魏 佳Richard John Tiika段慧榮馬彥軍張永濤馬 瑞

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,蘭州 730070;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所,蘭州 730050;3.蘭州市經(jīng)濟(jì)作物試驗(yàn)推廣站,蘭州 730050)

土壤鹽堿化是世界上主要的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題之一,嚴(yán)重制約著農(nóng)業(yè)的發(fā)展[1]。目前全球鹽堿地面積已達(dá)9.54 億hm2,且每年正以1×106～1.5×106hm2的速度在增長(zhǎng),中國(guó)在世界鹽堿地分布最多的國(guó)家中排名第三[2]。鹽脅迫作為植物主要的非生物脅迫之一,會(huì)改變植物的新陳代謝,引起作物減產(chǎn),甚至導(dǎo)致植株死亡[3-5]。鹽生植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中逐漸形成多種特殊的有效機(jī)制,從而減輕鹽分傷害,維持自身正常生理活動(dòng)[6]。

通常,鹽生植物提高自身鹽脅迫抗性的主要方式之一是調(diào)節(jié)體內(nèi)鈉離子(Na+)與鉀離子(K+)的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。K+是植物體內(nèi)含量最多的無(wú)機(jī)陽(yáng)離子,同時(shí)也是植物必須的營(yíng)養(yǎng)元素,在植物光合作用、氣孔運(yùn)動(dòng)、滲透調(diào)節(jié)、細(xì)胞膨壓與伸長(zhǎng)等多種生理活動(dòng)中具有重要作用[8-9]。在高濃度NaCl處理下,鹽生植物羅布麻(ApocynumvenetumLinn.)[10]和西伯利亞白刺(NitrariasibiricaPall.)[11]在吸收大量Na+的同時(shí)能維持地上部較穩(wěn)定的K+濃度。此外,高濃度的Na+會(huì)改變植株體內(nèi)的滲透勢(shì),從而破壞地下和地上部的膜完整性[12-14],但在一定濃度閾值范圍內(nèi)(>10 mmol/L),Na+對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具促進(jìn)作用[15],如增加植物根和地上部的生物量等[16]。就鹽生植物自身而言,植株體內(nèi)的Na+、K+濃度及K+/Na+的變化是衡量其耐鹽性的重要指標(biāo),維持高K+/Na+比更是多數(shù)鹽生植物的重要生長(zhǎng)機(jī)制[17]。

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)系茄科(Solanaceae)枸杞屬(LyciumL.)多棘刺灌木[18-19],因具極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值而備受關(guān)注[20],且喜生于各種類(lèi)型的鹽堿土荒地,沙地,具強(qiáng)萌蘗能力和高耐鹽(≤400 mmol/L)的生態(tài)學(xué)特性[21],是中國(guó)西北地區(qū)特有的野生優(yōu)良水土保持植物[22-23]。由于其對(duì)荒漠區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)至關(guān)重要[24],因此可作為鹽堿化土地植被恢復(fù)的備選植物。鹽脅迫下黑果枸杞的耐鹽性已有報(bào)道[25],然而,在響應(yīng)不同處理時(shí)段鹽脅迫的過(guò)程中,黑果枸杞的耐鹽性及離子積累與分配的變化模式尚缺乏系統(tǒng)研究。因此,本研究以4周齡黑果枸杞幼苗為材料,比較7 d 和20 d 不同濃度NaCl處理后其幼苗的生長(zhǎng)變化,分析Na+、K+吸收和分配的變化規(guī)律,以揭示Na+、K+在黑果枸杞耐鹽性中發(fā)揮的作用,為黑果枸杞耐鹽性的分析提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

以黑果枸杞組培苗為材料,在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院組培室進(jìn)行試驗(yàn)。選擇生長(zhǎng)健壯的黑果枸杞組培苗,剪取5 cm 左右的莖段移入改良的1/2 MS培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁,培養(yǎng)基配方(p H=5.7)為:1/2 MS培養(yǎng)基2.3 g/L,蔗糖30 g/L,瓊脂11 g/L,NAA 0.02 mg/L,IBA 0.06 mg/L。擴(kuò)繁2周后,開(kāi)蓋煉苗3 d,快速用蒸餾水沖洗根部雜質(zhì)并移入含1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的容器中水培2周。1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配方(p H=5.7)為:2 mmol/L KNO3,0.5 mmol/L KH2PO4,0.5 mmol/L MgSO4·7H2O,0.5 mmol/L Ca-(NO3)2·4 H2O,50μmol/L H3BO3,10μmol/L MnCl2·4H2O,1.6μmol/L ZnSO4·7H2O,0.6 μmol/L CuSO4,0.05 μmol/L Na2Mo O4·2H2O,0.06μmol/L Fe-citrate·2H2O。溫室的晝夜溫度約為(22±2)℃/(20±2)℃,光照時(shí)長(zhǎng)約16 h/d,相對(duì)濕度約65%。

