王夢(mèng)汝 顧嘉怡 王雅欣 李正軍

(北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 北京 100029)

引 言

海神單胞菌屬(Neptunomonas)最初由Hedlund等[1]于1999年定名，代表菌株是從被雜酚油污染的港口沉積物中分離出的食萘海神單胞菌N.naphthovoransNAG- 2N- 126，其具有降解多環(huán)芳烴的能力。海神單胞菌屬為革蘭氏陰性，桿狀，有鞭毛，氧化酶和過(guò)氧化氫酶呈陽(yáng)性[2]。迄今為止，共有8個(gè)海神單胞菌屬菌種被發(fā)現(xiàn)和鑒定，分別為N.naphthovorans[1]、N.concharum[3]、N.japonica[4]、N.acidivorans[5]、N.antarctica[6]、N.qingdaonensis[7]、N.marina[8]和N.phycophila[9]，其中6個(gè)菌種已經(jīng)完成全基因組測(cè)序[2,4,7-10]。

芳香族化合物是分子中至少含有一個(gè)離域鍵的環(huán)狀化合物，如苯、萘、蒽、菲及其衍生物等。芳香族化合物的結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定、不易分解，且普遍存在“三致效應(yīng)”，在環(huán)境中的殘留物質(zhì)進(jìn)入食物鏈會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生一定的危害[11]。海神單胞菌屬的部分菌株可以降解多環(huán)芳烴，可能在去除海洋和土壤等環(huán)境中的芳香族化合物污染物方面發(fā)揮一定作用。Li等[12-13]研究了食萘海神單胞菌對(duì)菲的降解，發(fā)現(xiàn)添加表面活性劑能夠在一定程度上提高菲在培養(yǎng)基中的可溶性，由此提高菲的生物可利用性和菌株對(duì)菲的降解速度。目前僅有極少數(shù)研究者關(guān)注到海神單胞菌對(duì)多環(huán)芳烴的降解，缺少關(guān)于其代謝途徑、關(guān)鍵降解酶和降解機(jī)理等方面的研究。

聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate，PHA)是微生物生長(zhǎng)代謝不平衡時(shí)在細(xì)胞內(nèi)合成的一種儲(chǔ)能用高分子生物材料。PHA具有生物相容性、生物可降解性和生物可再生性等優(yōu)良特性，在包裝材料與組織工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前PHA的生產(chǎn)成本高于石油來(lái)源的不可降解塑料，限制了其大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用開(kāi)發(fā)。研究新型的PHA生產(chǎn)菌種，開(kāi)發(fā)低成本的生產(chǎn)工藝日益受到學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的關(guān)注。在海神單胞菌中，N.antarcticaS3- 22能夠以果糖為碳源合成聚-3-羥基丁酸酯(polyhydroxybutyrate，PHB)，但該菌株的最適生長(zhǎng)溫度為15 ℃左右，發(fā)酵成本高，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[14]。另一種海神單胞菌N.concharumJCM17730的最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃，對(duì)乙酸和丁酸具有較好的利用能力，能夠以高濃度丁酸為底物進(jìn)行不滅菌發(fā)酵合成PHB，產(chǎn)量超過(guò)15 g/L[15]?？紤]到乙酸和丁酸等短鏈揮發(fā)性脂肪酸可利用生物質(zhì)資源或通過(guò)合成氣發(fā)酵獲得[16]，其作為發(fā)酵碳源替代傳統(tǒng)的葡萄糖等淀粉基底物來(lái)生產(chǎn)PHA具有良好的應(yīng)用前景。

目前，關(guān)于海神單胞菌在芳香族化合物降解和聚羥基脂肪酸酯生產(chǎn)方面的研究還處于起步階段，尚需進(jìn)一步深入探索。本文對(duì)海神單胞菌屬中6個(gè)已測(cè)序菌種的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，重點(diǎn)研究了芳香族化合物降解和聚羥基脂肪酸酯代謝途徑的關(guān)鍵酶基因在這些菌種中的分布情況，為將來(lái)海神單胞菌能夠利用廉價(jià)底物高效生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯以及開(kāi)發(fā)能夠應(yīng)用于環(huán)境治理的微生物制劑提供參考。

