烏頭酸對尖孢鐮刀菌百合?；鸵种谱饔梅治?/h1>
2022-03-11 01:42王文珠師桂英蘇國禮牟曉玲朱艷楊宏羽李謀強
西北農(nóng)業(yè)學(xué)報 2022年2期
王文珠師桂英蘇國禮牟曉玲朱 艷楊宏羽李謀強
(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,蘭州 730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,蘭州 730070;3.臨洮縣龍門鎮(zhèn)農(nóng)技推廣站,甘肅 臨洮 730500)
酚酸物質(zhì)是植物根系分泌物中重要的化感物質(zhì),對植物根際土壤微生物生長表現(xiàn)顯著的化感作用。尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum是引起植物產(chǎn)生枯萎病的典型病原真菌[1]。該病原真菌從植物根部侵入,引起維管束病害,最終植株枯萎死亡[2]?？菸儆谕羵鞑『?與地上部分病害相比,防治工作相對困難[3]。利用酚酸類物質(zhì)的化感抑制作用來防控枯萎病已成為近年來的研究熱點。
闡明根系酚酸類物質(zhì)對鐮刀菌生長的影響,是化感抑制劑應(yīng)用研究的基礎(chǔ)。該方面已有諸多文獻(xiàn)報道。郝文雅等[4]研究表明,香豆酸對西瓜?；图怄哏牭毒咦用劝l(fā)、產(chǎn)孢能力、菌絲生長表現(xiàn)顯著抑制作用;翟子翔等[5]認(rèn)為,800 μg·m L-1濃度的肉桂酸對香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌抑制率最強。但是,另一些研究發(fā)現(xiàn),某些酚酸類物質(zhì)可以促進(jìn)病原菌的生長,提高枯萎病的發(fā)生。王倩等[6]研究表明,苯甲酸和肉桂酸可以提高西瓜幼苗枯萎病的發(fā)病率;Tian等[7]發(fā)現(xiàn),蘭州百合根系分泌物鄰苯二甲酸對枯萎病病原菌侵染能力有促進(jìn)作用;類似結(jié)果在其他研究中也有報道。因此,酚酸物質(zhì)對植物枯萎病菌的生長表現(xiàn)出促進(jìn)或抑制作用與酚酸類物質(zhì)的種類或含量有關(guān)[8-9]。
烏頭酸(Aconitic acid,C6H6O6),又名丙烯-1,2,3-三羧酸,由于最先在烏頭屬植物(Aconitum napellus)中發(fā)現(xiàn)而得名。烏頭酸是筆者所在課題組在蘭州百合連作栽培土壤中首次報道的酚酸類化感物質(zhì)[10]。蘭州百合是中國唯一的甜百合。該作物狹域分布,無性繁殖,多年生栽培,主產(chǎn)區(qū)枯萎病發(fā)生十分嚴(yán)重。筆者所在課題組分離獲得主產(chǎn)區(qū)枯萎病主要致病鐮刀菌類群尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)[11],證明鐮刀菌屬真菌的積累是引起蘭州百合連作障礙的原因[12];同時,利用HPLC方法,對0～9 a的蘭州百合根際土壤進(jìn)行分析,共檢測到的11種酚物質(zhì),其中包括烏頭酸在內(nèi)的4種酚酸類物質(zhì)含量較高(大于1μg·g-1干土),而在這4種物質(zhì)中,以烏頭酸含量在各年份含量較為穩(wěn)定[10]。已有研究人員在小麥[13]及葡萄[14]根系分別證明烏頭酸是重要的根系分泌物,對尖孢鐮刀菌具有抑制作用。因此,筆者推測烏頭酸可能會對百合尖孢鐮刀菌產(chǎn)生化感作用?；谝陨媳尘?本試驗選擇烏頭酸作為外源化感物質(zhì),依據(jù)該物質(zhì)在蘭州百合栽培土壤中的含量最大值8.9μg·g-1[10],以及孫明等[15]試驗結(jié)果為參考,按0～1 175 mg·L-1設(shè)計濃度梯度,采用體外抑菌試驗及分子生物學(xué)技術(shù),研究該物質(zhì)對尖孢鐮刀菌的化感效應(yīng)及其轉(zhuǎn)錄水平的分子調(diào)控機理,以期闡明該物質(zhì)對鐮刀菌的化感作用效果,為蘭州百合枯萎病病原性連作障礙治理提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 供試材料
選用培養(yǎng)基中添加外源化感物質(zhì),離體培養(yǎng)微生物的方法。烏頭酸,上海中秦化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum),保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實驗室4.0℃冰箱中,作為病原菌試驗材料。
1.2 試驗方法
1.2.1 烏頭酸對尖孢鐮刀菌生長的測定 設(shè)計5個不同烏頭酸濃度處理,即CK(0 mg·L-1)、T1(1.175 mg·L-1)、T2(11.75 mg·L-1)、T3(117.5 mg·L-1)、T4(1 175 mg·L-1),每處理3次重復(fù)。
將尖孢鐮刀菌菌餅(d=4 mm)接種于添加不同濃度烏頭酸的PDA 培養(yǎng)基上,于28 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d。測定菌落直徑直到第7天,每隔24 h測定1次,繪制菌落生長速率曲線并計算抑菌率。培養(yǎng)第7天后測量產(chǎn)孢量和計算產(chǎn)孢量抑制率。同時,采用載玻片法[16]觀察并記錄孢子萌發(fā)數(shù)。每個處理重復(fù)3次,按公式計算孢子萌發(fā)率和抑制率。
