夏倫斌孫 立何燕飛孫桃桃

曹建文1,賈 哲1,徐光沛1

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院,安徽六安 237012;2.安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室,安徽 六安 237012)

蠕形螨(Follicle mite)寄生于人和哺乳動(dòng)物的毛囊和皮脂腺內(nèi),已知有140 余種和亞種[1]。犬蠕形螨病是由犬蠕形螨(Demodexcanis)引起犬的一種常見(jiàn)而又頑固性的皮膚寄生蟲(chóng)病,又稱犬毛囊蟲(chóng)病或犬脂螨病[2]。臨床上感染蠕形螨患犬,若不能得到及時(shí)治療或治療效果不佳,常會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)細(xì)菌及/或真菌等其他病菌感染,嚴(yán)重影響犬只的健康[3-4]。因此,臨床上及時(shí)對(duì)患犬確診,是有效治療的關(guān)鍵。研究表明,犬蠕形螨主要通過(guò)直接或間接接觸患犬及其周圍環(huán)境等途徑感染,初期以鼻部、眼睛、頭等周圍少毛或無(wú)毛部位為主,然后蔓延至頸部、四肢、腹部、背部[5],由于免疫力下降常引起全身性蠕形螨感染[6],其臨床癥狀多以脫毛、皮炎、瘙癢、紅斑、結(jié)痂以及伴有腥臭味為特征[3,7]。近年來(lái),犬蠕形螨與細(xì)菌及/或真菌混合感染在犬皮膚病臨床上比較常見(jiàn),約占15%～20%,患犬病程較長(zhǎng),治療周期長(zhǎng),治療效果不理想,而且特別容易復(fù)發(fā)[8],給臨床治療造成了困難。本研究通過(guò)對(duì)1 例疑似犬蠕形螨感染犬,采取隔離,臨床癥狀檢查,并結(jié)合血常規(guī)、生化指標(biāo)、寄生蟲(chóng)學(xué)和微生物學(xué)檢查等實(shí)驗(yàn)室方法,確診引起患犬的病因,選擇適合藥物進(jìn)行對(duì)因和對(duì)癥治療,觀察治療效果,為犬蠕形螨混合細(xì)菌感染的診斷和有效治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 患犬來(lái)源 患犬為皖西學(xué)院小動(dòng)物診療實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心收留的校園流浪犬,雜交犬,約3歲,雌性,體質(zhì)量約14.3 kg。

1.1.2 試劑藥品 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA),購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司;BHI培養(yǎng)基,購(gòu)自杭州百思生物技術(shù)有限公司;革蘭氏染液和Diff-Quik 染液,購(gòu)自上海信帆生物科技有限公司;革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌生化檢測(cè)卡,購(gòu)自法國(guó)梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;多拉菌素注射液(生產(chǎn)批號(hào)1825716),購(gòu)自美國(guó)輝瑞(上海)動(dòng)物保健品有限公司;鹽酸特比萘芬噴劑(生產(chǎn)批號(hào)20200401),購(gòu)自天津保靈動(dòng)物保健品有限公司;硫酸阿米卡星注射液(獸藥字080067009),購(gòu)自黑龍江省北安市飛龍動(dòng)物藥廠;地塞米松磷酸鈉注射液(獸藥字120152529),購(gòu)自合肥中龍神力動(dòng)物藥業(yè)有限公司;寵物營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑,購(gòu)自艾澌克(南京)生物科技有限公司;草本固元膏,購(gòu)自乾元?jiǎng)游锼帢I(yè)有限責(zé)任公司;過(guò)氧化氫消毒液,購(gòu)自江西草珊瑚消毒用品有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 SW-CJ-2FD 型超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司;BC-2800VET 型血細(xì)胞分析儀,深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;DT-480全自動(dòng)生化分析儀,廣州東唐電子科技有限公司;GHP-9270型恒溫培養(yǎng)箱,上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;BK6000生物顯微鏡,重慶奧特光學(xué)儀器有限公司;VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀,梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;其他儀器和耗材均由皖西學(xué)院小動(dòng)物診療實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 一般臨床檢查 對(duì)病犬進(jìn)行體溫和全身病變檢查并記錄。