1 分析方法

1.1 序列來(lái)源

海神單胞菌屬的基因組信息來(lái)自NCBI (National Center for Biotechnology Information)(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索目標(biāo)菌株的全基因組信息并下載，獲得相關(guān)菌種的基因組數(shù)據(jù)，使用軟件SnapGene(版本4.3.6)[17]對(duì)其保存和分析。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索海神單胞菌屬相關(guān)菌種的16S rRNA序列并下載，利用軟件MEGA(版本7.0)對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分析，使用Neighbor-Joining法對(duì)16S rRNA序列構(gòu)建相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[18]。

1.3 基因組平均核苷酸一致性分析

利用工具EzGenome(http:∥www.ezbiocloud. net/ezgenome/ani)分析海神單胞菌相關(guān)菌種的全基因組序列信息的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity, ANI)[19]。

1.4 代謝途徑關(guān)鍵基因分析

海神單胞菌屬中可能的碳源代謝、芳香族化合物代謝及聚羥基脂肪酸酯代謝的路徑如圖1所示。利用SnapGene軟件和NCBI網(wǎng)站的Blast功能，分析代謝途徑中關(guān)鍵酶的編碼基因在海神單胞菌屬各菌種基因組中的分布情況。

圖1 海神單胞菌屬中可能的代謝通路Fig.1 The possible metabolic pathways in the Neptunomonas genus

1.4.1碳源代謝途徑

碳源代謝是微生物的主要產(chǎn)能途徑。本文分析的碳源代謝途徑包括糖酵解途徑(glycolytic pathway)、Entner-Doudoroff(ED)途徑、磷酸戊糖途徑、乙酸利用和丙酮酸代謝途徑等。相關(guān)酶包括6-磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)、磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase)、磷酸甘油酸變位酶(phosphoglycerate mutase)、乙酸激酶(acetate kinase)和丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase)等。

1.4.2芳香族化合物降解途徑

芳香族化合物在有氧條件下的生物降解一般經(jīng)過(guò)鄰苯二酚或其衍生物，再開(kāi)環(huán)形成直鏈分子進(jìn)入中心代謝途徑分解。相關(guān)酶主要包括苯酚羥化酶(phenol hydroxylase)、2-辛烷基-6-甲氧基苯酚羥化酶(2-octaprenyl-6-methoxyphenol hydroxylase)、4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxy-genase)、鄰苯二酚2,3-雙加氧酶(catechol dioxyge-nase)、4-羧基黏糠酸內(nèi)酯脫羧酶(4-carboxymuconolactone decarboxylase)、羧基黏糠酸內(nèi)酯脫羧酶(carboxymuconolactone decarboxylase)、4-草酰乙酸脫羧酶(4-oxaloacetate decarboxylase)、4-草酰巴豆酸酯互變異構(gòu)酶(4-oxalocrotonate tautomerase)等。

1.4.3聚羥基脂肪酸酯代謝途徑

聚羥基脂肪酸酯代謝的關(guān)鍵酶是PHA合成酶(PHA synthase)和PHA降解酶(PHA depolymerase)，前者催化酯酰輔酶A單體的聚合，后者催化PHA的胞內(nèi)分解再利用。

2 結(jié)果與討論

2.1 海神單胞菌屬的基本特征和基因組測(cè)序分析

在目前已發(fā)現(xiàn)和鑒定的8個(gè)海神單胞菌屬菌種中，N.qingdaonensis為好氧菌，其余均為兼性厭氧菌；多數(shù)菌種的最適生長(zhǎng)溫度為20～30 ℃，有的菌種具有在細(xì)胞內(nèi)積累聚-3-羥基丁酸酯的能力(表1)。不同菌種之間生長(zhǎng)溫度和需氧情況的差異可能與其長(zhǎng)期的生存環(huán)境和生活習(xí)性有關(guān)。