1.2 鹽處理

挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的4周齡黑果枸杞幼苗,分別設(shè)置0、50、100、150、200、250、300 mmol/L NaCl 7個(gè)處理梯度,每個(gè)處理設(shè)6次生物學(xué)重復(fù)(每重復(fù)1 株)。每隔2 d 用含相應(yīng)NaCl濃度的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液等量灌溉以補(bǔ)充鹽分。在NaCl處理后的第7天和第20天分根、莖、葉和刺進(jìn)行取樣及測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 測(cè)量指標(biāo)及方法

1.3.1 株高和根長(zhǎng) 肉眼觀測(cè)各植株表型性狀的變化并拍照,用直尺測(cè)量各自的株高與根長(zhǎng)。

1.3.2 生物量 蒸餾水快速清潔植株表面數(shù)次后,用濾紙吸干多余水分,將其根部置于20 mmol/L CaCl2(預(yù)冷)中潤(rùn)洗2次(每次4 min),用以交換細(xì)胞壁間的Na+。用電子分析天秤分別稱(chēng)取根、莖、葉和刺的鮮質(zhì)量,稱(chēng)取后的樣品用信封袋封存后置于烘箱,于105 ℃殺青處理10 min,80 ℃下烘4～5 d至恒質(zhì)量后,用電子分析天秤稱(chēng)取干質(zhì)量(Dry mass)。

1.3.3 Na+、K+離子濃度 將干樣放入20 m L玻璃試管中,加入10 m L 的100 mmol/L 冰乙酸,密封試管,90 ℃恒溫溫浴2 h,自然冷卻后過(guò)濾兩次,稀釋適當(dāng)倍數(shù)后,量取30μL 待測(cè)液上機(jī),用火焰分光光度計(jì)(2655-00,美國(guó))測(cè)定溶液中的Na+、K+濃度。Na+和K+標(biāo)液校準(zhǔn)時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線均滿足R2≥99.9%,組織中Na+、K+濃度(mmol/g)=待測(cè)液濃度(mmol/L)×浸提劑體積(L)/組織干質(zhì)量(g)。

Na+、K+凈吸收速率的計(jì)算參考 Wang等[26]的方法,略有改動(dòng)。公式如下:Na+凈吸收率=(處理n天后整株Na+濃度-BT 的整株Na+濃度)/根鮮質(zhì)量(n天后根鮮質(zhì)量)/△時(shí)間。K+凈吸收率=(處理n天后整株K+濃度-BT的整株K+濃度)/根鮮質(zhì)量(n天后根鮮質(zhì)量)/△時(shí)間,其中BT(before treatment)為NaCl處理之前。在鹽處理之前,幼苗并未產(chǎn)生刺,因此,刺的Na+、K+凈吸收速率未計(jì)算。

Na+相對(duì)分配=處理n天后各器官的Na+濃度/處理n天后的整株Na+濃度;K+相對(duì)分配=處理n天后各器官的K+濃度/處理n天后的整株K+濃度;各器官K+/Na+=各器官K+濃度/各器官Na+濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Microsoft Exeel 2010錄入數(shù)據(jù)并繪制柱狀圖,使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。所得數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl處理對(duì)黑果枸杞幼苗株高和根長(zhǎng)的影響

NaCl處理對(duì)黑果枸杞幼苗株高與根長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖1。不同濃度NaCl處理7 d后,根長(zhǎng)未產(chǎn)生顯著差異,株高在0～150 mmol/L NaCl處理之間維持穩(wěn)定,隨NaCl濃度增加,株高顯著下降。然而,不同濃度NaCl處理20 d后,株高和根長(zhǎng)受到不同程度的抑制,隨著NaCl濃度的增加(150～300 mmol/L),株高下降到一定程度后維持穩(wěn)定,根長(zhǎng)則持續(xù)下降(圖1)?？梢?jiàn),株高和根長(zhǎng)對(duì)鹽處理不同時(shí)間的響應(yīng)不同。

