芙樸感冒顆粒中橙皮苷小腸吸收特征研究

2022-03-12 11:15:26余蓓萌潘海滔徐人杰

實(shí)用藥物與臨床 2022年1期

余蓓萌，周萍，潘海滔，徐人杰*

0 引言

芙樸感冒顆粒的配方組成源于著名中醫(yī)學(xué)家吳士元，以中藥材木芙蓉葉(900 g)、牛蒡子(250 g)、厚樸(150 g)和陳皮(250 g)為原料，經(jīng)過提取加工制成，臨床用于治療風(fēng)熱或風(fēng)熱挾濕感冒引起的發(fā)熱頭痛、咽痛、肢體酸痛、鼻塞、胃納減退，為兒科常用藥[1-2]。橙皮苷(圖1)是芙樸感冒顆粒中最重要的糖苷類化合物之一，是陳皮的主要活性成分[3]。藥理研究表明，橙皮苷具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、提高免疫力、抗抑郁和解毒等作用[4-5]。

已有研究表明，橙皮苷的絕對(duì)生物利用度偏低，靜脈給藥后大鼠血漿中橙皮苷的濃度水平比口服后要高很多[6-7]?？诜侵兴帒?yīng)用的主要途徑，口服藥物首先在胃腸道中吸收[8]。小腸吸收障礙是影響外源性物質(zhì)生物利用度的重要因素。因此，探索橙皮苷的腸道吸收機(jī)制為研究其體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了關(guān)鍵信息。

本項(xiàng)研究的目的是探究橙皮苷的腸吸收特性并考察芙樸感冒顆粒對(duì)其吸收的影響。本實(shí)驗(yàn)采用的Caco-2細(xì)胞系，由于其形態(tài)和功能與人類小腸上皮相似而被廣泛使用，并且已經(jīng)被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)可作為模擬人體腸道吸收的模型[9]。本研究旨在通過體外Caco-2實(shí)驗(yàn)和大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)揭示橙皮苷的小腸吸收機(jī)制，并探究芙樸感冒顆粒對(duì)橙皮苷口服吸收的影響。

1 儀器和試藥

1.1 藥品與試劑 Transwell 轉(zhuǎn)運(yùn)小室(12孔,0.4 μm)；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶(Corning 公司，美國(guó))。橙皮苷、槲皮素、維拉帕米、MK571、吲哚美辛、苯溴馬隆、芹菜素、左旋肉堿和奎尼丁均由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。HBSS緩沖液購(gòu)于美國(guó)Corning 公司；二甲基亞楓(DMSO)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；芙樸感冒顆粒(批號(hào)：203033，浙江天一堂藥業(yè)有限公司)。MTT購(gòu)自白鯊生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；甲醇、乙腈均為色譜純；水為純化水；細(xì)胞Caco-2 細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，代數(shù)在35～50代。

1.2 儀器 Applied Biosystem 5500 QTRAP?hy-brid triple-quad LC/MS/MS(美國(guó)AB科學(xué)技術(shù)公司)；ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(美國(guó)安捷倫科技有限公司，50 mm×2.1 mm,1.8 μm)?？缒る娮鑳x(Millicell ERS system，Millipore，MA，美國(guó))。

1.3 動(dòng)物 Sprague-Dawley(SD)大鼠(210～230 g)由上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在恒定溫度(22～24 ℃)和濕度(55%～60%)條件下飼養(yǎng)。所有動(dòng)物程序均按照上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心指南和規(guī)章制度操作，并通過上海交通大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核。

2 方法

圖2 培養(yǎng)基樣品中橙皮苷和槲皮素的二級(jí)碎片離子圖

2.2 芙樸感冒顆粒溶液的配制與定量取裝量差異項(xiàng)下的芙樸感冒顆粒，研細(xì)并精密稱定粉末約1 g，至50 ml具塞錐形瓶中，精密加甲醇10 ml，超聲提取20 min，取出放冷，稱定重量，并用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，用0.22 μmol/L微孔濾膜過濾。采用高效液相色譜法測(cè)定芙樸感冒顆粒中橙皮苷含量(3.2±0.8)mg/g，在芙樸感冒顆粒甲醇溶液中為526.2 μmol/L。

2.3 對(duì)照品溶液的配制精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量，用DMSO 配制成濃溶液，實(shí)驗(yàn)前用HBSS緩沖液(用于Caco-2實(shí)驗(yàn))或甲醇(用于藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn))稀釋至所需藥物濃度，其中DMSO 最終濃度低于0.1%，4 ℃冷藏備用。

2.4 樣本處理取培養(yǎng)基或大鼠血漿樣品50 μl，加入10 ng/ml槲皮素甲醇內(nèi)標(biāo)溶液10 μl，渦旋混勻，加入400 μl甲醇，渦旋提取1 min。12 000 r/min離心10 min，吸取2 μl上清進(jìn)樣LC-MS/MS分析。

