徐聰楊正標(biāo)王海蘋李懷平鄭高利宣堯仙陳穎*

(1. 杭州醫(yī)學(xué)院安全性評(píng)價(jià)研究中心,杭州 310053;2. 浙江省藥物安全性評(píng)價(jià)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州醫(yī)學(xué)院,杭州 310053;3. 金訶藏藥(山東)健康產(chǎn)業(yè)有限公司,濟(jì)南 250104)

安兒寧顆粒為經(jīng)典藏醫(yī)兒科用藥“久協(xié)更卓”的現(xiàn)代劑型,處方由天竺黃、紅花、人工牛黃、巖白菜、甘草、高山辣根菜、洪連、檀香、唐古特烏頭九味藏藥組成[1]。安兒寧顆粒具有清熱祛風(fēng)、化痰止咳功效,臨床上主要用于治療小兒風(fēng)熱感冒、咳嗽有痰、發(fā)熱咽痛等上呼吸道感染[2-3]。處方中青藏高原特有藥材唐古特烏頭,為毛茛科烏頭屬,含有內(nèi)酯型二帖生物堿,文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)小鼠具有一定的急性毒性[4-5];另紅花,為活血化瘀藥材,可顯著延長(zhǎng)凝血酶原和凝血酶時(shí)間,可能具有潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)[6]。安兒寧顆粒上市近20年,據(jù)2018 ~ 2020年國(guó)家藥品不良反應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)反饋顯示[7],安兒寧顆粒使用患兒約為1480萬(wàn),其中有122例報(bào)告發(fā)生腹瀉或皮疹等不良反應(yīng)。雖然其不良反應(yīng)報(bào)告率 < 0.01%,但鑒于安兒寧顆粒正逐漸被聯(lián)合用藥用于其他小兒適應(yīng)癥[8-13],且目前缺少安兒寧顆粒對(duì)幼齡動(dòng)物的相關(guān)毒理學(xué)數(shù)據(jù),本文特開展大劑量安兒寧顆粒在幼年大鼠的單次給藥以及3個(gè)月重復(fù)給藥的毒性研究,進(jìn)一步評(píng)價(jià)其兒科用藥安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

240只3 ~ 4周齡健康SPF級(jí)SD大鼠,雌雄各半,體重為40 ~ 60 g,購(gòu)自上海市西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(滬)2018-0016】。飼養(yǎng)期間各組大鼠自由飲水(經(jīng)LAWS-2000實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反滲透純水機(jī)處理純水和攝食(鈷60輻照的全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料),給藥前大鼠禁食不禁水,溫度20.5 ~ 25.5℃,相對(duì)濕度50% ~ 68%,每小時(shí)通風(fēng)次數(shù)≥15次,12 h光照明暗交替,飼養(yǎng)于杭州醫(yī)學(xué)院安全性評(píng)價(jià)研究中心屏障系統(tǒng)【SYXK(浙)2017-0010】。實(shí)驗(yàn)機(jī)構(gòu)通過(guò)國(guó)家GLP認(rèn)證和AAALAC認(rèn)證,實(shí)驗(yàn)遵循GLP原則。本研究方案獲得本機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(GLP-A-003)。

1.1.2 主要試劑與儀器

安兒寧顆粒(清膏),黃棕色膠狀物,3.1 g生藥/g清膏,批號(hào):20160201,金訶藏藥股份有限公司提供;人工牛黃,批號(hào):150731,青海九康中藥飲片有限公司生產(chǎn);臨用前,按處方量比例1 g安兒寧顆粒清膏加34.2 mg人工牛黃,配制成“安兒寧顆?！痹?用于高劑量組給藥,中、低劑量組受試物取“原液”按比例用純水配制成相應(yīng)的給藥濃度。唐古特烏頭提取清膏(3.57 g生藥/g,金訶藏藥股份有限公司,批號(hào):20160201),棕褐色粘稠液體,用純水配制成給藥濃度。

CA-1500全自動(dòng)血凝分析儀(Sysmex,日本);7100全自動(dòng)生化分析儀(Hitachi,日本);N-600尿液分析儀(長(zhǎng)春迪瑞);ADVIA2120全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(Bayer,德國(guó));IMS-972電解質(zhì)分析儀(深圳希萊恒);YZ6EI檢眼鏡(蘇州醫(yī)療器械廠)。