菌落純生長量=菌落直徑-菌餅直徑
抑菌率=(對照皿菌落純生長量-處理皿菌落純生長量)/對照皿菌落純生長量×100%
產(chǎn)孢量=(測量所得孢子數(shù)/80)×400×10 000×稀釋倍數(shù)
產(chǎn)孢量抑制率=[(對照菌落產(chǎn)孢量-處理菌落產(chǎn)孢量)/對照菌落產(chǎn)孢量]×100%
孢子萌發(fā)率=萌發(fā)個數(shù)/總孢子個數(shù)×100%
孢子萌發(fā)抑制率=(對照組萌發(fā)率-處理組萌發(fā)率)/對照組萌發(fā)率×100%
1.2.2 尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜滲透性、可溶性蛋白含量、MDA 含量和SOD、POD 酶活性的測定 取新鮮 菌 餅,加 入PDB 培 養(yǎng) 基,在28 ℃、140 r·min-1恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)5 d 后,取出菌絲團,收集菌絲體[17],置于-20 ℃冰箱中保存。取0.2 g菌絲體(濕質(zhì)量),放入30 m L 不同濃度烏頭酸溶液中,每處理重復(fù)3 次,分別在0、5、15、30、60、90、120、150、180、240 min 時 用 電 導(dǎo) 儀(DDSJ-308F)測定電導(dǎo)率。
在60 m L含不同濃度烏頭酸的PDB 培養(yǎng)基中加入2 g菌絲體,恒溫振蕩培養(yǎng),在12、24、48 h后取出菌絲體,準(zhǔn)確稱取0.5 g,置于已放入少量磷酸鹽緩沖液(PBS,p H=7.4)的研缽中,冰浴研磨成勻漿,將勻漿用PBS定容至10 m L,于4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min,取上清液用于各生理指標(biāo)的測定?？扇苄缘鞍缀坎捎每捡R斯亮藍(lán)G250染色法;MDA 含量的測定采用2-硫代巴比妥酸(TBA)法;SOD、POD 活性測定參照方法[18]。
1.2.3 烏頭酸對尖孢鐮刀菌SOD、POD 酶基因表達(dá)量的測定 將已滅菌的玻璃紙平鋪在含藥培養(yǎng)基后接入4 mm 尖孢鐮刀菌菌餅,28 ℃避光培養(yǎng)。無菌水作對照,每個處理3次重復(fù)。培養(yǎng)5 d后,刮取玻璃紙表面的菌絲置于無酶離心管中,并快速放入液氮中冷凍,待其充分冷凍后置-80 ℃冰箱中保存,待用。
用真菌RNA 提取試劑盒(Fungal RNA Miniprep Kit)提取不同處理下菌絲體的RNA。利用超氧化物歧化酶合成相關(guān)基因特異性引物SODF/R;過氧化物酶合成相關(guān)基因特異性引物PODF/R[19];內(nèi)參基因Actin引物參照齊興柱等[20]的方法。由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean,AG,Changsha,China)合成cDNA;定 量PCR 儀(LightCycler96 Real-Time PCR System,Roche,瑞士)和熒光定量試劑盒(SYBR Green Premix ProTaqHS Qpcr Kit,AG,Changsha,China)進(jìn)行該基因在不同處理下表達(dá)量的分析。反應(yīng)體系為20μL:cDNA 3μL,dd H2O 5μL,上、下游引物各1μL,SYBR 10μL。
表1 PCR 擴增引物Table 1 Primers of PCR
1.3 數(shù)據(jù)分析
采用Excel 2010 處理數(shù)據(jù)并作圖,采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)分析,以Duncan’s檢驗法進(jìn)行多重比較。
2 結(jié)果與分析
2.1 烏頭酸對尖孢鐮刀菌生長的影響
2.1.1 菌落 烏頭酸對尖孢鐮刀菌菌落生長有顯著的抑制作用(P<0.05),隨著烏頭酸濃度的增大,其抑制效果增強(圖1-A)。從第2天開始,與CK 相比,各處理尖孢鐮刀菌菌落的生長速度產(chǎn)生明顯差別,T1、T2、T3、T4 處理的菌落生長變小(圖1-A,1-C)。T1、T2、T3處理的抑菌率分別比CK 增加29.23%、33.95%和38.09%。T4處理下,抑菌率值達(dá)到91.95%,與CK 差異顯著(圖1-B)。在培養(yǎng)第7 天時,CK 菌落直徑為66.34 mm,T4 菌落直徑最小,為9.25 mm(圖1-C)。
圖1 烏頭酸處理后尖孢鐮刀菌生長情況Fig.1 Growth of Fusarium oxysporum under treatment of aconitic acid