2.5 Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞毒性將Caco-2細(xì)胞保持在含有10%FBS(56 ℃滅活30 min)、1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺和1%鏈青霉素的DMEM中，實(shí)驗(yàn)溫度為37 ℃，實(shí)驗(yàn)環(huán)境包含95%空氣及5% CO2。培養(yǎng)基2～3 d更換一次。當(dāng)細(xì)胞單層達(dá)到80%融合后，用胰蛋白酶(0.5 mg/ml)和EDTA(0.2 mg/ml)分離傳代，細(xì)胞密度為5×104/ cm2。采用MTT法檢測(cè)橙皮苷的細(xì)胞毒性。胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Caco-2 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞密度接種到96孔培養(yǎng)板中，孵育24 h后，加入不同濃度的橙皮苷溶液或者芙樸感冒顆粒溶液(終濃度體系甲醇含量低于1%，含1 μmol/L橙皮苷)。之后，加入5 mg/ml MTT 20 μl孵育4 h后，再加入150 μl DMSO溶解。酶標(biāo)儀在490 nm吸光度處測(cè)量。使用沒有接種細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照，含有細(xì)胞但沒有樣品溶液的孔作為陰性對(duì)照。細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%，其中A為吸光度值。

2.6 轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn) 采用12 孔Transwell細(xì)胞小室，按1×105cells/ml的密度接種Caco-2細(xì)胞。對(duì)于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，使用Millicells ERS-2評(píng)估跨膜電阻(Transepithelial electrical resistance，TEER)，以反映細(xì)胞間連接的緊密性。單層接種后19～22 d即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中使用了TEER大于400 Ω/cm2的Caco-2細(xì)胞單層。

實(shí)驗(yàn)前，用HBSS將細(xì)胞單層培養(yǎng)基(pH 7.4)洗滌2次。將細(xì)胞培養(yǎng)板在新鮮的HBSS培養(yǎng)基中于37 ℃孵育30 min。將測(cè)試化合物添加到頂膜端(AP，0.5 ml)或底膜端(BL，1.5 ml)中，同時(shí)接收室中包含相應(yīng)體積的空白HBSS培養(yǎng)基。在37 ℃下以50 r/min搖動(dòng)孵育120 min。為了評(píng)估藥物從AP到BL的轉(zhuǎn)運(yùn)，在開始孵育后15、30、45、60、90和120 min，從BL或AP一側(cè)收集50 μl溶液，并補(bǔ)充等量的HBSS溶液。在實(shí)驗(yàn)前后進(jìn)行TEER測(cè)量以評(píng)估膜的完整性。取樣后立即將樣品冷凍，并在分析前保存在-80 ℃以下。

2.6.1 溫度對(duì)橙皮苷轉(zhuǎn)運(yùn)的影響擬在4 ℃和37 ℃條件下采用濃度為1 μmol/L的橙皮苷，研究其在Caco-2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)行為是否受溫度影響。

按照相關(guān)規(guī)則,按照稅法規(guī)定外國(guó)企業(yè)以及外國(guó)企業(yè)收入,相關(guān)企業(yè)包含三例:在資金、運(yùn)營(yíng)、購(gòu)銷等方面，存在直接或間接地操控或具有聯(lián)系;直接或間接地同為第三者所操控或具有;以及有其他利益上的相相聯(lián)系。

2.6.2 pH值對(duì)橙皮苷轉(zhuǎn)運(yùn)的影響在HBSS緩沖液中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，該緩沖液根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)節(jié)至頂膜側(cè)的pH值為6.0或7.4(0.5 ml)，基底膜側(cè)的pH值為7.4(1.5 ml)。

2.6.3 幾種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)橙皮苷轉(zhuǎn)運(yùn)的影響將幾種抑制劑分別預(yù)處理轉(zhuǎn)運(yùn)體系30 min，包括P-糖蛋白(p-gp)抑制劑維拉帕米(100 μmol/L)、多耐藥蛋白(MRPs)抑制劑MK571(100 μmol/L)、苯溴馬隆(MRP3，50 μmol/L)和吲哚美辛(MRP2，200 μmol/L)及乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)抑制劑芹菜素(25 μmol/L)；通過添加釩酸鈉(50 μmol/L)和西咪替丁(50 μmol/L)評(píng)估Na/K-ATPase的選擇性；加入左旋肉堿(100 μmol/L)或奎尼丁(100 μmol/L)用以評(píng)估有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體OCTN1或OCTN2蛋白對(duì)橙皮苷吸收的影響。