圖1 NaCl處理后黑果枸杞幼苗株高和根長(zhǎng)Fig.1 Plant height and root length of L.ruthenicum under treatment of NaCl stress

2.2 NaCl處理對(duì)黑果枸杞幼苗鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的影響

NaCl處理7 d后,黑果枸杞幼苗根、莖、葉和刺的鮮、干質(zhì)量呈先升后降的趨勢(shì),均在150 mmol/L下達(dá)到最大值(顯著高于對(duì)照),鮮質(zhì)量分別是對(duì)照的1.3、1.2、1.8、2.4倍,干質(zhì)量分別是對(duì)照的1.4、1.3、1.7、2倍(表1)。其中,高濃度NaCl處理下(250和300 mmol/L),根和莖的鮮、干質(zhì)量顯著低于對(duì)照,葉和刺的鮮、干質(zhì)量與對(duì)照無(wú)顯著差異。

NaCl處理20 d后,與對(duì)照相比,黑果枸杞幼苗各器官鮮、干質(zhì)量均有所下降(表1)。其中,除300 mmol/L NaCl顯著抑制葉鮮質(zhì)量外,各器官鮮、干質(zhì)量在150～300 mmol/L NaCl處理之間無(wú)顯著差異。300 mmol/L NaCl處理下,根、莖、葉、刺的鮮質(zhì)量?jī)H分別是對(duì)照的0.4、0.2、0.3、0.3倍,各組織干質(zhì)量?jī)H分別是對(duì)照的0.4、0.3、0.3、0.4倍。

表1 不同處理時(shí)間下黑果枸杞鮮質(zhì)量、干質(zhì)量響應(yīng)NaCl脅迫的變化Table 1 Change of fresh,dry mass of L.ruthenicum response to NaCl stress under different treatment times

2.3 NaCl處理對(duì)黑果枸杞幼苗Na+、K+濃度的影響

隨NaCl處理濃度的增加,黑果枸杞幼苗各器官內(nèi)的Na+濃度均顯著增加,各器官在20 d NaCl處理后積累了更多的Na+,約為7 d NaCl處理的2.7～3.3倍,積累量呈現(xiàn)葉>莖>根>刺的變化規(guī)律(表2)。300 mmol/L NaCl處理7 d后,根、莖、葉、刺N(yùn)a+濃度分別為對(duì)照的18.1、15.9、9.7、26倍,300 mmol/L NaCl處理20 d后各組織Na+濃度分別為對(duì)照的21.6、21.9、14.7和19倍。

鹽處理下,與對(duì)照相比,黑果枸杞幼苗各器官內(nèi)的K+濃度呈下降趨勢(shì),且20 d處理下各器官內(nèi)的K+濃度下降幅度顯著高于7 d處理。值得注意的是,隨著NaCl處理濃度的增加,各器官中的K+濃度并沒(méi)有持續(xù)下降,而是維持相對(duì)穩(wěn)定(表2)。

表2 NaCl處理后黑果枸杞幼苗Na+、K+濃度Table 2 Na+,K+concentration of L.ruthenicum under treatment of NaCl stress

2.4 NaCl處理對(duì)黑果枸杞幼苗Na+、K+凈吸收速率的影響

NaCl處理下,黑果枸杞體內(nèi)Na+凈吸收速率顯著高于對(duì)照,且濃度越高,增幅越大。200～300 mmol/L NaCl處理7 d后,Na+凈吸收速率無(wú)顯著差異,但200～300 mmol/L NaCl處理20 d后,Na+凈吸收速率差異顯著(P<0.05)(圖2-A)。

NaCl處理下,黑果枸杞體內(nèi)K+凈吸收速率均下降,但在7 d和20 d處理下變化程度顯著不同(圖2-B)。0～150 mmol/L NaCl 7 d處理下,K+凈吸收速率較對(duì)照呈下降趨勢(shì),但當(dāng)NaCl≥200 mmol/L時(shí),K+吸收速率能維持相對(duì)穩(wěn)定,且不同濃度NaCl 7 d處理之間的K+凈吸收速率沒(méi)有差異。20 d處理下的K+凈吸收速率均低于對(duì)照,但隨NaCl濃度的增大,各NaCl處理組間K+凈吸收速率維持相對(duì)穩(wěn)定。