表1 海神單胞菌屬的表型特征

+表示陽(yáng)性，ND表示參考文獻(xiàn)中沒(méi)有相關(guān)數(shù)據(jù)，生長(zhǎng)條件項(xiàng)下括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示最適生長(zhǎng)條件，基因組測(cè)序時(shí)間均從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得。

海神單胞菌屬的6個(gè)菌種已經(jīng)有公開(kāi)的基因組序列。N.phycophila包括3個(gè)菌株，N.marina包含1個(gè)菌株，其余4個(gè)菌種(N.concharum、N.japonica、N.qingdaonensis和N.antarctica)均包含2個(gè)菌株。本文對(duì)其中的11個(gè)菌株的基因組序列進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。可以看出，這些菌株的基因組大小差距較大：N.antarcticaDSM22306的基因組最大，為4 569 005 bp；N.concharumJCM17730的基因組最小，為3 561 992 bp?；蚪MGC含量在43.7%～50.5%(摩爾分?jǐn)?shù))之間。對(duì)已測(cè)序的海神單胞菌的全基因組序列進(jìn)行平均核苷酸一致性分析，結(jié)果如表3所示。海神單胞菌屬各個(gè)菌種之間的平均核苷酸一致性均在69%以上，同一菌種不同菌株的平均核苷酸一致性均在90%以上?；蚪M大小的差異暗示了海神單胞菌屬不同菌株在基因功能上可能存在差別。對(duì)基因組最小的N.concharum和較大的N.qingdaonensisP10- 2- 4、N.antarcticaS3- 22進(jìn)行特有基因分析，結(jié)果如表4所示。發(fā)現(xiàn)N.qingdaonensis和N.antarctica在氨基酸、糖類和脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜合成以及信號(hào)傳遞等方面的特有基因較多。

表2 海神單胞菌屬的基因組概況

表3 海神單胞菌屬基因組平均核苷酸一致性分析

表4 海神單胞菌屬3個(gè)菌種特有基因的同源蛋白簇(COG)功能分類

2.2 海神單胞菌屬的系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)海神單胞菌屬已經(jīng)鑒定的8個(gè)菌種的模式菌株的16S rRNA序列和作為外群的大腸桿菌(Escherichiacoli)的16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖2所示。在海神單胞菌屬內(nèi)，N.qingdaonensis、N.japonica和N.antarctica的親緣關(guān)系較近，N.acidivorans和N.phycophila的親緣關(guān)系較近，而N.marina和同一屬內(nèi)其他菌種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。由16S rRNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)得到的親緣關(guān)系結(jié)論與基因組平均核苷酸一致性的分析結(jié)果類似。

大腸桿菌ATCC 11775 (X80725)用作外群；括號(hào)中給出GenBank登錄號(hào)；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中樹(shù)枝節(jié)點(diǎn)處的數(shù)字代表重復(fù)1 000次計(jì)算得到的自展值；標(biāo)尺0.02表示每個(gè)位點(diǎn)的核苷酸取代數(shù)。下同。圖2 海神單胞菌屬的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 A 16S rRNA-based phylogenetic tree of the Neptunomonas genus