1.2 方法

1.2.1 單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)

幼年大鼠按體重隨機(jī)分為給藥組和溶媒對(duì)照組,每組20只,雌雄各半。給藥組大鼠灌胃給予安兒寧顆粒240 g生藥/kg體重,分2次(間隔4 h)給予最大適用濃度(每毫升4 g生藥)、最大給藥體積(30 mL/kg);溶媒對(duì)照組灌胃等體積純水。

觀察給藥后大鼠的一般反應(yīng)(外觀、行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、食欲、大小便及其顏色、皮毛、鼻、眼、口有無(wú)異常分泌物等)及死亡情況,死亡動(dòng)物及時(shí)尸檢,若肉眼觀察有病變臟器則進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。給藥后第1、2、3、4、7、9、11、15天稱體重;第15天所有大鼠剖檢,觀察主要臟器的大小、形態(tài)、顏色和質(zhì)地等。

1.2.2 重復(fù)給藥毒性實(shí)驗(yàn)

幼年大鼠按體重隨機(jī)分為溶媒對(duì)照組、唐古特烏頭組、安兒寧顆粒低、中、高劑量組,每組40只,雌雄各半,分別灌胃給予純水、唐古特烏頭5.5 g生藥/kg體重、安兒寧顆粒3 g/kg體重、11 g/kg體重和40 g/kg體重(按生藥計(jì)),給藥體積10 mL/kg,每天給藥1次,連續(xù)91 d,停藥后恢復(fù)觀察4周。

實(shí)驗(yàn)期間每天觀察大鼠的一般反應(yīng):外觀、行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、食欲、大小便及其顏色、皮毛、鼻、眼、口有無(wú)異常分泌物等,每周稱體重和攝食量1次;給藥前、給藥中期、停藥后1 d和恢復(fù)期結(jié)束檢測(cè)大鼠眼科和尿液指標(biāo)。在給藥中期(給藥45 d)、停藥次日和恢復(fù)期結(jié)束,每組分別隨機(jī)取10、20、10只大鼠(雌雄各半),進(jìn)行血液學(xué)(RBC、WBC、HGB、PLT、HCT、MCV、MCH、MCHC、MPV、RDW、#NEUT、%NEUT、#LYMPH、%LYMPH、#MONO、%MONO、#EOS、%EOS、#BASO、%BASO、#LUC、%LUC、#RETIC、%RETIC、MCVr、CHr、CHCMr)、血清生化學(xué)(含電解質(zhì))(AST、ALT、ALP、CK、LDH、BUN、Crea、T.P、ALB、GLU、T.BIL、T.CHO、TG、γ-GT、K+、Na+、Cl-、TCa)、凝血功能(PT、TT、Fbg、APTT)檢測(cè),心臟、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、腦、生殖器官(雄性為睪丸和附睪,雌性為卵巢和子宮)等主要臟器的稱重、大體觀剖檢和組織病理學(xué)檢查。綜合評(píng)估“安兒寧顆?！睂?duì)幼年大鼠的毒性情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

選用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,選用單因素方差(One-way ANOVA)進(jìn)行顯著性分析;計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)(χ2)進(jìn)行顯著性分析。顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)

溶媒對(duì)照組幼齡大鼠未見明顯異常反應(yīng);給藥組幼齡大鼠在給藥后約30 min陸續(xù)出現(xiàn)流涎、活動(dòng)減少、閉眼,至給藥后約3 h消失,同時(shí)出現(xiàn)著色尿、軟便、稀便、肛周污濁,給藥后48 h所有反應(yīng)基本消失,未出現(xiàn)死亡或?yàn)l死。給藥組大鼠體重隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)而增加,但增長(zhǎng)速度低于溶媒對(duì)照組(P< 0.01或P< 0.05),見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剖檢顯示,給藥組和溶媒對(duì)照組大鼠各臟器組織的外觀形態(tài)均未見明顯異常。以上反應(yīng)主要為短時(shí)間內(nèi)空腹給予高濃度、大體積中藥混懸液后的常見反應(yīng),不排除對(duì)大鼠體重增長(zhǎng)率有減緩影響。

圖1 單次經(jīng)口給予安兒寧顆粒對(duì)幼年大鼠體重的影響Note. Compared with the control group, *P < 0.05,**P < 0.01.Figure 1 Effects of single oral administrated AEN on body weight of juvenile SD rats

