蔣 明 苗立祥 朱 晏 吳嘉婧 吳 倩 張慧娟,*

(1 臺州學院生命科學學院，浙江 椒江 318000；2 浙江省農業(yè)科學研究院園藝研究所，浙江 杭州 310021)

硫代葡萄糖苷(glucosinolate，GLS)又名芥子油苷、硫苷等，主要存在于十字花目(Brassicales)植物中，是一類重要的生物活性物質[1]。硫代葡萄糖苷由β-D-吡喃葡萄糖、磺酸鹽醛肟基團和氨基酸R側鏈組成，根據R側鏈的不同，可將硫代葡萄糖苷分為脂肪族硫苷(aliphatic GLS)、芳香族硫苷(aromatic GLS)和吲哚族硫苷(indolic GLS)三大類，目前已有超過120種硫代葡萄糖苷得以鑒定[1-3]。硫代葡萄糖苷廣泛分布于蕓薹屬(Brassica)蔬菜中，包括西蘭花(B.oleraceavar.italica)、花椰菜(B.oleraceavar.botrytis)、甘藍(B.oleraceavar.capitata)、芥藍(B.alboglabra)、芥菜(B.juncea)和結球白菜(B.rapassp.pekinensis)等。但不同蕓薹屬蔬菜中，硫代葡萄糖苷的含量和種類的差異賦予了蔬菜不同的風味[4-5]。

西蘭花又名青花菜、綠花菜、木立花椰菜等，是一種富含硫代葡萄糖苷的十字花科(Brassicaceae)植物，其花球和花莖為主要食用部位，味道鮮美、營養(yǎng)豐富、風味獨特，已成為一種深受人們喜愛的保健蔬菜[6]。近年來在調查浙江省西蘭花產地病蟲害發(fā)生情況時發(fā)現(xiàn)，黑腐病(black rot)的發(fā)生十分嚴重，已成為該蔬菜的重要病害，并有逐年加重的趨勢。西蘭花黑腐病發(fā)病初期葉片邊緣出現(xiàn)“V”字型病斑，后期枯黃壞死，影響植株的生長發(fā)育和花球產量。黑腐病由野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestrispv.campestris，Xcc)引起，為細菌性病害，每年因該病原菌造成的經濟損失巨大[7]。硫代葡萄糖苷的水解產物十分豐富，主要有腈類化合物、環(huán)腈類化合物[8]、異硫氰酸酯、硫氰酸酯[9]和惡唑烷硫酮[10]等，這類物質在抗癌、抗菌和抗蟲方面起著重要作用。已有研究表明，硫代葡萄糖苷的水解產物對灰霉菌(Botrytiscinerea)[11]、軟腐歐氏桿菌(Erwiniacarotovora)[12]、摩西球囊霉(Glomusmosseae)[13]和蕓苔鏈格孢(Alternariabrassicae)[14]等具有一定的抑制效果。在硫代葡萄糖苷水解調控過程中，表皮特異硫蛋白(epithiospecifier，EPS)起著重要作用。EPS是一類小分子量蛋白質，能將異硫氰酸酯催化生成環(huán)腈類和腈類物質[15]。目前，EPS在黑腐病抗性反應中的功能鮮見報道。本研究以西蘭花為材料，在克隆表皮特異硫蛋白基因BoiEPS的基礎上進行序列分析，并明確其在野油菜黃單胞菌侵染下的表達情況，旨在為后續(xù)開展西蘭花-黑腐病抗性機理研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

西蘭花材料Bo0202(來自臺州學院分子生物學實驗室)栽植于人工氣候箱中，光周期為16 h光照/8 h黑暗，培養(yǎng)溫度28℃。于四葉一心期時采用噴霧法接種野油菜黃單胞菌，菌液濃度為1 × 108CFU·mL-1，采集接種0、24、48、72和96 h時的葉片，用于RNA的提取，同時采集健康葉片用于DNA的提取。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA與RNA的提取、cDNA的合成 取約0.5 g 葉片，加適量液氮研磨成粉末，采用DNA快速提取試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)提取DNA，根據說明書進行操作；RNA的提取采用TRIzol法，cDNA合成采用試劑盒法(TaKaRa公司，美國)，按說明書進行操作。