2.1.2 產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率 烏頭酸對尖孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量有顯著抑制作用(P<0.05)。隨著烏頭酸濃度的增加,尖孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量降低。與CK 相比,各處理產(chǎn)孢量發(fā)生變化,T1、T3 處理產(chǎn)孢量較CK 差異不顯著,T2和T4處理下產(chǎn)孢量顯著降低,分別降低17%和77%(圖2-A),且產(chǎn)孢量抑制率分別達(dá)到17%與77%(圖2-B);與CK 相比,T1～T4 處理孢子萌發(fā)率均低于CK,T4處理孢子萌發(fā)率、孢子萌發(fā)抑制率分別是4%和93%,差異顯著(P<0.05)(圖2-C,2-D)。隨著烏頭酸濃度的增大,孢子萌發(fā)數(shù)量發(fā)生改變,且T4 處理下孢子萌發(fā)個數(shù)明顯減少(圖2-E～2-H)。
圖2 烏頭酸處理后尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢量與孢子萌發(fā)率Fig.2 Spore yield and spore germination rate of Fusarium oxysporum under treatment of aconitic acid
2.2 烏頭酸對尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜通透性的影響
烏頭酸對尖孢鐮刀菌菌絲體的細(xì)胞膜通透性有一定影響,烏頭酸濃度越高,對菌絲體細(xì)胞膜破壞越大,菌絲體內(nèi)電解質(zhì)外泄越嚴(yán)重(圖3)。在240 min時,T4處理下的電導(dǎo)率值最大,為3 590 μS·cm-1,與CK 相較,顯著提升98.66%。說明烏頭酸濃度越高,對菌絲體的細(xì)胞膜破壞越大,增大菌體通透性。
圖3 烏頭酸處理后尖孢鐮刀菌菌絲體細(xì)胞膜的透性Fig.3 Cell membrane permeability of Fusarium oxysporum mycelium under treatment of aconitic acid
2.3 烏頭酸對尖孢鐮刀菌丙二醛含量和可溶性蛋白含量的影響
培養(yǎng)12 h后,與CK 相比,T1、T2、T3、T4菌體MDA 含 量分別是CK 的1.07、2.76、4.12、4.06倍。由此說明,烏頭酸處理引起菌體發(fā)生膜脂過氧化反應(yīng),提高了菌體MDA 含量,導(dǎo)致細(xì)胞膜受損,并且具有劑量依賴性(圖4-A)。烏頭酸處理降低菌體可溶性蛋白含量,與CK 相比,T4處理菌體可溶性蛋白含量較CK 下降41.54%(圖4-B)。表明烏頭酸濃度越高,對尖孢鐮刀菌的損傷越強。
圖4 烏頭酸處理后尖孢鐮刀菌菌絲體內(nèi)MDA含量(A)和可溶性蛋白含量(B)Fig.4 MDA content(A)and soluble protein content(B)in Fusarium oxysporum mycelium under treatment of aconitic acid
2.4 烏頭酸對尖孢鐮刀菌POD 和SOD 酶活性的影響
烏頭酸處理對尖孢鐮刀菌氧化還原酶活性有顯著影響。12 h時隨烏頭酸濃度的增加,各處理SOD 活性均高于CK。24 h時T1、T4處理SOD活性高于CK,但不顯著,中間濃度值T2和T3處理活性下降,其中T2處理,與CK 相比,SOD 活性降低0.14%。48 h時,所有處理SOD 活性均下 降,與CK 相 比,T4 處 理SOD 活 性 下 降65.06%。結(jié)果表明,隨著濃度和培養(yǎng)時間的增加,SOD活性呈先增加后下降趨勢(圖5-A)。烏頭酸對尖孢鐮刀菌菌絲體的POD 活性有一定影響,12 h時POD 活性CK～T3處理變化不大,只有T4處理POD 活性達(dá)到最大值,24 h時各濃度處理下POD活性均高于CK,與CK相比,T 2和T4處理POD 活性上升3%和2.25%,差異顯著。48 h時各濃度處理下POD 活性均低于CK,與CK 相比,T4處理POD 活性顯著降低82.77%。結(jié)果表明,隨著培養(yǎng)時間和濃度的增加,POD 活性呈先增加后降低趨勢(圖5-B)。
2.5 烏頭酸對尖孢鐮刀菌菌絲體SOD 與POD酶基因表達(dá)量的影響
烏頭酸處理使SOD 與POD 酶合成基因表達(dá)量發(fā)生變化。SOD 酶合成基因在轉(zhuǎn)錄水平上下調(diào)表達(dá),與CK 相比,T2、T3、T4處理SOD 酶合成基因下調(diào),差異顯著,T1處理下酶合成基因表達(dá)量高于CK,但不顯著。在培養(yǎng)第5 天后T2、T3、T4烏頭酸處理下SOD 基因表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào),分別是CK 的2.08×10-7、2.50×10-7、0.78倍(圖6-A)。POD 酶合成基因在轉(zhuǎn)錄水平上下調(diào)表達(dá),與CK 相比,T1、T2、T3、T4烏頭酸處理下POD 基因表達(dá)量均為下調(diào)且差異顯著,分別是CK 的0.05、0.03、0.06、0.09倍(圖6-B)。