2.2 重復(fù)給藥毒性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 一般反應(yīng)、體重和攝食量

實(shí)驗(yàn)期間,各組大鼠外觀、行為和活動(dòng)等一般反應(yīng)均未見明顯異常,無(wú)死亡或?yàn)l死。安兒寧顆粒高劑量組大鼠給藥后第2周(♀)、第1 ~ 7周(♂)和13周(♂)體重均顯著低于溶媒對(duì)照組(P< 0.01或P< 0.05),其余各組大鼠的體重和溶媒對(duì)照組無(wú)明顯差異(見圖2)。安兒寧顆粒低劑量組大鼠給藥后第8、11、12周(♂)和第13周(♀)、中劑量組大鼠給藥后第8、11周(♂)和第2、11、12周(♀)、高劑量組大鼠給藥后第1 ~ 5、7、9、11 ~ 13周(♂)和第1 ~ 3、9、12 ~ 13周(♀)攝食量顯著低于溶媒對(duì)照組(P< 0.01或P< 0.05),其余各組大鼠的攝食量和溶媒對(duì)照組無(wú)明顯差異(見圖2)。唐古特烏頭組大鼠的攝食量和體重未見明顯影響。

圖2 重復(fù)經(jīng)口給予安兒寧顆粒對(duì)幼年大鼠體重和攝食量的影響Figure 2 Effects of repeated oral administrated AEN on body weight and food intake of juvenile SD rats

2.2.2 血液學(xué)

停藥次日,和對(duì)照組比,唐古特烏頭組、安兒寧顆粒低、中、高劑量組雄鼠的中性粒細(xì)胞數(shù)顯著升高(P< 0.01或P< 0.05),唐古特烏頭組、安兒寧顆粒低、高劑量組雄鼠的單核細(xì)胞數(shù)顯著升高(P< 0.01或P< 0.05),上述指標(biāo)至恢復(fù)期結(jié)束后均回歸正常,說(shuō)明是可逆的。另出現(xiàn)個(gè)別指標(biāo)波動(dòng),停藥次日:唐古特烏頭組雄鼠和安兒寧顆粒中劑量雌鼠的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、高劑量組雌鼠的淋巴細(xì)胞數(shù)(P< 0.01)有效幅度的降低,且無(wú)劑量相關(guān)性,結(jié)合實(shí)驗(yàn)室背景數(shù)據(jù),判斷其無(wú)毒理學(xué)意義(表1)。

表1 安兒寧顆粒對(duì)幼年大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響(停藥檢查階段)(x- ± s,n = 10)Table 1 Effects of AEN on hematology in juvenile SD rats(Drug withdrawal)(x- ± s,n = 10)

2.2.3 血清生化學(xué)

停藥檢查,唐古特烏頭組和安兒寧顆粒高劑量組雄鼠的血清白蛋白顯著高于溶媒對(duì)照組(P< 0.01或P< 0.05),停藥4周恢復(fù)正常,提示可能與唐古特烏頭給藥劑量有關(guān);停藥時(shí),安兒寧顆粒低、中、高劑量組雄鼠的AST、Na+、Cl-顯著低于溶媒對(duì)照組(P< 0.01或P< 0.05),呈一定的劑量反應(yīng)關(guān)系,停藥4周后均恢復(fù)正常,可能與給藥有關(guān);另停藥時(shí)高劑量雄鼠ALT和唐古特烏頭組雌鼠GLU小幅降低(P< 0.01),考慮為無(wú)毒理學(xué)意義(見表2)。

表2 安兒寧顆粒對(duì)幼年大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)的影響(停藥檢查階段)( ± s,n = 10)Table 2 Effects of AEN on serum biochemistry in juvenile SD rats(Drug withdrawal)( ± s,n = 10)

表2 安兒寧顆粒對(duì)幼年大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)的影響(停藥檢查階段)( ± s,n = 10)Table 2 Effects of AEN on serum biochemistry in juvenile SD rats(Drug withdrawal)( ± s,n = 10)

2.2.4 凝血功能

停藥時(shí)高劑量組雄鼠和安兒寧顆粒中、高劑量組雌鼠的APTT和TT均較溶媒對(duì)照組有小幅降低(P< 0.01或P< 0.05),但均在實(shí)驗(yàn)室背景數(shù)據(jù)范圍內(nèi),未表現(xiàn)明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系,綜合考慮其無(wú)毒理學(xué)意義。具體見表3。