2.7 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前，大鼠被隨機(jī)分為2組(每組6只大鼠)，灌胃口服橙皮苷混懸液5.76 mg/kg或芙樸感冒顆粒溶液1.8 g/kg(臨床等效量，約含5.76 mg/kg橙皮苷)。其中橙皮苷溶于0.5%CMC-Na中配置成混懸液用于口服。在給藥后24 h內(nèi)采血，收集全血150 μl，以3 000 r/min離心10 min，將50 μl血漿樣品于-80 ℃保存。

2.8 數(shù)據(jù)處理表觀滲透系數(shù)(Apparent permeability，Papp) 值和外排率(Efflux ratio，ER) 值。Papp=(dQ/dt)/(A·C0)，ER=PappBA/ PappAB。公式中 A 為Transwell小室的有效面積，dQ/dt為轉(zhuǎn)運(yùn)速率，C0為藥物的初始濃度，PappBA為由BL至AP側(cè)的Papp值，PappAB為由AP至BL側(cè)的Papp值。ER > 1.5提示可能存在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，ER < 1.5提示以被動(dòng)擴(kuò)散為主[10]。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞毒試驗(yàn) 如表1所示，橙皮苷濃度小于100 μmol/L時(shí)對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率小于10%，表明低于100 μmol/L的橙皮苷對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)未產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性，因此，選取100、10、1 μmol/L作為轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中橙皮苷的終濃度。同時(shí)，濃度為0.19 mg/ml芙樸感冒顆粒溶液(含1 μmol/L橙皮苷)對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)無抑制作用，證明該濃度芙樸感冒顆粒溶液可用于Caco-2轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度橙皮苷對(duì)Caco-2細(xì)胞的抑制率(n=33)

3.2 橙皮苷的含量測(cè)定橙皮苷和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為1.74 min和2.18 min。代表性色譜圖見圖3，顯示了橙皮苷和內(nèi)標(biāo)的基線分離，而不受內(nèi)源性成分的干擾。橙皮苷在培養(yǎng)基及大鼠血漿中的校準(zhǔn)曲線方程為y=0.050 7x+0.356(R2=0.991 4)及y=0.051 6x+0.235 7(R2=0.991 4)，其中y表示橙皮苷峰面積與槲皮素峰面積的比率(x為培養(yǎng)基中的橙皮苷濃度，R為相關(guān)系數(shù))。該測(cè)定方法的定量下限為0.5 ng/ml，線性范圍0.5～200 ng/ml。橙皮苷在2種基質(zhì)中的定量實(shí)驗(yàn)均通過專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、提取回收率、穩(wěn)定性和線性等方法學(xué)考察，結(jié)果可靠。

圖3 樣品質(zhì)譜圖

3.3 濃度和時(shí)間對(duì)橙皮苷轉(zhuǎn)運(yùn)的影響在2個(gè)方向上研究了濃度分別為1、10、100 μmol/L的橙皮苷的轉(zhuǎn)運(yùn)，并估計(jì)了橙皮苷的滲透性(圖4)。根據(jù)圖4數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，橙皮苷的Papp為1.20×10-6～1.30×10-6cm/s(AP～BL)和2.23×10-6～2.81×10-6cm/s(BL～AP)。Papp值結(jié)果表明，橙皮苷屬于中等吸收的化合物。在3個(gè)濃度下繪制了0～120 min Caco-2細(xì)胞單層中橙皮苷的濃度-時(shí)間圖，橙皮苷在檢測(cè)時(shí)間段內(nèi)隨時(shí)間呈線性增長(zhǎng)。

圖4 不同濃度下橙皮苷在Caco-2細(xì)胞中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(n=33)

3.4 pH值和溫度對(duì)Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)橙皮苷的影響如圖5所示，橙皮苷在pH=7.4時(shí)的PappAB值明顯高于pH=6時(shí)的PappAB值(P<0.05)，提示高pH(7.4)時(shí)穿過細(xì)胞單層的橙皮苷轉(zhuǎn)運(yùn)要比低pH(6.0)時(shí)更容易，原因可能是在橙皮苷轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，pH=6.0時(shí)，某些外排蛋白如BCRP活性被激活，導(dǎo)致藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)效率降低[11]。溫度降低會(huì)降低細(xì)胞的新陳代謝[12]，低溫(4 ℃)孵育顯著降低了橙皮苷轉(zhuǎn)運(yùn)效率，使PappAB從1.23×10-6cm/s降低到0.58×10-6cm/s。

圖5 不同pH和溫度時(shí)橙皮苷 (1 μmol/L) 在Caco-2細(xì)胞中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(n=33,P<0.05)