1.2.2 血常規(guī)和血液生化檢查 前肢靜脈采集血液于抗凝管和EP 管中,分別進(jìn)行血常規(guī)檢查和血液生化分析。

1.2.3 寄生蟲(chóng)與真菌檢查 先利用伍德氏燈和放大鏡進(jìn)行真菌及體表寄生蟲(chóng)檢查,然后進(jìn)一步依據(jù)患病犬的體表病變,采用皮膚深層刮片法,即手持鈍刃刀片垂直于皮膚、以中等壓力沿毛發(fā)生長(zhǎng)方向進(jìn)行刮片,在不同患處采集3張皮膚刮片并鏡檢;同時(shí)用手術(shù)刀片刮擦病變部位皮膚并將收集的皮膚滲出物樣本涂布到玻片上,干燥后用Diff-Quik染液染色,進(jìn)行皮膚細(xì)胞學(xué)檢查[9]。觀察是否有蠕形螨等寄生蟲(chóng)及真菌性微生物感染。

1.2.4 細(xì)菌學(xué)檢查、病菌分離與鑒定 采用滅菌棉棒于皮膚潰瘍處擦拭,蘸取滲出液或膿液,轉(zhuǎn)接到TSA 培養(yǎng)基中,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后觀察病菌生長(zhǎng)情況。再依據(jù)不同菌落形態(tài)或顏色挑選單個(gè)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng),然后轉(zhuǎn)接到BHI培養(yǎng)基培養(yǎng),離心收集細(xì)菌后,用滅菌NaCl溶液(4.5 g/L,p H 6.5)調(diào)制菌懸液麥?zhǔn)媳葷岫戎?.55,然后按照VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行鑒定。

1.2.5 分離菌藥敏試驗(yàn) 在超凈工作臺(tái)內(nèi),采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行敏感藥物篩選[10],用接種環(huán)挑取分離菌株單個(gè)菌落接種到TSA 培養(yǎng)基平板上,加100μL滅菌蒸餾水,用三角形涂布棒過(guò)火焰后,均勻涂布,再分別將8類9種藥敏紙片緊貼于培養(yǎng)基表面,然后放置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,觀察并測(cè)量記錄抑菌圈直徑的大小,參考美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)[11]判定藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.6 確診與治療 依據(jù)檢查結(jié)果,分析并確診患病犬的病因,選擇適合藥物進(jìn)行治療。治療前推去全身犬毛,用過(guò)氧化氫消毒液(30.0 g/L)清洗犬身,吹干后,單獨(dú)飼喂。采用抗寄生蟲(chóng)和抗菌治療,同時(shí)結(jié)合對(duì)癥和提高犬體免疫力等綜合措施進(jìn)行治療。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般臨床檢查結(jié)果

犬體溫為38.4 ℃,無(wú)異常;體表臨床檢查可見(jiàn)全身多處大面積脫毛、丘疹性皮炎并伴有紅斑和結(jié)痂性潰瘍(圖1-A、B);面部和眼眶周圍脫毛、彌散性脫屑、紅斑和丘疹性皮炎(圖1-C);四肢端及爪部有嚴(yán)重的脫毛、紅斑及皮疹(圖1-D);此外,患病犬消瘦、喜躲避在角落里,食欲基本正常。

圖1 患病犬全身性病變Fig.1 Systemic lesions in sick dog

2.2 血常規(guī)檢查結(jié)果

由表1可知,患犬白細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)顯著升高,紅細(xì)胞體積分布寬度和血小板數(shù)均略有升高,其他指標(biāo)均在參考值范圍,結(jié)合一般檢查和癥狀,表明患犬有嚴(yán)重慢性感染和炎癥。

表1 治療前血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 1 Test results of blood routine indicators before treatment

2.3 血液生化檢查結(jié)果

由表2可知,血液總蛋白含量升高,白蛋白和血鈣含量略有降低,γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶略有升高,其他各項(xiàng)指標(biāo)均在參考值范圍。血液總蛋白主要由白蛋白和球蛋白組成,患病犬白蛋白含量略有降低,而總蛋白含量升高,這可能與患犬因全身感染和炎癥引起血液免疫球蛋白含量升高有關(guān);白蛋白和血鈣含量略有下降,可能因?yàn)槿砀腥緦?dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)攝入不足引起的。

表2 治療前血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 2 Test results of blood biochemical indexes before treatment