1.2.2 基因的克隆 根據NCBI數(shù)據庫甘藍型油菜(B.napus)的EPS基因(登錄號：NM_001316057.1)設計PCR引物，兩條引物的序列分別為BoP1：5′-C C C A A G C T T A T G G C T C C G A G T GT-3′和BoP2：5′-T G C T C T A G A T T A C G C G G A A T T A A C T GC-3′。分別以DNA和cDNA為模板進行PCR擴增，體系20 μL：10×緩沖液2 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.5 μL、20 μmol·L-1上游/下游引物各0.3 μL、模板2 μL、0.8 U的TaqDNA聚合酶0.4 μL，最后加無菌ddH2O至終體積。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55.4℃退火45 s，72℃延伸2 min，33個循環(huán)；72℃終延伸10 min。

1.2.3 PCR產物的回收、連接、轉化 PCR產物經電泳后，利用北京鼎國的DNA凝膠回收試劑盒回收基因片段。pGEM-T easy(Promega，美國)用于連接反應，在10 μL體系中，依次加入5 μL 2 ×緩沖液、1 μL載體DNA、3 μL回收產物和1 μL T4 DNA連接酶。4℃連接過夜后，利用熱激法將連接產物轉入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞(北京全式金生物技術有限公司)。經涂布培養(yǎng)、單菌落挑取和菌液PCR檢測，取3份陽性菌液測序。

1.2.4 基因表達分析 根據測序結果，設計一對實時熒光定量PCR引物，引物名稱和序列分別為BoP3：5′-G C C G C G A C G A G A A T A A A A A G TTC-3′ 和BoP4：5′-G C C G C G A C G A G A A T A A A A A GT TC-3′； 以肌動蛋白基因為內標，上游和下游引物分別為BoACT1：5′-T C T C G A T G G A A G A G C T G GT T-3′和BoACT2：5′-G A T C C T T A C C G A G G G A G G TT-3′。反應在羅氏LightCycler 96實時熒光定量PCR儀(Roche，瑞典)上進行，反應體系20 μL：2 × Master Mix 10 μL、上下游引物(20 μmol·L-1)各0.2 μL、模板cDNA 1 μL和ddH2O 8.6 μL。PCR程序：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)，3次生物學重復，相對表達量采用2-△△Ct法[16]計算。

1.2.5 序列分析 BoiEPS的同源蛋白序列下載自NCBI，分別來自擬南芥(Arabidopsisthaliana，登錄號：AF416786)、甘藍型油菜(XP_013640463)、蕪菁(XP_009147556)、 黃花葶藶(Drabaaurea，AFP47623)、錐果葶藶(D.lanceolata，AFP47624)、菘藍(Isatistinctoria，AFP47625)和白芥(Sinapisalba，KAF8081838)等。利用在線工具ProtParam預測蛋白質的分子量、等電點、原子組成和總平均親水性系數(shù)；DNAMAN用于蛋白質的翻譯；用SMART在線工具預測編碼蛋白的結構域；用Mega 3.1構建系統(tǒng)發(fā)育樹，方法為鄰接法，經1 000次自舉檢測。

1.2.6 遺傳轉化 利用XbaI和HindⅢ切割pFGC5941空載體及帶同樣酶切位點的PCR回收產物，利用T4 DNA連接酶連接，經轉化、涂布和測序驗證，獲得過量表達載體pFGC5941-BoiEPS，最后利用本實驗室(臺州學院分子生物學實驗室)構建的方法[17]進行遺傳轉化。在四葉一心期，利用噴霧法對野生型(wild type, WT)和3個過表達株系接種野油菜黃單胞菌，抗病性的鑒定采用姚星偉等[18]的方法，每個株系6個單株；基因表達分析采用1.2.4中的方法和引物；病原菌的計數(shù)采用Poplawsky等[19]的方法，4 d時切取葉盤，每個葉盤直徑為5 mm，每個單株切取5個葉盤，共設置3次生物學重復。病程相關蛋白基因BoPR1的表達采用BoPR1UP和BoPR1DN，引物序列分別為5′-A A A G C T A C G C C G A C C G A C T A C G AG-3′和5′-C C A G A A A A G T C G G C G C T A C T C CA-3′，以葉片cDNA為模板，采用1.2.4的PCR反應體系和程序進行表達量檢測，相對表達量采用2-△△Ct法計算。

