第7染色體的2個標(biāo)記SYrbC7-2680809和SYrbC7-2832575之間151.7 kb的物理區(qū)間，共包括14個基因，包括LOC_Os07g05720(編碼TPC轉(zhuǎn)錄因子)和LOC_Os07g05800(編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)。相關(guān)研究表明，TPC轉(zhuǎn)錄因子在茉莉酸(jasmonic acid, JA)信號途徑調(diào)節(jié)中起作用[28-29]，而JA可與赤霉素(gibberellic acid, GA)相互作用來調(diào)控花藥的發(fā)育過程。GA通過抑制DELLA蛋白，調(diào)節(jié)JA生物合成基因來調(diào)控雄蕊發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的活性[30]。已報道的OsGAMYB(gibberellic acid myb)編碼1個赤霉素轉(zhuǎn)錄因子，gamyb-4植株的花藥絨氈層發(fā)育異常，花粉敗育[31]。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶作為重要的抗氧化酶參與活性氧(reactive oxygen species, ROS)的穩(wěn)態(tài)調(diào)控[32-33]。已有研究表明，ROS的過度積累和花藥發(fā)育異常會導(dǎo)致絨氈層程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death, PCD)的提前啟動和花粉敗育，同時ROS是絨氈層PCD正常發(fā)生的重要信號分子[11-13]。OsAGO2通過調(diào)節(jié)OsHXK1啟動子區(qū)的DNA甲基化修飾來表觀調(diào)控花藥發(fā)育，osago2敲除突變體會導(dǎo)致活性氧的過度積累和花藥發(fā)育異常，絨氈層程序性細(xì)胞死亡的提前啟動和花粉敗育。過表達(dá)OsHXK1也導(dǎo)致ROS的過度積累，從而過早啟動PCD和花粉敗育。DTC1是絨氈層PCD的關(guān)鍵調(diào)控因子，可抑制金屬硫蛋白MT2b的ROS清除活性。野生型植物在花藥發(fā)育的小孢子時期積累了大量的ROS，而在dtc1突變體花藥發(fā)育的各個階段，其ROS含量一直維持在較低的水平。鑒于此，推測LOC_Os07g05720和LOC_Os07g05800為可能的候選基因。

為了進(jìn)一步明確DTP1在水稻花藥發(fā)育中的功能和分子機(jī)制。設(shè)計后期第一步研究確定dtp1突變體中候選基因的變異位點(diǎn)，以及突變位點(diǎn)對基因功能影響，然后在克隆DTP1基因的基礎(chǔ)上，通過透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)、掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)及TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End labeling)來分析絨氈層及花藥壁的發(fā)育情況，同時通過原位雜交、亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄本及代謝本的研究來分析分子機(jī)理，以期為隨后的遺傳改良提供新的基因資源和理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究通過60Co-γ射線處理松香早梗種子獲得1個雄性不育突變體dtp1。與野生型相比，dtp1突變體花絲伸長，花藥瘦小呈淺黃色；碘染試驗表明dtp1突變體屬于無花粉型雄性不育突變體。遺傳分析發(fā)現(xiàn)，dtp1突變體是單個核基因控制的隱性突變體。石蠟切片結(jié)果發(fā)現(xiàn)dtp1突變體在液泡化時期，絨氈層異常膨大且提前降解，同時小孢子呈現(xiàn)出不規(guī)則的現(xiàn)象。DTP1是一個新的調(diào)控減數(shù)分裂后絨氈層和小孢子發(fā)育的重要基因，通過圖位克隆的方法已將其定位于第7號染色體SYrbC7-2680809和SYrbC7-2832575標(biāo)記間151.7 kb的物理區(qū)間內(nèi)，共包括14個基因，其中LOC_Os07g05720(編碼TPC轉(zhuǎn)錄因子)和LOC_Os07g05800(編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)為可能的候選基因。