2.4 寄生蟲(chóng)與真菌檢查結(jié)果

經(jīng)體表檢查,未見(jiàn)有疥螨、蜱蟲(chóng)、跳蚤等體表寄生蟲(chóng),伍德氏燈檢查未檢出犬小孢子菌感染;進(jìn)一步皮膚刮片鏡檢,觀察到蠕形螨蟲(chóng)體(圖2),同時(shí)未檢出真菌孢子;皮膚細(xì)胞學(xué)檢查也未見(jiàn)有真菌性致病菌。

圖2 皮膚刮片鏡檢見(jiàn)有蠕形螨蟲(chóng)體(黑色箭頭所示,×10)Fig.2 Demodex canis observed by skin scraping microscopy(shown by black arrow,×10)

2.5 細(xì)菌學(xué)檢查、病菌分離與革蘭氏染色結(jié)果

細(xì)菌分離培養(yǎng)獲得2種呈不同顏色的菌落,一種呈圓形不透明、邊緣整齊光滑的乳白色菌落,另一種為圓形、邊緣整齊不透明的金黃色菌落,由此可初步判斷為不同的兩種細(xì)菌株(圖3),進(jìn)一步挑選兩種菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)(圖4)。將金黃色菌株和乳白色菌株分別命名為細(xì)菌Ⅰ和細(xì)菌Ⅱ。革蘭氏染色鏡檢顯示細(xì)菌Ⅰ為呈不規(guī)則葡萄串狀排列的革蘭氏陽(yáng)性球菌(圖5),細(xì)菌Ⅱ?yàn)槌蕟蝹€(gè)或雙個(gè)排列的革蘭氏陰性短桿菌(圖6)。

圖3 皮膚病灶處微生物培養(yǎng)(開(kāi)放箭頭所示為白色菌落,鉆石箭頭所示為金黃色菌落)Fig.3 Microbial culture result of skin lesions(white colony as shown by open arrow and golden colony as shown by diamond arrow)

圖4 2種分離菌純化培養(yǎng)(左為乳白色菌落,右為金黃色菌落)Fig.4 Purified culture of two isolated bacteria(milky white colony on left and golden yellow colony on right)

圖5 細(xì)菌Ⅰ革蘭氏染色鏡檢結(jié)果(×1000)Fig.5 Gram staining and microscopic examination result of bacteriaⅠ(×1000)

圖6 細(xì)菌Ⅱ革蘭氏染色鏡檢結(jié)果(×1000)Fig.6 Gram staining and microscopic examination result of bacteriaⅡ(×1000)

2.6 分離菌鑒定結(jié)果

細(xì)菌Ⅰ和細(xì)菌Ⅱ分別用革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌生化鑒定卡在VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀上進(jìn)行鑒定,依據(jù)細(xì)菌的生化反應(yīng)結(jié)果,結(jié)合細(xì)菌菌落、染色和形態(tài)特點(diǎn),細(xì)菌Ⅰ和細(xì)菌Ⅱ分別鑒定為金黃色葡萄球菌(置信度為97%)和大腸桿菌(置信度為99%)。

2.7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由圖7和表3可知,細(xì)菌Ⅰ僅對(duì)丁胺卡那霉素敏感,而對(duì)萬(wàn)古霉素、頭孢氨芐、呋喃唑酮、氨芐西林、氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、頭孢曲松、環(huán)丙沙星等8種藥物均耐藥;細(xì)菌Ⅱ?qū)θf(wàn)古霉素、丁胺卡那和環(huán)丙沙星等藥物敏感,對(duì)頭孢氨芐和頭孢曲松為中度敏感,對(duì)呋喃唑酮、氨芐西林、氟苯尼考、強(qiáng)力霉素等藥物耐藥。可見(jiàn),細(xì)菌Ⅰ和細(xì)菌Ⅱ?qū)Χ“房敲顾鼐舾小?/p>

表3 患病犬病灶分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of drug sensitivity test for isolated strain from lesions of diseased dog

圖7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果(A為細(xì)菌Ⅰ;B為細(xì)菌Ⅱ)Fig.7 Results of drug sensitive test(A is bacteriaⅠ;B is bacteriaⅡ)

2.8 診斷與治療效果觀察

依據(jù)血常規(guī)、生理生化指標(biāo)、寄生蟲(chóng)學(xué)和微生物學(xué)檢查與鑒定結(jié)果,結(jié)合臨床癥狀,患犬確診為犬蠕形螨混合金黃色葡萄球菌和大腸桿菌感染。