2.3 海神單胞菌屬代謝途徑關(guān)鍵酶基因分析

2.3.1碳源代謝相關(guān)基因

基于基因組測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)海神單胞菌屬各代表菌株的碳源代謝途徑相關(guān)基因進(jìn)行分析，糖酵解途徑、Entner-Doudoroff途徑、磷酸戊糖途徑、乙酸和丙酮酸代謝途徑的部分關(guān)鍵酶的基因座位如表5所示。海神單胞菌屬中，已測(cè)序的菌種都含有糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，包括丙酮酸激酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、磷酸甘油酸激酶和磷酸甘油酸變位酶等(圖1)，表明糖酵解途徑在海神單胞菌屬中普遍存在。但是，部分海神單胞菌的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)不完整，例如N.concharumJCM17730和N.japonicaJAMM 1380僅有PtsH蛋白，缺少細(xì)胞膜上運(yùn)輸葡萄糖的PtsG蛋白，提示它們不具有利用葡萄糖的能力。根據(jù)基因組測(cè)序數(shù)據(jù)可知，磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、Entner-Doudoroff途徑的關(guān)鍵酶磷酸葡萄糖酸脫水酶只在N.antaraticaS3- 22和N.phycophilaScap09中被發(fā)現(xiàn)。另外，基因組分析表明，海神單胞菌普遍缺少木糖轉(zhuǎn)運(yùn)和利用的關(guān)鍵基因，表明海神單胞菌屬的糖代謝普遍不活躍。

乙酸代謝途徑的關(guān)鍵酶乙酸激酶和丙酮酸代謝途徑的丙酮酸脫氫酶在已測(cè)序的菌種中也都有發(fā)現(xiàn)，提示海神單胞菌屬具有利用乙酸的能力。細(xì)菌以乙酸為唯一碳源時(shí)，一方面通過(guò)三羧酸循環(huán)將乙酰輔酶A徹底氧化以提供能量，另一方面啟動(dòng)乙醛酸循環(huán)合成琥珀酸等中間體用于生物合成反應(yīng)，基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)了乙醛酸循環(huán)相關(guān)的異檸檬酸裂解酶和蘋(píng)果酸合成酶的存在。此外，丙酸代謝相關(guān)的丙酰輔酶A合成酶也普遍存在，且有多個(gè)拷貝。

表5 海神單胞菌屬中碳源代謝相關(guān)酶的基因座位

2.3.2芳香族化合物代謝相關(guān)基因

基于基因組測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)海神單胞菌屬各代表菌株的芳香族化合物代謝途徑相關(guān)基因進(jìn)行分析，其中涉及的部分關(guān)鍵酶的基因座位如表6所示。海神單胞菌屬普遍含有苯、苯酚、苯甲酸的降解途徑，與大多數(shù)細(xì)菌一樣采用雙加氧酶進(jìn)行多環(huán)芳烴的降解，而真菌往往采用單加氧酶進(jìn)行降解。苯和苯酚通過(guò)苯酚羥化酶催化生成鄰苯二酚[20]，該酶在兩個(gè)菌種N.concharumJCM17730和N.japonicaJAMM 1380中存在。苯甲酸由苯甲酸雙加氧酶催化生成鄰苯二酚，但該酶只在菌種N.phycophilaScap09中被發(fā)現(xiàn)。

表6 海神單胞菌屬中芳香化合物降解相關(guān)酶的基因座位

鄰苯二酚有兩條降解途徑：鄰位降解和間位降解。鄰位降解是將鄰苯二酚轉(zhuǎn)化為3-酮己二酸，再與輔酶A縮合，分解為琥珀酸和乙酰輔酶A，進(jìn)入三羧酸循環(huán)被徹底氧化，涉及的酶包括鄰苯二酚1,2-雙加氧酶、黏糠酸環(huán)異構(gòu)酶、黏糠酸內(nèi)酯異構(gòu)酶等，該途徑關(guān)鍵酶的編碼基因只在N.phycophilaScap09中被發(fā)現(xiàn)。間位降解是將鄰苯二酚降解為丙酮酸和乙酰輔酶A，進(jìn)入三羧酸循環(huán)氧化分解，其中涉及的酶有鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶、4-草酰乙酸脫羧酶、4-草酰巴豆酸酯互變異構(gòu)酶等(圖1)。在大部分海神單胞菌屬的菌種中能找到間位降解途徑所涉及到的酶，例如N.concharumJCM17730和N.japonicaJAMM 1380都有完整的將苯酚降解為丙酮酸和乙酰輔酶A的間位降解代謝途徑，但缺少鄰位降解途徑。目前，已報(bào)道的好氧條件下降解多環(huán)芳烴的菌屬超過(guò)100個(gè)，研究主要集中在Pseudomonas、Sphingomonas、Burkholderia、Mycobacterium和Rhodococcus等少數(shù)幾個(gè)菌屬，降解途徑中關(guān)鍵酶如多環(huán)芳烴羥基化雙加氧酶、鄰苯二酚雙加氧酶等也有結(jié)構(gòu)解析[21]。但是，對(duì)于包括海神單胞菌在內(nèi)的其他菌屬的報(bào)道較少，因此還需深入研究不同菌屬對(duì)芳香族化合物的降解途徑、降解機(jī)理以及在自然條件下菌群遷移轉(zhuǎn)化和協(xié)同作用等。