圖2 NaCl處理后黑果枸杞幼苗Na+和K+凈吸收速率Fig.2 Na+and K+net absorption rate of L.ruthenicum under treatment of NaCl stress

2.5 NaCl處理對(duì)黑果枸杞幼苗Na+、K+相對(duì)分配的影響

鹽處理下,黑果枸杞各器官內(nèi)Na+和K+的相對(duì)分配比例為葉>莖>根>刺(圖3)。7 d處理下,隨NaCl濃度增加,在300 mmol/L 時(shí)根與莖中Na+相對(duì)分配比例明顯增加,刺中影響不大。K+的相對(duì)分配主要集中在葉中,根和莖中的K+相對(duì)分配與對(duì)照相比,略有下降,刺中變化不大。20 d處理下,Na+仍主要集中于葉,刺中所占比例最小,其他器官變化不大,但K+的相對(duì)分配相較于7 d 處理,在根與莖中所占比例明顯增加。

圖3 NaCl處理后黑果枸杞幼苗Na+和K+相對(duì)分配Fig.3 Na+and K+relative distribution of L.ruthenicum under treatment of NaCl stress

2.6 NaCl處理對(duì)黑果枸杞幼苗K+/Na+的影響

由表3可見(jiàn),NaCl的添加顯著降低各器官的K+/Na+,但隨著NaCl濃度的增加,各器官中的K+/Na+值卻保持恒定,未產(chǎn)生顯著差異。300 mmol/L NaCl處理7 d 后,根、莖、葉和刺中的K+/Na+值僅是對(duì)照的0.03、0.03、0.06、0.02倍;300 mmol/L NaCl處理20 d后,根、莖、葉和刺中的K+/Na+值僅是對(duì)照的0.003、0.005、0.004、0.002倍。

表3 NaCl處理后黑果枸杞幼苗K+/Na+之值Table 3 K+/Na+ration of L.ruthenicum under treatment of NaCl stress

3 討論

對(duì)植物的個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育而言,鹽脅迫最顯著且最直接的作用是影響組織形態(tài)的構(gòu)建[27],作為鹽脅迫反應(yīng)的綜合體現(xiàn),生物量通常是植物耐鹽性的直接指標(biāo)[28-29]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,50～150 mmol/L NaCl 7 d處理下,黑果枸杞能維持正常生長(zhǎng),且150 mmol/L NaCl顯著促進(jìn)各器官的生長(zhǎng),這與包靈[30]在鹽角草和尤佳等[31]對(duì)黃花補(bǔ)血草中的研究結(jié)果相似。值得注意的是,對(duì)多數(shù)甜土植物而言,NaCl脅迫作為其生長(zhǎng)發(fā)育中的有害物質(zhì),會(huì)顯著降低植株生長(zhǎng)量,但對(duì)耐鹽植物而言,適度的NaCl反而促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育,這意味著Na+在液泡中的區(qū)域化使黑果枸杞將其作為有益的滲透調(diào)節(jié)劑,從而維持細(xì)胞滲透勢(shì),增加細(xì)胞含水量,以適應(yīng)外界的高鹽環(huán)境。此外,即使當(dāng)黑果枸杞幼苗遭受7 d 較高濃度NaCl的脅迫時(shí)(200～300 mmol/L),葉和刺的鮮質(zhì)量仍能保持和對(duì)照一致的水平甚至略高于對(duì)照。NaCl脅迫20 d后,雖然各器官生物量均受到一定程度的抑制,但隨著鹽濃度的增加,生長(zhǎng)量卻能維持相對(duì)穩(wěn)定?？梢?jiàn),在面臨20 d的高濃度NaCl處理時(shí),黑果枸杞仍具較強(qiáng)的耐鹽性。