治療前推去全身毛發(fā),患處用過(guò)氧化氫清洗消毒后吹干。采用多拉菌素(10 mg/m L)皮下注射,按0.3 mg/kg體質(zhì)量給藥,每周1次,連續(xù)給藥6周;用丁胺卡那霉素(50 000 U,50 mg/m L)肌肉注射,按12.5 mg/kg體質(zhì)量給藥,每日2次,早晚各1次,連續(xù)給藥7 d;地塞米松(0.4 mg/m L)肌肉注射,按2.5 m L/次給藥,每日1次,連續(xù)給藥5 d;草本固元膏(含黃芪、人參葉、枸杞、沙棘等),采用涂抹在犬的鼻端讓其舔舐,約10 g/次,每日2次,早晚各1次,連續(xù)6周;寵物營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑(含茶多酚、維生素B族等,0.65 g/片),每日5片,碾碎拌料飼喂,連續(xù)6周;為了預(yù)防繼發(fā)真菌感染,采用特比萘芬噴劑(1%)噴于患處及其周圍,每3 d 1次,連續(xù)6周;此外,每周用除螨香波洗浴1次,并用干毛巾擦干。通過(guò)以上綜合治療措施,患病犬治療效果明顯,治療前的全身皮膚癥狀基本治愈,毛發(fā)生長(zhǎng)(圖8)。經(jīng)皮膚刮片鏡檢,未再發(fā)現(xiàn)蠕形螨蟲(chóng)體;血常規(guī)和生化指標(biāo)檢查未見(jiàn)異常,各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍。為了鞏固治療效果,一個(gè)療程結(jié)束后,休藥1周,再連續(xù)給藥3 d,其中多拉菌素每周1次,連續(xù)給藥3周。

圖8 治療后患病犬全身病灶恢復(fù)情況Fig.8 Recovery of systemic lesions in sick dog after treatment

3 討論

近年來(lái),隨著人們對(duì)伴侶動(dòng)物疫苗接種的認(rèn)知越來(lái)越高,犬瘟、犬細(xì)小病毒病等傳染性疾病發(fā)病率呈下降趨勢(shì),但犬的寄生蟲(chóng)性皮膚病,如疥螨病、蠕形螨病等卻在犬的臨床疾病中所占比例呈現(xiàn)升高的趨勢(shì),尤其在高溫潮濕季節(jié),占比高達(dá)20%～30%[12],嚴(yán)重危害犬的健康,同時(shí)也給犬主人帶來(lái)情感上、生活上和經(jīng)濟(jì)上的負(fù)面影響。犬蠕形螨病是犬常見(jiàn)的寄生蟲(chóng)性皮膚病之一,以引起犬只脫毛、紅斑、色素沉著、繼發(fā)膿皮病和瘙癢癥為主要特征,依據(jù)發(fā)病程度分為犬局部蠕形螨病和全身蠕形螨病[9]。全身性蠕形螨病為一種較難以治療的皮膚病,若不能得到有效治療則很難治愈,甚至危及犬的生命[13]。該病在臨床上確診難度不大,首先依據(jù)臨床病癥是否與犬蠕形螨病病癥相符合或相似,可初步疑似蠕形螨感染,進(jìn)一步通過(guò)拔毛法、透明膠帶粘貼法或皮膚刮片法制成玻片,進(jìn)行寄生蟲(chóng)學(xué)檢查,若觀察到蠕形螨蟲(chóng)體或其蟲(chóng)卵即可確診。本病例患犬臨床癥狀符合全身蠕形螨病的基本特征,經(jīng)皮膚刮片檢查檢出蠕形螨蟲(chóng)體,說(shuō)明有蠕形螨感染。