圖6 不同濃度烏頭酸處理后尖孢鐮刀菌SOD(A)與POD(B)酶基因表達(dá)量Fig.6 SOD(A)and POD(B)enzyme gene expression of Fusarium oxysporum under different concentrations of aconitic acid
3 討論
烏頭酸是重要的植物根系分泌物,在自然界中存在順式和反式兩種異構(gòu)體。都萃穎[21]研究發(fā)現(xiàn),高含反式烏頭酸TAA 的玉米葉片能顯著抑制根結(jié)線蟲病害且不影響植株正常生長。董艷等[13]研究‘云麥47’和‘綿陽29’兩個小麥品種中根系分泌物,檢測順式烏頭酸,發(fā)現(xiàn)小麥與蠶豆間作降低根際尖孢鐮刀菌的數(shù)量,抑制蠶豆枯萎病的發(fā)生。上述研究均間接證明該物質(zhì)對病原微生物的化感抑制效應(yīng)。本研究結(jié)果表明:1 175 mg·L-1烏頭酸處理對尖孢鐮刀菌菌絲生長、孢子產(chǎn)生及萌發(fā)均具有顯著的抑制作用,可引起菌落生長緩慢,產(chǎn)孢量下降,孢子萌發(fā)率降低;1.175～1 175 mg·L-1時,真菌細(xì)胞膜通透性增大,MDA 含量增加,可溶性蛋白質(zhì)含量降低,SOD 與POD 活性呈先增加后下降趨勢,烏頭酸處理后期,SOD 與POD 酶合成基因在轉(zhuǎn)錄水平上下調(diào)表達(dá)。本研究在離體條件進(jìn)行試驗,為該物質(zhì)對病原微生物的化感抑制效應(yīng)提供直接理論支持。
孫鴻強[10]利用HPLC 方法在蘭州百合栽培土壤中的測到的烏頭酸含量為3.70～8.9 μg·g-1,而且該物質(zhì)在不同連作栽培年限及不同生育時期的百合栽培土壤中含量均較為穩(wěn)定。本研究中的T1 處理,其濃度設(shè)計為1.175 mg·L-1(與土壤濃度8.9μg·g-1相當(dāng)),與CK相比,能夠抑制尖孢鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發(fā),但對產(chǎn)孢基本沒有影響,總體表現(xiàn)抑制作用。孫明等[15]研究發(fā)現(xiàn),反式烏頭酸具有明顯的殺南方根結(jié)線蟲、大豆孢囊線蟲的活性。反式烏頭酸對南方根結(jié)線蟲的使用濃度為100～1 000 μg·m L-1,最佳使用濃度為500μg·m L-1,對其死亡率為85.5%;對大豆孢囊線蟲的使用濃度為200～1 000μg·m L-1,最佳使用濃度為500 μg·m L-1,對其死亡率為99.2%。上述烏頭酸對線蟲防控結(jié)論,為本研究結(jié)果提供了部分支持。本研究結(jié)果表明,在1.175～1 175 mg·L-1時,烏頭酸對尖孢鐮刀菌生長產(chǎn)生完全抑制作用。因此,該濃度為烏頭酸進(jìn)行百合枯萎病(鐮刀菌為主要病原)的化感抑制劑防治試驗設(shè)計提供參考。
本研究在轉(zhuǎn)錄水平上揭示烏頭酸對菌絲體造成傷害的分子機理。在真菌菌體遭受不同生物或非生物脅迫時[22],導(dǎo)致其孢內(nèi)大量活性氧積累,引起生物體內(nèi)POD 與SOD 等氧化還原酶類活性增加;但是,隨著脅迫時間增加,氧化還原酶系統(tǒng)平衡遭到破壞,酶活性在后期下降。劉玲等[23]研究發(fā)現(xiàn),隨著總黃酮濃度和處理時間的增加,尖孢鐮刀菌甜瓜專化型SOD 和CAT 活性總體呈先上升后下降的趨勢。與本研究結(jié)果類似,隨著烏頭酸處理濃度和處理時間的增加,尖孢鐮刀菌百合?；蚐OD 和POD 活性先增加后下降。本研究進(jìn)一步采用Real-time PCR 技術(shù)分析烏頭酸對菌絲體SOD 及POD 酶基因表達(dá)量的影響,結(jié)果表明長時間的烏頭酸處理引起真菌SOD 與POD酶基因表達(dá)量下調(diào),這與劉暢[24]研究結(jié)果一致。由此可知,長時間的烏頭酸處理引起真菌SOD 與POD 酶基因表達(dá)量下調(diào)是SOD 及POD 酶活性下降的原因之一。在本試驗中電導(dǎo)率增加、MDA含量上升、可溶性蛋白含量下降,表明烏頭酸處理破壞尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜的通透性,抑制蘭州百合枯萎病菌生長。這與李珊珊等[25]研究結(jié)果類似。由此推論:長時間的烏頭酸處理,可引起鐮刀菌氧化還原酶等防御酶合成基因在轉(zhuǎn)錄水平上的下調(diào)表達(dá),進(jìn)而引起相關(guān)酶類合成受阻,酶活性降低,生物體內(nèi)活性氧代謝失衡,氧化脅迫加劇,最終破壞菌絲體細(xì)胞膜完整性,對菌體造成傷害。
在自然或正常的濃度范圍內(nèi),反式烏頭酸具有生物安全性,屬食品添加劑。因此,該物質(zhì)具有生態(tài)安全性,具備作為化感抑制劑防治土傳病害應(yīng)用的生態(tài)安全基礎(chǔ)。近期關(guān)于小分子殺線蟲毒素反式烏頭酸生物合成途徑及該毒素應(yīng)用于植物根結(jié)線蟲防治的研究也為該物質(zhì)作為化感抑制劑的應(yīng)用提供有價值的參考[21]。
4 結(jié)論