3.5 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑對(duì)跨細(xì)胞橙皮苷轉(zhuǎn)運(yùn)的影響如表2所示，在用西咪替丁或釩酸鈉預(yù)處理后，Papp值無顯著影響。P-gp被認(rèn)為是影響藥物在腸道中運(yùn)輸?shù)闹饕馀诺鞍字?。P-gp抑制劑維拉帕米可能會(huì)顯著增加某些化合物從AP到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)。在維拉帕米預(yù)處理的情況下，橙皮苷的PappAB幾乎是對(duì)照組的6.75倍，同時(shí)ER從2.19降至0.31，這提示P-gp可以影響橙皮苷的轉(zhuǎn)運(yùn)。除P-gp外，MRP和BCRP也是三磷酸腺苷超家族的成員，與藥物的吸收和代謝過程密切相關(guān)。在以3種MRP抑制劑(MK571、苯溴馬隆和吲哚美辛)預(yù)處理的情況下，橙皮苷的PappAB與對(duì)照組相比沒有顯著性差異，這說明橙皮苷并不是MRP的底物。另一方面，在通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OCTN1抑制劑預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)，橙皮苷的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)并沒有明顯變化，說明OCTN1對(duì)橙皮苷的轉(zhuǎn)運(yùn)影響甚微。同時(shí)，推測(cè)橙皮苷并非為攝入型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OCTN2 的底物，OCTN2屬于有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不需要消耗ATP，而是依賴藥物離子表面的離子電荷實(shí)現(xiàn)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)，以被動(dòng)擴(kuò)散中的協(xié)助擴(kuò)散的方式攝入細(xì)胞。

表2 橙皮苷在Caco-2細(xì)胞上轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)果(n=33)

橙皮苷是BCRP的底物。在芹菜素預(yù)處理的情況下，橙皮苷的PappAB顯著升高，約為對(duì)照組的2.46倍，使PappAB從1.26×10-6cm/s增加至3.71×10-6cm/s。加入芙樸感冒顆粒處理液后，橙皮苷的PappAB顯著升高，證明芙樸感冒顆粒中其他成分可能影響了橙皮苷的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)了其小腸吸收。

3.6 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究大鼠口服橙皮苷或芙樸感冒顆粒溶液后血漿濃度與時(shí)間的關(guān)系曲線如圖6所示。主要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如表3所示，芙樸感冒顆粒組中橙皮苷的Cmax為單體組的121.54%?？诜o藥后，兩組橙皮苷均被迅速吸收并達(dá)峰值。兩組橙皮苷的血漿暴露量(AUC0-t和AUC0-∞)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但MRT和t1/2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明芙樸感冒顆粒片中其他成分主要影響橙皮苷的吸收，對(duì)其消除沒有明顯作用。這個(gè)結(jié)果可以與Caco-2實(shí)驗(yàn)中芙樸感冒顆粒影響橙皮苷小腸吸收這一結(jié)果吻合。

圖6 兩組大鼠口服橙皮苷或芙樸感冒顆粒溶液后體內(nèi)橙皮苷的平均血藥濃度-時(shí)間曲線(n=36)

4 討論

一般認(rèn)為，Papp值小于1×10-6cm/s的化合物被認(rèn)為吸收率低(<30%)，Papp值在1×10-6～1×10-5cm/s的化合物被認(rèn)為具有中等吸收(30%～60%)，而Papp值大于1×10-5cm/s的被認(rèn)為具有高吸收(>70%)[13]。橙皮苷Papp值的這些結(jié)果表明了其在腸道中吸收一般。橙皮苷屬于吸收中等化合物，結(jié)合文獻(xiàn)，其滲透性與口服生物利用度并不完全一致。

表3 兩組大鼠血漿中橙皮苷的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6)

Caco-2試驗(yàn)的結(jié)果顯示，橙皮苷吸收的ER值> 1.5，同時(shí)，抑制劑的試驗(yàn)結(jié)果表明，其存在外排蛋白參與的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。P-gp 是ATP依賴型外向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬ATP 結(jié)合盒 (ATP binding cassette,ABC)超家族，由2個(gè)重復(fù)分子組成，每一分子包括6個(gè)跨膜的極度疏水區(qū)和1個(gè)包含高度保守的ATP 結(jié)合域親水區(qū)。P-gp 主要定位在小腸黏膜上皮細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的刷狀緣、肝小管和腎近曲小管的管腔面以及腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與藥物的吸收，臨床上很多藥物為P-gp的誘導(dǎo)劑或抑制劑[14]。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)橙皮苷為P-gp的底物，這為進(jìn)一步研究橙皮苷臨床應(yīng)用及藥物相互作用提供了前期基礎(chǔ)。除P-gp 外,MRP2、BCRP 等外排型轉(zhuǎn)運(yùn)體在腸道上皮細(xì)胞的頂膜側(cè)都有所表達(dá),它們?cè)趯⒌孜锓置谥涟庵邪l(fā)揮重要作用[15]。

藥物口服以后，首先在胃腸道被吸收，因此，腸道吸收能力的強(qiáng)弱直接影響到化合物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為尤其是其吸收相特征。除了腸道吸收障礙外，肝臟代謝也是導(dǎo)致口服生物利用度低的一個(gè)重要原因。