離子穩(wěn)態(tài)是植物獲得耐鹽能力的重要策略之一[32]。在高鹽脅迫下,細(xì)胞內(nèi)的Na+、K+平衡往往會(huì)被破壞,尤其是過(guò)量的Na+對(duì)植物細(xì)胞的代謝活動(dòng)產(chǎn)生不利影響,會(huì)改變滲透勢(shì),降低植株生長(zhǎng)量[33]。因此,植物不同部位在鹽脅迫下對(duì)Na+、K+的選擇性吸收能力就顯得尤為重要。有研究表明[34-35],隨著外界NaCl濃度的不斷增大,植株各器官內(nèi)Na+濃度逐漸升高,本試驗(yàn)結(jié)果與之一致(表2)。Na+濃度在植株體內(nèi)的徒增勢(shì)必會(huì)影響K+濃度,7 d處理下,黑果枸杞體內(nèi)K+濃度與對(duì)照相比雖呈下降趨勢(shì),但隨鹽濃度的增大(≥200 mmol/L),其數(shù)值逐步維持在一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)(表2)。20 d 處理下,K+濃度的變化趨勢(shì)與7 d NaCl處理類(lèi)似,與對(duì)照相比顯著下降,但不同NaCl處理組間能維持相對(duì)穩(wěn)定的K+濃度。因此推測(cè)黑果枸杞在NaCl處理下為保持較高的耐鹽性,在體內(nèi)積累大量Na+的同時(shí)維持各器官相對(duì)穩(wěn)定的K+濃度,這與夏曾潤(rùn)等[10]對(duì)羅布麻的研究結(jié)果相似。以上推測(cè)通過(guò)Na+、K+凈吸收速率得到進(jìn)一步驗(yàn)證。Na+凈吸收速率在7 d與20 d NaCl處理下的上升趨勢(shì)與NaCl濃度呈正相關(guān)(圖2)。K+凈吸收速率在7 d 與20 d NaCl處理下均能維持相對(duì)穩(wěn)定的數(shù)值(圖2),由此可見(jiàn)黑果枸杞可能對(duì)K+具高選擇性吸收與運(yùn)輸能力,這或許是其維持較高耐鹽性的原因之一。

通常,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的K+/Na+最小值在1 左右,但鹽脅迫的影響會(huì)導(dǎo)致該值遠(yuǎn)低于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的正常水平[36]。因此,維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的K+/Na+處于相對(duì)穩(wěn)定的范圍內(nèi)是耐鹽植物的主要特征之一[37]。首先,在7 d與20 d NaCl處理下,黑果枸杞根部的K+/Na+均高于莖部與葉部,這與王龍強(qiáng)等[38]對(duì)黑果枸杞和寧夏枸杞的研究結(jié)果一致。此外,與對(duì)照相比,黑果枸杞各器官間K+/Na+隨NaCl濃度的增大而明顯下降,但在不同鹽濃度之間,均能維持一個(gè)較為穩(wěn)定的K+/Na+。這表現(xiàn)出黑果枸杞對(duì)Na+與K+具較強(qiáng)的運(yùn)輸調(diào)控能力。由此可見(jiàn),通過(guò)調(diào)控K+的選擇性吸收與運(yùn)輸,從而保持葉部較高濃度的K+和各器官較為穩(wěn)定的K+/Na+很可能是黑果枸杞適應(yīng)鹽脅迫的關(guān)鍵性因素之一。

4 結(jié)論

綜合7 d與20 d NaCl脅迫下黑果枸杞幼苗各生物量的變化趨勢(shì),分析得出在兩種不同時(shí)段的處理下,其幼苗均能維持生長(zhǎng),且表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性,20 d處理下,相同NaCl濃度對(duì)其幼苗的生長(zhǎng)抑制程度大于7 d,適度NaCl(50～150 mmol/L)處理能促進(jìn)其生長(zhǎng),且150 mmol/L NaCl是其生長(zhǎng)的最佳條件。各器官內(nèi)Na+濃度、Na+凈吸收速率等結(jié)果顯示鹽脅迫顯著增加黑果枸杞各器官中Na+的積累量,且20 d下的增幅遠(yuǎn)超7 d,但這也不同程度的抑制各器官中的K+濃度、K+凈吸收速率及K+/Na+。值得關(guān)注的是在高濃度Na+的抑制下,其器官在各處理組間仍具維持K+相對(duì)穩(wěn)定的能力。因此,在高鹽脅迫下,黑果枸杞主要通過(guò)維持K+凈吸收速率,穩(wěn)定各器官中K+濃度和K+/Na+,并將Na+與K+更多地分配在地上部組織(葉部)等措施來(lái)減輕鹽分損傷,這是黑果枸杞具較強(qiáng)耐鹽性的主要原因之一。同時(shí),本研究也為黑果枸杞在鹽堿地的推廣和應(yīng)用提供了理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。