烏頭酸對尖孢鐮刀菌的生長具有抑制作用,在1.175～1 175 mg·L-1時,隨著濃度增加,抑菌效果明顯,1 175 mg·L-1處理下抑菌效果最佳。烏頭酸處理引起鐮刀菌氧化還原酶類合成基因在轉(zhuǎn)錄水平上下調(diào)表達(dá),導(dǎo)致菌體氧化脅迫加劇,破壞菌絲體細(xì)胞膜完整性,是其抑制鐮刀菌生長的分子機制。
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酚酸物質(zhì)是植物根系分泌物中重要的化感物質(zhì),對植物根際土壤微生物生長表現(xiàn)顯著的化感作用。尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum是引起植物產(chǎn)生枯萎病的典型病原真菌[1]。該病原真菌從植物根部侵入,引起維管束病害,最終植株枯萎死亡[2]?？菸儆谕羵鞑『?與地上部分病害相比,防治工作相對困難[3]。利用酚酸類物質(zhì)的化感抑制作用來防控枯萎病已成為近年來的研究熱點。
闡明根系酚酸類物質(zhì)對鐮刀菌生長的影響,是化感抑制劑應(yīng)用研究的基礎(chǔ)。該方面已有諸多文獻(xiàn)報道。郝文雅等[4]研究表明,香豆酸對西瓜?；图怄哏牭毒咦用劝l(fā)、產(chǎn)孢能力、菌絲生長表現(xiàn)顯著抑制作用;翟子翔等[5]認(rèn)為,800 μg·m L-1濃度的肉桂酸對香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌抑制率最強。但是,另一些研究發(fā)現(xiàn),某些酚酸類物質(zhì)可以促進(jìn)病原菌的生長,提高枯萎病的發(fā)生。王倩等[6]研究表明,苯甲酸和肉桂酸可以提高西瓜幼苗枯萎病的發(fā)病率;Tian等[7]發(fā)現(xiàn),蘭州百合根系分泌物鄰苯二甲酸對枯萎病病原菌侵染能力有促進(jìn)作用;類似結(jié)果在其他研究中也有報道。因此,酚酸物質(zhì)對植物枯萎病菌的生長表現(xiàn)出促進(jìn)或抑制作用與酚酸類物質(zhì)的種類或含量有關(guān)[8-9]。
烏頭酸(Aconitic acid,C6H6O6),又名丙烯-1,2,3-三羧酸,由于最先在烏頭屬植物(Aconitum napellus)中發(fā)現(xiàn)而得名。烏頭酸是筆者所在課題組在蘭州百合連作栽培土壤中首次報道的酚酸類化感物質(zhì)[10]。蘭州百合是中國唯一的甜百合。該作物狹域分布,無性繁殖,多年生栽培,主產(chǎn)區(qū)枯萎病發(fā)生十分嚴(yán)重。筆者所在課題組分離獲得主產(chǎn)區(qū)枯萎病主要致病鐮刀菌類群尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)[11],證明鐮刀菌屬真菌的積累是引起蘭州百合連作障礙的原因[12];同時,利用HPLC方法,對0～9 a的蘭州百合根際土壤進(jìn)行分析,共檢測到的11種酚物質(zhì),其中包括烏頭酸在內(nèi)的4種酚酸類物質(zhì)含量較高(大于1μg·g-1干土),而在這4種物質(zhì)中,以烏頭酸含量在各年份含量較為穩(wěn)定[10]。已有研究人員在小麥[13]及葡萄[14]根系分別證明烏頭酸是重要的根系分泌物,對尖孢鐮刀菌具有抑制作用。因此,筆者推測烏頭酸可能會對百合尖孢鐮刀菌產(chǎn)生化感作用?；谝陨媳尘?本試驗選擇烏頭酸作為外源化感物質(zhì),依據(jù)該物質(zhì)在蘭州百合栽培土壤中的含量最大值8.9μg·g-1[10],以及孫明等[15]試驗結(jié)果為參考,按0～1 175 mg·L-1設(shè)計濃度梯度,采用體外抑菌試驗及分子生物學(xué)技術(shù),研究該物質(zhì)對尖孢鐮刀菌的化感效應(yīng)及其轉(zhuǎn)錄水平的分子調(diào)控機理,以期闡明該物質(zhì)對鐮刀菌的化感作用效果,為蘭州百合枯萎病病原性連作障礙治理提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 供試材料
選用培養(yǎng)基中添加外源化感物質(zhì),離體培養(yǎng)微生物的方法。烏頭酸,上海中秦化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum),保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實驗室4.0℃冰箱中,作為病原菌試驗材料。
1.2 試驗方法
1.2.1 烏頭酸對尖孢鐮刀菌生長的測定 設(shè)計5個不同烏頭酸濃度處理,即CK(0 mg·L-1)、T1(1.175 mg·L-1)、T2(11.75 mg·L-1)、T3(117.5 mg·L-1)、T4(1 175 mg·L-1),每處理3次重復(fù)。
將尖孢鐮刀菌菌餅(d=4 mm)接種于添加不同濃度烏頭酸的PDA 培養(yǎng)基上,于28 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d。測定菌落直徑直到第7天,每隔24 h測定1次,繪制菌落生長速率曲線并計算抑菌率。培養(yǎng)第7天后測量產(chǎn)孢量和計算產(chǎn)孢量抑制率。同時,采用載玻片法[16]觀察并記錄孢子萌發(fā)數(shù)。每個處理重復(fù)3次,按公式計算孢子萌發(fā)率和抑制率。
菌落純生長量=菌落直徑-菌餅直徑