2 結果與分析

2.1 BoiEPS基因的序列分析

分別以DNA和cDNA為模板，利用BoP1/BoP2引物克隆到BoiEPS基因。測序結果表明，BoiEPS基因全長1 270 bp，具有1個長度為238 bp的內含子，內含子符合GT-AG規(guī)則；BoiEPS的編碼區(qū)全長1 032 bp，編碼343個氨基酸；編碼蛋白具有2個Kelch結構域，分別含52和59個氨基酸殘基(圖1)。BoiEPS的理論等電點為5.71，分子量37 745 Da，分子式為C1707H2553N451O514S4；總平均親水性系數(shù)為-0.558，說明BoiEPS是一種親水蛋白。

注：陰影部分為Kelch結構域。Note: The Kelch domains are shaded.圖1 西蘭花BoiEPS的編碼區(qū)及推導的氨基酸序列Fig.1 Coding sequence and the deduced amino acid sequence of BoiEPS from broccoli

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用Mega軟件構建BoiEPS及同源蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)生樹，結果如圖2所示。8種植物的EPS在系統(tǒng)發(fā)生樹上可分為5組，蕓薹屬的西蘭花與蕪菁處于同一分支，支持率為99%，同時與甘藍型油菜聚于組I，支持率達99%。葶藶屬的黃花葶藶和錐果葶藶聚于組Ⅴ，支持率達100%，而菘藍、白芥和擬南芥各自單獨成組(Ⅱ～Ⅳ)。

圖2 BoiEPS及同源序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of BoiEPS and its homologous sequences

2.3 基因表達分析

利用引物對BoP3/BoP4進行實時熒光定量PCR分析，結果表明，BoiEPS的表達受野油菜黃單胞菌的誘導，表達量呈先上升后下降的趨勢。基因表達量在接種24 h時達到最高，為0 h的2.39倍，之后逐漸降低，接種48和72 h時的基因表達量分別是0 h的2.06和1.43倍，接種96 h時的表達量與0 h之間無顯著差異(圖3)。

注:不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P< 0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant differences among treatments at 0.05 level.圖3 BoiEPS基因在野油菜黃單胞菌侵染下的表達Fig.3 Expression of BoiEPS gene challenged by Pseudomonas syringae pv. tomato

2.4 遺傳轉化結果分析

通過遺傳轉化得到3個過量表達株系，分別命名為OE-1、OE-2和OE-3。野油菜黃單胞菌侵染5 d時，WT葉片上出現(xiàn)病斑，葉色略黃，而3個過表達株系未出現(xiàn)明顯的病斑，但OE-1和OE-2的葉片輕微發(fā)黃，葉色與WT相近，OE-3的葉色較深，邊緣有輕微的發(fā)黃現(xiàn)象(圖4)?；虮磉_分析結果表明，OE-1、OE-2和OE-3的表達量顯著增加，分別為WT的6.04、6.87和9.59倍(圖5)。病原菌計數(shù)結果表明，3個過量表達株系與WT之間存在顯著差異，WT中檢測到的病原菌數(shù)量最多(9.77個)，而OE-3中最少，僅5.17個(圖6)。利用實時熒光定量PCR研究病程相關蛋白PR1基因的表達，結果表明，3個過量表達株系BoPR1基因的表達量均顯著高于WT，OE-1、OE-2和OE-3的相對表達量分別為WT的3.88、4.58和6.63倍(圖7)。

注：WT：野生型；OE-1、OE-2和OE-3：過量表達株系。Note: WT: Wild type. OE-1、OE-2 and OE-3: Over-expressing lines.圖4 西蘭花的不同株系Fig.4 Different broccoli lines