犬蠕形螨病是一種慢性感染過(guò)程,常引起犬的營(yíng)養(yǎng)不良和免疫力降低,容易造成繼發(fā)細(xì)菌及/或真菌混合感染,在臨床診斷上需要特別加以注意,否則容易造成漏診,導(dǎo)致治療效果不佳。本病例通過(guò)微生物培養(yǎng),從患犬病灶處分離得到1株革蘭氏陽(yáng)性球菌和1 株革蘭氏陰性桿菌,經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀分別鑒定為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀依據(jù)微生物的生化代謝特點(diǎn),結(jié)合現(xiàn)代自動(dòng)化技術(shù),實(shí)現(xiàn)對(duì)菌株快速和自動(dòng)化鑒定,可靠性和重復(fù)性極高,非常適合臨床快速、準(zhǔn)確鑒定病原菌[14-15],相較于微生物傳統(tǒng)生化鑒定方法,避免了繁瑣、耗時(shí)的鑒定過(guò)程,同時(shí)相較于16S r RNA 基因序列鑒定方法[16],具有成本低、易操作和效率高的特點(diǎn)。因此,本研究中分離菌株鑒定結(jié)果可靠,也比較經(jīng)濟(jì)。

研究表明,因抗生素的不科學(xué)使用,導(dǎo)致犬源細(xì)菌呈多重耐藥現(xiàn)象比較普遍[17-19]。為了對(duì)患犬進(jìn)行有效治療,本病例對(duì)分離菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn),分離的金黃色葡萄球菌僅對(duì)丁胺卡那霉素敏感,而對(duì)其他8種藥物均耐藥,分離的大腸桿菌對(duì)丁胺卡那霉素、萬(wàn)古霉素和環(huán)丙沙星等藥物敏感,對(duì)頭孢曲松和頭孢氨芐為中度敏感,而對(duì)呋喃唑酮等其他4種藥物耐藥。可見(jiàn),選擇敏感藥物在寵物臨床感染性疾病治療上至關(guān)重要,起到事半功倍的作用,否則因使用的藥物不敏感而導(dǎo)致治療效果不佳,甚至引起更嚴(yán)重后果。目前,國(guó)內(nèi)寵物醫(yī)院在進(jìn)行細(xì)菌性感染的治療過(guò)程中,多數(shù)情況下沒(méi)有進(jìn)行敏感藥物篩選或可能因不具備相應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件,存在盲目選擇抗生素進(jìn)行治療現(xiàn)象,這一方面可能導(dǎo)致治療效果不理想,另一方面也是抗生素的不科學(xué)使用,給環(huán)境和人類健康帶來(lái)不利影響,這應(yīng)該引起臨床獸醫(yī)師的高度重視。

本病例在治療過(guò)程中,采用了抗蟲(chóng)、抗菌、對(duì)癥和提高犬體免疫力等綜合治療措施。選擇多拉菌素進(jìn)行抗蠕形螨治療,多拉菌素具有長(zhǎng)效、安全和低殘留等特點(diǎn),為目前公認(rèn)的阿維菌素族中最優(yōu)的體內(nèi)外寄生蟲(chóng)藥物之一,同時(shí)還具有抗炎活性[20];選用丁胺卡那霉素進(jìn)行抗菌治療,因分離鑒定的葡萄球菌和大腸桿菌對(duì)丁胺卡那霉素均敏感,避免了同時(shí)使用多種抗生素;為了進(jìn)一步改善犬機(jī)體炎癥反應(yīng)、以及提升抗毒素、抗過(guò)敏等作用,使用地塞米松進(jìn)行肌肉注射,研究表明,地塞米松聯(lián)合抗生素進(jìn)行治療,能夠減輕炎癥反應(yīng)、改善免疫功能[21],但不宜長(zhǎng)期使用,因地塞米松是一種腎上腺糖皮質(zhì)激素,長(zhǎng)期使用會(huì)引起腎上腺皮質(zhì)功能不全等毒副作用,因此,本病例治療中地塞米松給藥期為5 d;為了提升患犬的抗病力,還用中藥膏劑和維生素等營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑進(jìn)行補(bǔ)飼,以促進(jìn)代謝機(jī)能,增強(qiáng)機(jī)體免疫力;為了預(yù)防繼發(fā)真菌感染,應(yīng)用特比萘芬抗真菌噴劑進(jìn)行外用;此外,為了去除犬體表污物保持清潔,每周用除螨香波給患犬洗浴,洗浴后將犬身擦干或吹干,以免潮濕給螨蟲(chóng)提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境,影響治療效果。因蠕形螨感染治療周期較長(zhǎng),治療不徹底容易復(fù)發(fā),為了鞏固治療效果,本病例進(jìn)行了加強(qiáng)治療。通過(guò)以上措施綜合治療,患犬取得了良好治療效果,可為犬蠕形螨混合細(xì)菌感染的診斷與治療提供參考。