抑菌率=(對照皿菌落純生長量-處理皿菌落純生長量)/對照皿菌落純生長量×100%
產(chǎn)孢量=(測量所得孢子數(shù)/80)×400×10 000×稀釋倍數(shù)
產(chǎn)孢量抑制率=[(對照菌落產(chǎn)孢量-處理菌落產(chǎn)孢量)/對照菌落產(chǎn)孢量]×100%
孢子萌發(fā)率=萌發(fā)個數(shù)/總孢子個數(shù)×100%
孢子萌發(fā)抑制率=(對照組萌發(fā)率-處理組萌發(fā)率)/對照組萌發(fā)率×100%
1.2.2 尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜滲透性、可溶性蛋白含量、MDA 含量和SOD、POD 酶活性的測定 取新鮮 菌 餅,加 入PDB 培 養(yǎng) 基,在28 ℃、140 r·min-1恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)5 d 后,取出菌絲團,收集菌絲體[17],置于-20 ℃冰箱中保存。取0.2 g菌絲體(濕質(zhì)量),放入30 m L 不同濃度烏頭酸溶液中,每處理重復(fù)3 次,分別在0、5、15、30、60、90、120、150、180、240 min 時 用 電 導(dǎo) 儀(DDSJ-308F)測定電導(dǎo)率。
在60 m L含不同濃度烏頭酸的PDB 培養(yǎng)基中加入2 g菌絲體,恒溫振蕩培養(yǎng),在12、24、48 h后取出菌絲體,準(zhǔn)確稱取0.5 g,置于已放入少量磷酸鹽緩沖液(PBS,p H=7.4)的研缽中,冰浴研磨成勻漿,將勻漿用PBS定容至10 m L,于4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min,取上清液用于各生理指標(biāo)的測定?？扇苄缘鞍缀坎捎每捡R斯亮藍(lán)G250染色法;MDA 含量的測定采用2-硫代巴比妥酸(TBA)法;SOD、POD 活性測定參照方法[18]。
1.2.3 烏頭酸對尖孢鐮刀菌SOD、POD 酶基因表達(dá)量的測定 將已滅菌的玻璃紙平鋪在含藥培養(yǎng)基后接入4 mm 尖孢鐮刀菌菌餅,28 ℃避光培養(yǎng)。無菌水作對照,每個處理3次重復(fù)。培養(yǎng)5 d后,刮取玻璃紙表面的菌絲置于無酶離心管中,并快速放入液氮中冷凍,待其充分冷凍后置-80 ℃冰箱中保存,待用。
用真菌RNA 提取試劑盒(Fungal RNA Miniprep Kit)提取不同處理下菌絲體的RNA。利用超氧化物歧化酶合成相關(guān)基因特異性引物SODF/R;過氧化物酶合成相關(guān)基因特異性引物PODF/R[19];內(nèi)參基因Actin引物參照齊興柱等[20]的方法。由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean,AG,Changsha,China)合成cDNA;定 量PCR 儀(LightCycler96 Real-Time PCR System,Roche,瑞士)和熒光定量試劑盒(SYBR Green Premix ProTaqHS Qpcr Kit,AG,Changsha,China)進(jìn)行該基因在不同處理下表達(dá)量的分析。反應(yīng)體系為20μL:cDNA 3μL,dd H2O 5μL,上、下游引物各1μL,SYBR 10μL。
表1 PCR 擴增引物Table 1 Primers of PCR
1.3 數(shù)據(jù)分析
采用Excel 2010 處理數(shù)據(jù)并作圖,采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)分析,以Duncan’s檢驗法進(jìn)行多重比較。
2 結(jié)果與分析
2.1 烏頭酸對尖孢鐮刀菌生長的影響
2.1.1 菌落 烏頭酸對尖孢鐮刀菌菌落生長有顯著的抑制作用(P<0.05),隨著烏頭酸濃度的增大,其抑制效果增強(圖1-A)。從第2天開始,與CK 相比,各處理尖孢鐮刀菌菌落的生長速度產(chǎn)生明顯差別,T1、T2、T3、T4 處理的菌落生長變小(圖1-A,1-C)。T1、T2、T3處理的抑菌率分別比CK 增加29.23%、33.95%和38.09%。T4處理下,抑菌率值達(dá)到91.95%,與CK 差異顯著(圖1-B)。在培養(yǎng)第7 天時,CK 菌落直徑為66.34 mm,T4 菌落直徑最小,為9.25 mm(圖1-C)。
圖1 烏頭酸處理后尖孢鐮刀菌生長情況Fig.1 Growth of Fusarium oxysporum under treatment of aconitic acid
2.1.2 產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率 烏頭酸對尖孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量有顯著抑制作用(P<0.05)。隨著烏頭酸濃度的增加,尖孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量降低。與CK 相比,各處理產(chǎn)孢量發(fā)生變化,T1、T3 處理產(chǎn)孢量較CK 差異不顯著,T2和T4處理下產(chǎn)孢量顯著降低,分別降低17%和77%(圖2-A),且產(chǎn)孢量抑制率分別達(dá)到17%與77%(圖2-B);與CK 相比,T1～T4 處理孢子萌發(fā)率均低于CK,T4處理孢子萌發(fā)率、孢子萌發(fā)抑制率分別是4%和93%,差異顯著(P<0.05)(圖2-C,2-D)。隨著烏頭酸濃度的增大,孢子萌發(fā)數(shù)量發(fā)生改變,且T4 處理下孢子萌發(fā)個數(shù)明顯減少(圖2-E～2-H)。