2.3.3聚羥基脂肪酸酯代謝相關(guān)基因

碳源可通過(guò)多種代謝途徑轉(zhuǎn)化為羥基脂酰輔酶A單體，由PHA合成酶催化聚合得到PHA[22-23]。PHA合成酶是PHA生物合成途徑中最為關(guān)鍵的酶，其底物特異性決定了脂酰輔酶A單體的類型，也是控制PHA聚合物單體組成和分子量的關(guān)鍵因素[22]。微生物在碳源缺乏時(shí)，PHA降解酶催化細(xì)胞內(nèi)積累的PHA分解再利用。本文對(duì)海神單胞菌屬各代表菌株的PHA合成酶和PHA降解酶的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，相關(guān)基因座位見(jiàn)表7。對(duì)PHA合成酶序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。由表7可以看出，海神單胞菌屬的全部菌種均含有2～3個(gè)PHA合成酶，并且在基因組上分散排布；海神單胞菌屬普遍含有PHA降解酶基因，表明其具有對(duì)PHA降解再利用的能力。

表7 海神單胞菌屬中聚羥基脂肪酸酯代謝相關(guān)酶的基因座位

圖3 海神單胞菌屬的PHA合成酶及其他代表性PHA合成酶的發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of the PHA synthases from the Neptunomonas genus and other representative strains

PHA合成酶根據(jù)結(jié)構(gòu)、亞基組成和底物特異性，可分為4種類型。其中，Ⅰ型合成酶由一個(gè)亞基組成，Ⅱ型合成酶是包含2個(gè)亞基的異源二聚體[24]。在一些PHA合成菌株中，PHA合成酶與代謝途徑中的其他基因緊密相連。例如，羅氏真養(yǎng)菌H16(RalstoniaeutrophaH16)中PHA聚合酶與硫解酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶的基因組成一個(gè)操縱子，紫色色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)中PHA聚合酶與硫解酶的基因組成一個(gè)操縱子。由圖3發(fā)現(xiàn)3個(gè)PHA合成酶中2個(gè)為Ⅰ型、1個(gè)為Ⅲ型，Ⅲ型合成酶PhaC和PhaE的基因在基因組中前后相連。海神單胞菌中PHA合成酶的分布情況與海生桿菌屬(Marinobacterium)[25]較為相似，兩個(gè)菌屬同為海洋螺菌科，具有較近的親緣關(guān)系。

3 結(jié)論

本文對(duì)海神單胞菌屬已鑒定的6個(gè)菌種的特征進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié)，并對(duì)其基因組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)海神單胞菌屬的菌種普遍具有降解芳香族化合物的相關(guān)基因，理論上可將苯、苯酚和苯甲酸等通過(guò)以鄰苯二酚為中間體的間位降解途徑進(jìn)行分解，可在降解芳香族化合物方面發(fā)揮作用。另外，海神單胞菌屬具有完整的糖酵解和乙酸利用途徑；普遍含有聚羥基脂肪酸酯的合成酶和降解酶基因，表明其具有潛在的合成聚羥基脂肪酸酯的能力。相關(guān)分析結(jié)果可以為海神單胞菌屬的進(jìn)一步代謝工程改造用于生產(chǎn)PHA提供參考。