注:不同小寫字母表示不同株系間差異顯著(P< 0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant differences among lines at 0.05 level. The same as following.圖5 BoiEPS基因在西蘭花不同株系中的表達Fig.5 Expression of BoiEPS gene in different broccoli lines

圖6 不同西蘭花株系中菌落的數(shù)量Fig.6 The number of clony-forming units in different broccoli lines

圖7 BoPR1在不同西蘭花株系的表達Fig.7 Expression of BoPR1 in different broccoli lines

3 討論

十字花科植物富含硫代葡萄糖苷，該物質通過黑芥子酶(myrosinase)、表皮硫特異蛋白及其修飾蛋白(epithiospecifier modifier protein，EMP)等的作用生成異硫氰酸酯、硫氰酸鹽、腈類化合物和上皮硫烷烴等[1]。硫代葡萄糖苷的含量與環(huán)境條件相關，利用高濃度的葡萄糖處理小白菜(B.campestrisssp.chinensisvar.communis)，可顯著提高脂肪族硫代葡萄糖苷的含量[20]。在正常情況下，黑芥子酶與硫代葡萄糖苷彼此分離，在植物受傷或細胞受損時，兩者發(fā)生混合，生成葡萄糖、氫離子和糖苷配基[21]；表皮硫特異蛋白則催化異硫氰酸酯生成環(huán)腈類和腈類物質，在擬南芥中，表皮硫特異蛋白的修飾蛋白基因位于3號染色體，它與表皮硫蛋白共同作用，影響腈類物質的合成[22]。

表皮硫蛋白最早從海甘藍(Crambeabyssinica)中分離得到，當硫代葡萄糖苷和黑芥子酶同時存在時，可催化環(huán)硫腈的生成[22-25]。近年來，研究人員已從擬南芥、甘藍型油菜中克隆到了EPS基因，并對它們的功能進行了初步研究[26-27]，在菘藍中也有該基因克隆的報道[28]。本研究從西蘭花中克隆到1個EPS基因，該基因具有2個外顯子和1個內含子，外顯子和內含子數(shù)量與擬南芥[26]、菘藍[28]相同，但序列大小差異較大，擬南芥、菘藍的內含子大小分別為1 865 bp和391 bp，而西蘭花的內含子僅238 bp。Kelch結構域大約由50個氨基酸組成，含該結構域的蛋白功能多樣，在硫代葡萄糖苷代謝過程中，Kelch能與黑芥子酶結合，并水解生成特殊的腈類化合物[29]。本研究中，BoiEPS有2個Kelch結構域，氨基酸殘基數(shù)量分別為52和59。擬南芥表皮硫特異蛋白基因的表達受丁香假單胞菌番茄變種(Pseudomonassyringaepv.tomato)的誘導，過量表達可提高擬南芥對該病原菌的抗性，而其突變體對丁香假單胞菌番茄變種的抗性減弱[29]。本研究中，西蘭花BoiEPS的表達受野油菜黃單胞菌的誘導，其過量表達顯著提高了西蘭花對黑腐病的抗性，葉片中病原菌的數(shù)量明顯減少。PR1是一種重要的病程相關蛋白，具有抗菌活性，并與水楊酸介導的信號傳導相關[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，病程相關蛋白BoPR1在BoiEPS過表達植株中的表達量顯著提高，表明BoiEPS具有抗黑腐病的功能。

4 結論

本研究從西蘭花中克隆到1個表皮特異硫蛋白基因，命名為BoiEPS，該基因的基因組DNA全長為1 270 bp， 具有1個內含子，編碼區(qū)全長1 032 bp，編碼343個氨基酸，編碼蛋白含有2個Kelch結構域。系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明，BoiEPS與來自蕓薹屬植物的EPS聚為一組?；虻谋磉_受野油菜黃單胞菌的誘導，在24 h的表達量最大，且該基因的過量表達可顯著提高西蘭花對黑腐病的抗性。