圖2 烏頭酸處理后尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢量與孢子萌發(fā)率Fig.2 Spore yield and spore germination rate of Fusarium oxysporum under treatment of aconitic acid
2.2 烏頭酸對尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜通透性的影響
烏頭酸對尖孢鐮刀菌菌絲體的細(xì)胞膜通透性有一定影響,烏頭酸濃度越高,對菌絲體細(xì)胞膜破壞越大,菌絲體內(nèi)電解質(zhì)外泄越嚴(yán)重(圖3)。在240 min時,T4處理下的電導(dǎo)率值最大,為3 590 μS·cm-1,與CK 相較,顯著提升98.66%。說明烏頭酸濃度越高,對菌絲體的細(xì)胞膜破壞越大,增大菌體通透性。
圖3 烏頭酸處理后尖孢鐮刀菌菌絲體細(xì)胞膜的透性Fig.3 Cell membrane permeability of Fusarium oxysporum mycelium under treatment of aconitic acid
2.3 烏頭酸對尖孢鐮刀菌丙二醛含量和可溶性蛋白含量的影響
培養(yǎng)12 h后,與CK 相比,T1、T2、T3、T4菌體MDA 含 量分別是CK 的1.07、2.76、4.12、4.06倍。由此說明,烏頭酸處理引起菌體發(fā)生膜脂過氧化反應(yīng),提高了菌體MDA 含量,導(dǎo)致細(xì)胞膜受損,并且具有劑量依賴性(圖4-A)。烏頭酸處理降低菌體可溶性蛋白含量,與CK 相比,T4處理菌體可溶性蛋白含量較CK 下降41.54%(圖4-B)。表明烏頭酸濃度越高,對尖孢鐮刀菌的損傷越強。
圖4 烏頭酸處理后尖孢鐮刀菌菌絲體內(nèi)MDA含量(A)和可溶性蛋白含量(B)Fig.4 MDA content(A)and soluble protein content(B)in Fusarium oxysporum mycelium under treatment of aconitic acid
2.4 烏頭酸對尖孢鐮刀菌POD 和SOD 酶活性的影響
烏頭酸處理對尖孢鐮刀菌氧化還原酶活性有顯著影響。12 h時隨烏頭酸濃度的增加,各處理SOD 活性均高于CK。24 h時T1、T4處理SOD活性高于CK,但不顯著,中間濃度值T2和T3處理活性下降,其中T2處理,與CK 相比,SOD 活性降低0.14%。48 h時,所有處理SOD 活性均下 降,與CK 相 比,T4 處 理SOD 活 性 下 降65.06%。結(jié)果表明,隨著濃度和培養(yǎng)時間的增加,SOD活性呈先增加后下降趨勢(圖5-A)。烏頭酸對尖孢鐮刀菌菌絲體的POD 活性有一定影響,12 h時POD 活性CK～T3處理變化不大,只有T4處理POD 活性達(dá)到最大值,24 h時各濃度處理下POD活性均高于CK,與CK相比,T 2和T4處理POD 活性上升3%和2.25%,差異顯著。48 h時各濃度處理下POD 活性均低于CK,與CK 相比,T4處理POD 活性顯著降低82.77%。結(jié)果表明,隨著培養(yǎng)時間和濃度的增加,POD 活性呈先增加后降低趨勢(圖5-B)。
2.5 烏頭酸對尖孢鐮刀菌菌絲體SOD 與POD酶基因表達(dá)量的影響
烏頭酸處理使SOD 與POD 酶合成基因表達(dá)量發(fā)生變化。SOD 酶合成基因在轉(zhuǎn)錄水平上下調(diào)表達(dá),與CK 相比,T2、T3、T4處理SOD 酶合成基因下調(diào),差異顯著,T1處理下酶合成基因表達(dá)量高于CK,但不顯著。在培養(yǎng)第5 天后T2、T3、T4烏頭酸處理下SOD 基因表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào),分別是CK 的2.08×10-7、2.50×10-7、0.78倍(圖6-A)。POD 酶合成基因在轉(zhuǎn)錄水平上下調(diào)表達(dá),與CK 相比,T1、T2、T3、T4烏頭酸處理下POD 基因表達(dá)量均為下調(diào)且差異顯著,分別是CK 的0.05、0.03、0.06、0.09倍(圖6-B)。
圖6 不同濃度烏頭酸處理后尖孢鐮刀菌SOD(A)與POD(B)酶基因表達(dá)量Fig.6 SOD(A)and POD(B)enzyme gene expression of Fusarium oxysporum under different concentrations of aconitic acid
3 討論