表3 安兒寧顆粒對(duì)幼年大鼠凝血指標(biāo)的影響(停藥檢查階段)(x- ± s,n = 10)Table 3 Effects of AEN on coagulation index in juvenile SD rats(Drug withdrawal)(x- ± s,n = 10)

2.2.5 眼科和尿液檢查

各檢查階段中,唐古特烏頭和安兒寧顆粒各劑量組的眼科檢查和尿液檢查指標(biāo)均與對(duì)照組大鼠相似(P> 0.05),無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2.6 臟器重量和系數(shù)以及組織病理學(xué)檢查

停藥檢查時(shí)高劑量組雄鼠的肝、腎系數(shù)及雌鼠的肝、腎重量和系數(shù)均高于溶媒對(duì)照組(P< 0.01),但病理組織學(xué)檢查未見明顯病變,判斷為無(wú)毒理學(xué)意義的無(wú)規(guī)律個(gè)體差異。各組其他臟器的重量和系數(shù)均與相應(yīng)時(shí)間的對(duì)照組相似(P> 0.05)(見表4)。

表4 安兒寧顆粒對(duì)幼年大鼠臟器重量和臟器系數(shù)的影響(停藥檢查階段)(x- ± s,n = 10)Table 4 Effects of AEN on organ weight and coefficient in juvenile SD rats(Drug withdrawal)(x- ± s,n = 10)

各組大鼠各臟器的組織病理學(xué)檢查,均未出現(xiàn)與藥物有關(guān)的明顯的實(shí)質(zhì)性病變(見圖3)。

圖3 重復(fù)經(jīng)口給予安兒寧顆粒后幼年大鼠主要臟器的病理學(xué)圖片(停藥檢查階段)Figure 3 Histopathological images of main organs of juvenile SD rats after repeated oral administrated AEN (Drug withdrawal)

3 討論

兒童的各器官和系統(tǒng)處于發(fā)育過(guò)程中,其臟器結(jié)構(gòu)、生理功能與成人存在差別,可能會(huì)對(duì)藥物毒性或?qū)Χ拘缘哪褪艹潭犬a(chǎn)生不同的影響[14-16]。因此,需要采用幼年動(dòng)物的非臨床試驗(yàn)安全性數(shù)據(jù),以充分評(píng)估兒科藥物的臨床長(zhǎng)期使用安全性[17]。安兒寧顆粒作為藏醫(yī)經(jīng)典兒科用藥,方中多含藏醫(yī)特有藥材,其中唐古特烏頭為青藏高原特有毛茛科植物唐古特烏頭和船盔烏頭的干燥全草。傳統(tǒng)藏醫(yī)認(rèn)為唐古特烏頭無(wú)毒且具有清熱解毒功效,但現(xiàn)代有研究發(fā)現(xiàn)唐古特烏頭中的總生物堿對(duì)小鼠具有一定的心臟毒性[5],且由于唐古特烏頭不是內(nèi)地常用藥材,易被認(rèn)為屬于有大毒的烏頭類中藥(川烏、草烏等)。為明確安兒寧顆粒中唐古特烏頭的毒性,并充分評(píng)估安兒寧顆粒在臨床使用中對(duì)兒童患者的安全性,有必要開展安兒寧顆粒對(duì)幼年動(dòng)物的單次給藥毒性和重復(fù)給藥毒性實(shí)驗(yàn)。

據(jù)《兒科用藥非臨床安全性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》,幼齡動(dòng)物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)首選嚙齒類動(dòng)物[18],本研究采用傳統(tǒng)動(dòng)物品系SD大鼠。重復(fù)給藥毒性實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)SD大鼠的起始給藥年齡為3 ~ 4周,相當(dāng)于人類的兒童期(2 ~ 12歲),給藥結(jié)束年齡為16 ~ 17周,相當(dāng)于已成年,用以支持2歲兒童至成年的發(fā)育階段中藥物的毒性評(píng)價(jià)[19-20]。