烏頭酸是重要的植物根系分泌物,在自然界中存在順式和反式兩種異構(gòu)體。都萃穎[21]研究發(fā)現(xiàn),高含反式烏頭酸TAA 的玉米葉片能顯著抑制根結(jié)線蟲病害且不影響植株正常生長。董艷等[13]研究‘云麥47’和‘綿陽29’兩個小麥品種中根系分泌物,檢測順式烏頭酸,發(fā)現(xiàn)小麥與蠶豆間作降低根際尖孢鐮刀菌的數(shù)量,抑制蠶豆枯萎病的發(fā)生。上述研究均間接證明該物質(zhì)對病原微生物的化感抑制效應(yīng)。本研究結(jié)果表明:1 175 mg·L-1烏頭酸處理對尖孢鐮刀菌菌絲生長、孢子產(chǎn)生及萌發(fā)均具有顯著的抑制作用,可引起菌落生長緩慢,產(chǎn)孢量下降,孢子萌發(fā)率降低;1.175～1 175 mg·L-1時,真菌細(xì)胞膜通透性增大,MDA 含量增加,可溶性蛋白質(zhì)含量降低,SOD 與POD 活性呈先增加后下降趨勢,烏頭酸處理后期,SOD 與POD 酶合成基因在轉(zhuǎn)錄水平上下調(diào)表達(dá)。本研究在離體條件進(jìn)行試驗,為該物質(zhì)對病原微生物的化感抑制效應(yīng)提供直接理論支持。
孫鴻強[10]利用HPLC 方法在蘭州百合栽培土壤中的測到的烏頭酸含量為3.70～8.9 μg·g-1,而且該物質(zhì)在不同連作栽培年限及不同生育時期的百合栽培土壤中含量均較為穩(wěn)定。本研究中的T1 處理,其濃度設(shè)計為1.175 mg·L-1(與土壤濃度8.9μg·g-1相當(dāng)),與CK相比,能夠抑制尖孢鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發(fā),但對產(chǎn)孢基本沒有影響,總體表現(xiàn)抑制作用。孫明等[15]研究發(fā)現(xiàn),反式烏頭酸具有明顯的殺南方根結(jié)線蟲、大豆孢囊線蟲的活性。反式烏頭酸對南方根結(jié)線蟲的使用濃度為100～1 000 μg·m L-1,最佳使用濃度為500μg·m L-1,對其死亡率為85.5%;對大豆孢囊線蟲的使用濃度為200～1 000μg·m L-1,最佳使用濃度為500 μg·m L-1,對其死亡率為99.2%。上述烏頭酸對線蟲防控結(jié)論,為本研究結(jié)果提供了部分支持。本研究結(jié)果表明,在1.175～1 175 mg·L-1時,烏頭酸對尖孢鐮刀菌生長產(chǎn)生完全抑制作用。因此,該濃度為烏頭酸進(jìn)行百合枯萎病(鐮刀菌為主要病原)的化感抑制劑防治試驗設(shè)計提供參考。
本研究在轉(zhuǎn)錄水平上揭示烏頭酸對菌絲體造成傷害的分子機理。在真菌菌體遭受不同生物或非生物脅迫時[22],導(dǎo)致其孢內(nèi)大量活性氧積累,引起生物體內(nèi)POD 與SOD 等氧化還原酶類活性增加;但是,隨著脅迫時間增加,氧化還原酶系統(tǒng)平衡遭到破壞,酶活性在后期下降。劉玲等[23]研究發(fā)現(xiàn),隨著總黃酮濃度和處理時間的增加,尖孢鐮刀菌甜瓜專化型SOD 和CAT 活性總體呈先上升后下降的趨勢。與本研究結(jié)果類似,隨著烏頭酸處理濃度和處理時間的增加,尖孢鐮刀菌百合?；蚐OD 和POD 活性先增加后下降。本研究進(jìn)一步采用Real-time PCR 技術(shù)分析烏頭酸對菌絲體SOD 及POD 酶基因表達(dá)量的影響,結(jié)果表明長時間的烏頭酸處理引起真菌SOD 與POD酶基因表達(dá)量下調(diào),這與劉暢[24]研究結(jié)果一致。由此可知,長時間的烏頭酸處理引起真菌SOD 與POD 酶基因表達(dá)量下調(diào)是SOD 及POD 酶活性下降的原因之一。在本試驗中電導(dǎo)率增加、MDA含量上升、可溶性蛋白含量下降,表明烏頭酸處理破壞尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜的通透性,抑制蘭州百合枯萎病菌生長。這與李珊珊等[25]研究結(jié)果類似。由此推論:長時間的烏頭酸處理,可引起鐮刀菌氧化還原酶等防御酶合成基因在轉(zhuǎn)錄水平上的下調(diào)表達(dá),進(jìn)而引起相關(guān)酶類合成受阻,酶活性降低,生物體內(nèi)活性氧代謝失衡,氧化脅迫加劇,最終破壞菌絲體細(xì)胞膜完整性,對菌體造成傷害。
在自然或正常的濃度范圍內(nèi),反式烏頭酸具有生物安全性,屬食品添加劑。因此,該物質(zhì)具有生態(tài)安全性,具備作為化感抑制劑防治土傳病害應(yīng)用的生態(tài)安全基礎(chǔ)。近期關(guān)于小分子殺線蟲毒素反式烏頭酸生物合成途徑及該毒素應(yīng)用于植物根結(jié)線蟲防治的研究也為該物質(zhì)作為化感抑制劑的應(yīng)用提供有價值的參考[21]。
4 結(jié)論
烏頭酸對尖孢鐮刀菌的生長具有抑制作用,在1.175～1 175 mg·L-1時,隨著濃度增加,抑菌效果明顯,1 175 mg·L-1處理下抑菌效果最佳。烏頭酸處理引起鐮刀菌氧化還原酶類合成基因在轉(zhuǎn)錄水平上下調(diào)表達(dá),導(dǎo)致菌體氧化脅迫加劇,破壞菌絲體細(xì)胞膜完整性,是其抑制鐮刀菌生長的分子機制。
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