據(jù)2020版《中華人民共和國(guó)藥典》記載,每1 g安兒寧顆粒含生藥材0.485 g,臨床用量為每次1.5 g(< 1歲),3 g/次(1 ~ 5歲),6 g/次(> 5歲),每日3次,兒童(按標(biāo)準(zhǔn)體重30 kg計(jì))臨床日用量為0.144 g生藥/ kg體重,按體表面積折算成幼年大鼠(按100 g體重計(jì))日用量為0.864 g生藥/ kg體重。本研究單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)的劑量為臨床日用量的277.8倍,重復(fù)給藥毒性實(shí)驗(yàn)低、中、高劑量分別為臨床日劑量的3.5、12.7、46.3倍;唐古特烏頭組劑量與安兒寧顆粒高劑量所含唐古特烏頭的劑量相同(臨床日劑量的46.3倍),以充分暴露安兒寧顆粒及唐古特烏頭的毒性。

本研究考慮成藥顆粒劑含有較多輔料成分,無(wú)法提高動(dòng)物實(shí)驗(yàn)給藥劑量,為了加大毒性暴露和保證給藥劑量的準(zhǔn)確性,故采用特制高濃度安兒寧顆粒(清膏)和人工牛黃臨用前按比例配制。研究結(jié)果顯示,幼年大鼠單次給予最大給藥量的安兒寧顆粒,體重隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)而增加,但增長(zhǎng)速率低于溶媒對(duì)照組;重復(fù)3個(gè)月給予安兒寧顆粒,一般觀察及凝血、尿液、眼科、組織病理學(xué)檢查等均未見明顯毒性反應(yīng),可見高劑量雄鼠攝食量小幅減少和體重增長(zhǎng)略有減緩,嗜中性粒細(xì)胞(%NEUT、# NEUT)和單核細(xì)胞數(shù)(%MONO、# MONO)、血清白蛋白(ALB)可逆性升高,天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、Na+、Cl-可逆性下降,上述變化偏離本實(shí)驗(yàn)室背景數(shù)據(jù)幅度較小,且停藥后基本恢復(fù)正常,組織病理學(xué)檢查也未見毒性靶器官。因此,安兒寧顆粒在幼年大鼠的單次給藥毒性和重復(fù)給藥毒性實(shí)驗(yàn)中,基本無(wú)顯著毒理學(xué)意義的反應(yīng),但由于均可見體重速率的減緩,提示臨床上患兒大劑量使用安兒寧顆?？赡軙?huì)有降低攝食和體重減輕的風(fēng)險(xiǎn)。綜合評(píng)價(jià),安兒寧顆粒的相對(duì)安全劑量為40.0 g生藥/kg體重,未觀察到有害作用(NOAEL)劑量為11.0 g生藥/kg體重。臨床上,兒童按每日最大服用量(18 g成品藥),3 ~ 5 d的臨床用藥療效安全。

值得注意的是,本研究中單次給藥毒性和重復(fù)給藥毒性實(shí)驗(yàn)古特烏頭生藥材的劑量分別為33 g/kg體重和5.5 g/kg體重,相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)體重兒童日服用唐古特烏頭生藥材156 g和26 g,是法定標(biāo)準(zhǔn)日服用量(0.6 ~ 1.2 g)[7]上限的120和20多倍。僅表現(xiàn)為重復(fù)給藥毒性實(shí)驗(yàn)中唐古特烏頭組嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)、血清白蛋白可逆性升高,未出現(xiàn)文獻(xiàn)中的毒性反應(yīng)[5]。考慮文獻(xiàn)中總生物堿采用乙醇提取得到,而安兒寧顆粒采用水提取工藝,經(jīng)加熱煎煮,有毒成分可能被降解,毒性顯著降低[7]。且有文獻(xiàn)指出雖然唐古特烏頭與有毒中藥烏頭均屬毛茛科烏頭屬植物,但其主要活性成分為內(nèi)酯型生物堿,基本無(wú)毒且具有清熱解毒功效,其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、藥理作用、安全性,與傳統(tǒng)中藥烏頭(川烏、草烏、雪上一枝蒿等)完全不同[7]。結(jié)合本研究結(jié)果,安兒寧顆粒中藏藥唐古特烏頭的臨床使用具有安全性。

本研究充分評(píng)估了安兒寧顆粒對(duì)幼年動(dòng)物的毒性反應(yīng),更進(jìn)一步論證其長(zhǎng)期使用的安全性,同時(shí)也為安兒寧顆粒用于兒童手足口病和哮喘等適應(yīng)癥提供一定的理論基礎(chǔ)。